专利名称：小豹斑鹅膏菌丝体快速繁殖的方法
技术领域：
本发明涉及一种野生毒菌小豹斑鹅膏菌丝体室内快速培养的方法，属于生物技术领域，具体地说是属于有毒大型真菌室内培养范畴。
背景技术：
鹅膏菌属―)隶属于担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、鹅膏菌科 teceae)，是有毒的大型真菌中较特殊、较有价值的一个世界性广布大属,其物种多
样性是非常丰富的。全球已报道近400种，中国已记录的近100种(含亚种、变种及变型)。据考证，目前中国仍有不少种尚未研究和命名。但是如今随着全球生态危机的出现，我国的 许多大型真菌资源已告危，处于严重衰退及濒危状态，而部份种面临着可能还没有被人类认识或发现其价值时，就已灭绝的风险。鹅膏菌属中的大部份种属于著名剧毒菌，据知，因误食野生蕈菌中毒死亡者95%是因鹅膏菌所致。科学家们对鹅膏菌真正感兴趣的是其毒性，因此，大约在140年前，人们就开始了鹅膏菌毒素的研究。鹅膏菌毒素可分为四类，其中最主要也是最重要的是肽类毒素，肽类毒素又包括鹅膏毒肽(amatoxins)、鬼笔毒肽(phallotoxins)和毒伞素类(virotoxins)三种。目前鹅膏毒素的应用研究主要体现在以下几方面①可用于研究真核生物基因的表达、调控及细胞定位(amatoxins对真核生物RNA聚合酶II的活性有专一性抑制作用)；②可开发抗菌、抗病毒特效新药；③可筛选抗肿瘤药物；④可开发镇静、麻醉及其它特效药；⑤可用于生物防冶。鹅膏菌属大多属于外生菌根真菌，目前尚不能人工栽培。其绝大部份种仍属于自然界中难培养或未能培养的微生物，难以人工、半人工栽培，难以开发利用。虽然已有少数的种能进行菌丝的纯培养，但也存在一些问题，如菌丝生长缓慢、菌丝中毒素含量不高。鹅膏多肽毒素是一种由7-8个被修饰了的稀有氨基酸组成的环肽，可能不是基因编码的直接产物，而是经过加工后的次级产物，要克隆毒素的基因是复杂而困难的，且其化学合成品也没有活性。因此，至今国内外还没有一种能规模化开发的毒素产品。现作为生化试剂的肽类毒素全部来源于欧美的毒鹅膏(Amanita phalloides)子实体，销价在每克10万美元以上。鹅膏种群小，个体少，产量低，分布数量极其有限。加之对生境敏感，一旦生境受到破坏，极易消失或灭绝，属于特殊的致危生物类群，这更增加了其进一步被研究、利用的难度。我国的毒蕈资源，在宋代陈仁玉的菌谱就有了记载，比西方最早的同类研究专著早数百年，可惜由于我们对其研究、保护不够重视，如今当我们要进一步利用、开发它时，面临的却是资源枯竭的危险。面对这些资源的悄然消失，我们还没有被引起重视，我们还不积极采取各种措施来进行挽救，那这种损失将是无法弥补的。鹅膏的人工驯化或栽培是保证鹅膏资源可持续性利用的前提或关键，但此目前仍然属于难以攻克的问题及盲点，其中菌丝难以诱导，菌丝生长非常缓慢是制约及影响人工培养的重要环节或因素。
小豹斑鹅膏(A. . parvipantherina)属于渐危种，其种群分布及毒性具有代表性或共性，如以此作为研究对象，研究结果将对其它种群具有较好的借鉴作用。目前已成功分离到了该种的菌丝，但菌丝的生长前期仍然很慢，难以扩繁，本发明征对这个问题进行了重点突破。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种简单，生产成本低，能使鹅膏菌丝快速生长的固体培养方法。 本发明的技术方案，其步骤为
(1)材料的选择野外采摘生长优良、无虫害、未开伞的幼嫩子实体；
(2)材料的消毒及处理将子实体带回实验室，于超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄；
(3)菌丝体诱导用无菌刀片轻微除去菌盖的表皮及周围部份，将余下的菌盖与菌柄交接的中部组织块，切成约0. 10 0. 25cm2的小方块，轻轻嵌入诱导培养基表面，培养基为改良 SPDM培养基(马铃薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L,MgSO4L 00g/L,CaCl2 I. 00g /UKH2PO40. 50g/L、NH4NO3 0. 35g/L、KNO3 0. 35g /L、维生素 B1 0. 10mg/L、琼脂 12. OOg/L)，补充麦芽汁(15. 0 16. 5波美)150 180ml，控制PH值为5. 4 5. 6，培养温度为22 24°C，暗培养38 45天，组织块多处隆起，表面长出团状、稠密的绒毛状白色菌丝；
(4)菌丝体快速繁殖将以上试管中长势良好的菌丝体挑出，剔除上面的培养基，切分成4 6份，每份为0. 25cm2左右(最好带有原子实体组织块)，将其轻轻嵌入扩大培养基表面，培养基为改良SPDM培养基(马铃薯200. 00g/L、葡萄糖20. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 I. 00g /UKH2PO4 0. 50g/L、NH4NO3 0. 35g/L、KNO3 0. 35g /L、维生素 B1 0. 10mg/L、琼脂12. 00g/L)，补充麦芽汁(15. 0 16. 5波美)150 180ml，谷氨酸0. 10 0. 25g/L，生长活性物质10 15mg/L，控制PH值为5. 4 5. 6，培养温度为22 24°C，暗培养10 15天，菌丝长满试管，换为大容器培养，长势良好，生长速度很快，可以较大规模地进行固体培养。本发明的有益效果是采用简单培养基，使菌丝能快速增殖，缩短了生长周期，其特点如下，
(1)操作简单在改良SPDM培养基基础上，只添加了麦芽汁、谷氨酸及生长活性物质，即可使菌丝在短时间内大量繁殖，
(2)周期短本发明使培养时间从45天左右缩短到15天左右，周期大大缩短；
(3)生产成本低；本发明的培养基配方中，只额外使用了三种简单的物质即可以完成整个培养过程。而且这些物质成本比较低，这一点非常重要，否则关系到以后的生产规模及推广使用等问题。
具体实施例方式以下的实施例子是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。实例一
野外采摘生长优良、无虫害、未开伞的幼嫩子实体；将子实体带回实验室，于超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄；
用无菌刀片轻微除去菌盖的表皮及周围部份，将余下的菌盖与菌柄交接的中部组织块，切成约0. 10 0. 25cm2的小方块，轻轻嵌入诱导培养基表面，培养基为改良SPDM培养基(马铃薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 I. 00g /L、KH2PO4 0. 50g/L、NH4NO3 0. 35g/L、KN03 0. 35g /L、维生素 B1 0. 10mg/L、琼脂 12. OOg/L)，补充麦芽汁(15. 0 波美)150ml，控制PH值为5. 4，培养温度为22°C，暗培养40天，组织块多处隆起，表面长出团状、稠密的绒毛状白色菌丝；
将以上试管中长势良好的菌丝体挑出，剔除上面的培养基，切分成4 6份，每份为0. 25cm2左右(最好带有原子实体组织块)，将其轻轻嵌入试管培养基表面，培养基为改良SPDM 培养基(马铃薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 I. 00g /L、KH2PO40. 50g/L、NH4NO3 0. 35g/L、KNO3 0. 35g /L、维生素 B1 0. 10mg/L、琼脂 12. OOg/L)，补充麦芽汁(16. 0波美)150ml，谷氨酸0. 10g/L，生长活性物质10mg/L,控制PH值为5. 4，培养温度 为22°C，暗培养10天，菌丝长满试管。实例二
野外采摘生长优良、无虫害、未开伞的幼嫩子实体；将子实体带回实验室，于超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄；
用无菌刀片轻微除去菌盖的表皮及周围部份，将余下的菌盖与菌柄交接的中部组织块，切成约0. 10 0. 25cm2的小方块，轻轻嵌入诱导培养基表面，培养基为改良SPDM培养基(马铃薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 I. 00g /L、KH2PO4 0. 50g/L、NH4NO3 0. 35g/L、KN03 0. 35g /L、维生素 B1 0. 10mg/L、琼脂 12. OOg/L)，补充麦芽汁(15. 5 波美)165ml，控制PH值为5. 6，培养温度为23°C，暗培养42天，组织块多处隆起，表面长出团状、稠密的绒毛状白色菌丝；
将以上试管中长势良好的菌丝体挑出，剔除上面的培养基，切分成4 6份，每份为0. 25cm2左右(最好带有原子实体组织块)，将其轻轻嵌入试管培养基表面，培养基为改良SPDM 培养基(马铃薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 I. 00g /L、KH2PO40. 50g/L、NH4NO3 0. 35g/L、KNO3 0. 35g /L、维生素 B1 0. 10mg/L、琼脂 12. OOg/L)，补充麦芽汁(16. 5波美)170ml，谷氨酸0. 25g/L，生长活性物质13mg/L,控制PH值为5. 4，培养温度为23°C，暗培养13天，菌丝长满试管。实例三
野外采摘生长优良、无虫害、未开伞的幼嫩子实体；将子实体带回实验室，于超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄；
用无菌刀片轻微除去菌盖的表皮及周围部份，将余下的菌盖与菌柄交接的中部组织块，切成约0. 10 0. 25cm2的小方块，轻轻嵌入诱导培养基表面，培养基为改良SPDM培养基(马铃薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 I. 00g /L、KH2PO4 0. 50g/L、NH4NO3 0. 35g/L、KN03 0. 35g /L、维生素 B1 0. 10mg/L、琼脂 12. OOg/L)，补充麦芽汁(16. 0 波美)180ml，控制PH值为5. 4，培养温度为24°C，暗培养38天，组织块多处隆起，表面长出团状、稠密的绒毛状白色菌丝；
将以上试管中长势良好的菌丝体挑出，剔除上面的培养基，切分成4 6份，每份为0. 25cm2左右(最好带有原子实体组织块)，将其轻轻嵌入试管培养基表面，培养基为改良SPDM 培养基(马铃薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 I. OOg /L、KH2PO40. 50g/L、NH4NO3 0. 35g/L、KNO3 0. 35g /L、维生素 B1 0. 10mg/L、琼脂 12. OOg/L)，补充麦芽汁(15. 0波美)180ml，谷氨酸0. 10g/L，生长活性物质15mg/L,控制PH值为5. 6，培养温度为24°C，暗培养12天，菌丝长满试管。实例四
野外采摘生长优良、无虫害、未开伞的幼嫩子实体；将子实体带回实验室，于超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄；
用无菌刀片轻微除去菌盖的表皮及周围部份，将余下的菌盖与菌柄交接的中部组织块，切成约0. 10 0. 25cm2的小方块，轻轻嵌入诱导培养基表面，培养基为改良SPDM培养基(马铃薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 I. 00g /L、KH2PO4 0. 50g/L、NH4NO3 0. 35g/L、KN03 0. 35g /L、维生素 B1 0. 10mg/L、琼脂 12. OOg/L)，补充麦芽汁(15. 0 波美)170ml，控制PH值为5. 4，培养温度为23°C，暗培养45天，组织块多处隆起，表面长出团状、稠密的绒毛状白色菌丝；
将以上试管中长势良好的菌丝体挑出，剔除上面的培养基，切分成4 6份，每份为0. 25cm2左右(最好带有原子实体组织块)，将其轻轻嵌入500ml三角瓶培养基表面，培养基为改良 SPDM 培养基(马铃薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L,MgSO4L 00g/L,CaCl2 I. 00g /L、KH2PO4 0. 50g/L、NH4NO3 0. 35g/L、KNO3 0. 35g /L、维生素 B1 0. 10mg/L、琼脂 12. OOg/L)，补充麦芽汁(15. 5波美)180ml，谷氨酸0. 20g/L,生长活性物质15mg/L,控制PH值为5. 4，培养温度为23°C，暗培养15天，菌丝长满三角瓶。实例五
野外采摘生长优良、无虫害、未开伞的幼嫩子实体；将子实体带回实验室，于超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄；
用无菌刀片轻微除去菌盖的表皮及周围部份，将余下的菌盖与菌柄交接的中部组织块，切成约0. I 0. 25cm2的小方块，轻轻嵌入诱导培养基表面，培养基为改良SPDM培养基(马铃薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 I. 00g /L、KH2PO4 0. 50g/L、NH4NO3 0. 35g/L、KN03 0. 35g /L、维生素 B1 0. 10mg/L、琼脂 12. OOg/L)，补充麦芽汁(16. 5 波美)150ml，控制PH值为5. 4，培养温度为23°C，暗培养41天，组织块多处隆起，表面长出团状、稠密的绒毛状白色菌丝；
将以上试管中长势良好的菌丝体挑出，剔除上面的培养基，切分成4 6份，每份为
0.25cm2左右(最好带有原子实体组织块)，将其轻轻嵌入1000ml三角瓶培养基表面，培养基为改良 SPDM 培养基(马铃薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L,MgSO4L 00g/L,CaCl2 I. 00g /L、KH2PO4 0. 50g/L、NH4NO3 0. 35g/L、KNO3 0. 35g /L、维生素 B1 0. 10mg/L、琼脂 12. OOg/L)，补充麦芽汁(16. 0波美)180ml，谷氨酸0. 25g/L，生长活性物质15mg/L,控制PH值为5. 4，培养温度为23°C，暗培养15天，菌丝长满三角瓶。权利要求
1.一种野生毒菌(小豹斑鹅膏)菌丝体室内快速培养的方法，其特征为，采用幼嫩的子实体菌褶诱导菌丝，对菌丝体进行优化培养，使其快速地大量繁殖，主要包括下列步骤 (1)材料的选择野外采摘生长优良、无虫害、未开伞的幼嫩子实体； (2)材料的消毒及处理将子实体带回实验室，于超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄等部位； (3)菌丝体诱导用无菌刀片轻微除去菌盖的表皮及周围部份，将余下的菌盖与菌柄交接的中部组织块(含菌皱)，切成约0. 10 0. 25cm2的小方块，轻轻嵌入诱导培养基表面，培养基为改良 SPDM 培养基(马铃薯 200. 00g/L、葡萄糖 20. 00g/L、MgSO4L 00g/L, CaCl2 I. 00g/UKH2PO4 0. 50g/L,NH4NO3 0. 35g/L、KN03 0. 35g /L、维生素 B1 0. 10mg/L、琼脂 12. OOg/L)，补充麦芽汁(15. 0 16. 5波美)150 180ml，控制PH值为5. 4 5. 6，培养温度为22 24°C，暗培养38 45天，组织块多处隆起，表面长出团状、稠密的绒毛状白色菌丝； (4)菌丝体快速繁殖将以上试管中长势良好的菌丝体挑出，剔除上面的培养基，切分成4 6份，每份为0. 25cm2左右(最好带有原子实体组织块)，将其轻轻嵌入扩大培养基表面，培养基为改良SPDM培养基(马铃薯200. 00g/L、葡萄糖20. 00g/L、MgSO4L 00g/L、CaCl2 I. 00g /UKH2PO4 0. 50g/L、NH4NO3 0. 35g/L、KNO3 0. 35g /L、维生素 B1 0. 10mg/L、琼脂12. 00g/L)，补充麦芽汁(15. 0 16. 5波美)150 180ml，谷氨酸0. 10 0. 25g/L，生长活性物质10 15mg/L，控制PH值为5. 4 5. 6，培养温度为22 24°C，暗培养10 15天，菌丝长满试管，换为大容器培养，长势良好，生长速度很快，可以较大规模地进行固体培养。
全文摘要
本发明涉及一种野生毒菌小豹斑鹅膏菌丝体室内快速繁殖的方法，属于大型真菌培养技术领域。其特征为从未开伞的幼嫩子实体菌褶诱导菌丝体，简单添加麦芽汁、谷氨酸及生长活性物质，使菌丝快速地大量繁殖。本发明培养基简单，培养周期短，成本低，可较大规模地进行小豹斑鹅膏菌丝的固体培养。鹅膏属是特殊珍贵的大型经济真菌，其价值大应用范围广，在开发新特效药如抗肿瘤、抗菌抗病毒、镇静或麻醉药等领域具有潜在地应用，但至今因其资源珍稀、难以人工驯化、毒素的化学合成品无活性等问题尚难以开发应用。本发明征对鹅膏菌丝难以诱导、菌丝生长非常缓慢等制约培养的问题进行了创新性突破，为菌丝规模化培养及今后人工驯化栽培等提供了条件。
文档编号A01G1/04GK102726207SQ20111028964
公开日2012年10月17日 申请日期2011年9月28日 优先权日2011年9月28日
发明者何隽, 刘弟, 吴鹏, 周文, 张曦予, 曹杰, 李宗菊, 李彪, 王鹏飞 申请人:云南大学