专利名称：一种慢性痛相关的抑郁症大鼠模型在研究抗抑郁药对疼痛的作用机制及靶点中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于医学动物模型制作，特别是一种慢性痛相关的抑郁症大鼠模型在研究抗抑郁药对疼痛的作用机制及靶点中的应用，可以用以观察和分析大鼠发生疼痛相关的抑郁症后行为学、形态学等改变。
背景技术：
疼痛是指“真实存在的或潜在的组织损伤或类似情况所带来的不愉快感觉及情绪体验”，它是人类最原始、最普遍、最早体验到的主观感受，如牙痛、头痛、关节痛等。疼痛分为急性痛和慢性痛。急性痛发生在组织损伤的即刻，警示机体正在受到损伤的威胁，常常具有保护作用，也就是人们常说的“好痛”。慢性痛是指持续几天、几周甚至更长时间的疼痛，如三叉神经痛、带状疱疹后遗神经痛、幻肢痛、癌症痛等顽固性慢性疼痛，它们已经失去了警告和保护意义，只对人体造成伤害，也就是人们常说的“坏痛”。国际疼痛学会(IASP) 的流行病学调查显示，全世界60多亿人口中慢性痛发病率超过了 1/3，癌症患者的癌性痛发病率约为2/3，疼痛患者的抑郁症发病率接近2/3。当疼痛影响脑功能并使人丧失工作能力，导致经济收入下降，进而使人格的独立性受到威胁时，病人就会感到生活失去乐趣和意义，从而导致家庭破裂、自杀甚至危及社会，大量的事实说明慢性痛严重危害人类身心健康。鉴于疼痛在临床诊断和治疗上的重要性，它已被现代医学列为继呼吸、脉搏、血压、体温之后的第五大生命体征。疼痛是一种复杂的心理生理活动,其症状包括痛感觉(pain sensation,如对疼痛强度的感知等)和痛情绪(pain affect,如忧郁恐惧、焦虑不安、易激惹、绝望)。近二十年来关于疼痛机制的研究取得了突飞猛进的发展，但大多集中在其痛感觉方面(如疼痛的传导、 下行调控)，而临床研究证实几乎所有的慢性痛患者都伴随不同症状和不同程度的神经精神症状，如抑郁，在某些条件下，如某些神经病理性痛时，即使致痛因素消失，但病人的情绪异常依然维持较长时间；与疼痛引起的痛感觉相比，约50-60%的患者情绪异常往往更令人痛苦，严重降低其生活质量。很多镇痛药物对慢性疼痛的治疗都不显著，相反，有些抗抑郁药，如三环类抗抑郁药和单胺类抗抑郁药，却能更好地缓解患者的症状，但这些药物的作用机制尚未完全明了。为了解上述抗抑郁药的作用机制，必须对慢性痛条件下痛情绪的发生、发展过程进行研究。但由于众所周知的原因，对于疼痛，尤其是慢性痛的研究很少能直接在人体上进行，必须有相适应的慢性痛引起的抑郁症模型，如大鼠模型。神经病理性痛是外伤或疾患导致的外周神经、脊髓背根、脊髓或者脑区内某些区域的病损所致的疼痛。常用模型包括单独结扎大鼠腰五脊神经模型(以下简称SNL模型)(见参考文献1-3)，坐骨神经部分结扎模型，背根节慢性压迫模型等。SNL模型是在大鼠脊髓腰
4-骶I水平钝性分离一侧椎旁肌肉，切除腰6脊髓横突，分离腰4-腰6脊神经，用3-0医用丝线分别紧紧结扎腰5和腰6脊神经，或者仅结扎腰6脊神经。术后12-20小时开始大鼠会出现机械性痛敏和异常痛敏，持续数周，而且动物会出现明显的情绪异常，如抑郁等，因此SNL模型常用于慢性痛所导致的痛感觉和痛情绪异常的研究。但是利用单独腰五脊神经结扎模型对慢性痛引起的痛情绪异常进行研究时往往存在这样的问题或缺陷临床上，患者大多因为神经病理性痛而导致抑郁，在疼痛因素被去除或者得到治疗后，虽然疼痛症状暂时消失，但抑郁等情绪异常依然长期存在，在某些特定时期又能反过来重新导致患者出现躯体疼痛等症状。在单独腰五脊神经结扎模型上，由于结扎线长期存在，故神经损伤所导致的动物疼痛与抑郁同时存在，两者相互作用，互相促进，无法分离，因此很难模拟临床上患者得到治疗后疼痛消失但情绪异常依然存在的现象， 也就无法真正的从根源上了解抗抑郁药对疼痛的作用机制及靶点。为了克服这一问题，必须在建立SNL模型后，对痛感觉和痛情绪进行分离。
发明内容
本发明的目的是一种慢性痛相关的抑郁症大鼠模型在研究抗抑郁药对疼痛的作用机制及靶点中的应用，使痛感觉与痛情绪分离，以便对动物进行高级脑功能行为学观察， 分析造模成功后大鼠抑郁症状的发生发展过程，为研究动物在慢性病理性痛情况下痛情绪对痛感觉的影响提供可靠的模型，并可以广泛用于临床镇痛药物的筛选。本发明的技术方案是提供一种慢性痛相关的抑郁症大鼠模型在研究抗抑郁药对疼痛的作用机制及靶点中的应用，其特征是所述大鼠模型的制备方法包括以下步骤
1)大鼠的准备选用正常成年健康Wistar大鼠；
2)每只大鼠单独饲养，可自由获得饮食，生活环境12小时光照/12小时黑暗；
3)乙醚吸入麻醉大鼠，备皮后酒精消毒背部皮肤，在左侧腰背部皮肤距离中线I.5厘米处做I厘米左右的切口，腰4-骶I水平钝性分离左侧椎旁肌肉，切除腰6脊髓横突，在体式显微镜下分离腰4-腰6脊神经；
4)用3-0医用丝线分别紧紧结扎腰5脊神经，结扎后修剪结扎线，使其一端留有4厘米左右的残余，以用于标记结扎点；生理盐水反复冲洗手术野，直至手术野干净并没有鲜血渗出；术后缝合肌肉及皮肤；
5)大鼠清醒后12小时左右用VonFrey丝测量其机械性痛敏；出现明显机械性痛敏的动物继续下面的手术；
6)大约24小时左右，将动物再次吸入麻醉后，剪断皮肤处的缝合线，再次暴露结扎的腰5脊神经，生理盐水清洁后，沿结扎线找到结扎点，在不损伤腰5脊神经的情况下，在体式显微镜下用手术剪刀轻轻剪开结扎线，观察结扎线是否卷曲，只有卷曲部分才是结扎点处结扎线；生理盐水多次冲洗手术野，直至其干净并无鲜血渗出；缝合肌肉皮肤；
7)动物回笼饲养，并分别在不同时间点对其进行高级脑功能检测。所述大鼠模型的制备方法中大鼠选择为大鼠选择为正常成年雄性，体重200克左右。所述大鼠模型的制备方法中步骤4)中只结扎腰5脊神经，并使一端的结扎线留长，以作释放时的标识。所述大鼠模型的制备方法中步骤5)中只选取出现了明显的机械性痛敏的动物继续下面的释放试验。
所述大鼠模型的制备方法中结扎后24小时，按照留长的结扎线所指，找到结扎点，将其释放。所述大鼠模型的制备方法中造模成功后的大鼠出现明显的抑郁等情绪障碍。本发明的具体步骤包括将大鼠用乙醚吸入麻醉后，在大鼠脊髓腰4-骶I水平钝性分离一侧椎旁肌肉，切除腰6脊髓横突，在体式显微镜下分离腰4-腰6脊神经，用3-0医用丝线分别紧紧结扎腰5脊神经，结扎后修剪结扎线，使其一端留有4厘米左右的残余，以用于标记结扎点。生理盐水反复冲洗手术野，直至手术野干净并没有鲜血渗出。术后缝合肌肉及皮肤。大鼠清醒后12小时左右用Von Frey丝测量其机械性痛敏。此时我们称为“结扎期”。手术后大约24小时左右，将动物再次吸入麻醉后，剪断皮肤处的缝合线，再次暴露结扎的腰5脊神经，生理盐水清洁后，沿结扎线找到结扎点，在不损伤腰5脊神经的情况下， 在体式显微镜下用手术剪刀轻轻剪开结扎线，观察结扎线是否卷曲(只有卷曲部分才是结扎点处结扎线)。生理盐水多次冲洗手术野，直至其干净并无鲜血渗出；缝合肌肉皮肤。大鼠清醒后仔细护理，每天用Von Frey丝测量其机械性痛敏，若造模成功则会发现大鼠机械性痛敏逐渐恢复。此时称为“结扎后释放期”。一般在“结扎后释放期”的第6天，大鼠的机械性痛敏恢复正常。造模成功的大鼠在“结扎后释放期”的第6天以后，将不会存在机械性痛敏，但如果利用强迫游泳实验测量期抑郁程度，会发现大鼠出现抑郁症的症状。本发明在腰5脊神经结扎所导致的神经病理性痛模型上，对结扎线进行释放，释放后动物机械性痛敏消失，行动正常，但抑郁症状依然长期存在。该模型将是首例将疼痛所引起的情绪反应与疼痛本身分离的动物模型，能够模拟临床上神经病理性痛得到治疗后患者神经精神异常症状依然长期存在，并最终反过来重新导致疼痛的情况，可以广泛应用于慢性痛所致的抑郁症的监测以及镇痛药物的筛选。本发明与传统的单独腰五脊神经结扎模型相比，该模型最大的特点就在于在结扎腰五脊神经后一天，将结扎线释放，利用释放结扎线的手段使动物脊神经恢复正常水平，且动物疼痛的感觉消失，但同时却保存痛情绪异常症状，可模拟慢性痛患者后期痛觉消失，但情绪异常等行为症状，同时为研究抗抑郁药等精神类药物的临床效果提供了良好的模型。
下面结合实施例附图对本发明做进一步说明
图I是在体式显微镜下找到腰5脊神经；
图2是用医用丝线结扎腰5脊神经；
图3是结扎后剪断结扎线，一段留有4厘米左右的断段；
图4是腰5脊神经结扎所引起的神经病理性痛大鼠机械性痛敏的变化；
图5是释放结扎线；
图6白色箭所示为释放的结扎线。图7腰五脊神经结扎大鼠强迫游泳试验数据图表。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明。实施例本实施例给出的建立神经病理性痛相关的抑郁症模型的方法，包括以下步骤
1)大鼠的选择及手术前准备选用正常成年健康Wistar大鼠，体重200克左右。每只大鼠单独饲养，可自由获得饮食。生活环境12小时光照/12小时黑暗，尽量避免外界环境对其刺激；
2)乙醚吸入麻醉大鼠，剔除腰背部毛发并酒精消毒，在其左侧腰背部皮肤做I厘米左右的切口，切口距离中线约I. 5厘米。腰4-骶I水平钝性分离左侧椎旁肌肉，切除腰6脊髓横突，在体式显微镜下分离腰4-腰6脊神经(如图I是在体式显微镜下找到腰5脊神经。 蓝色箭所示为腰5脊神经；白色箭所示为医用结扎丝线);在此过程中尽量避免伤及大血管， 减少出血；
3)用3-0医用丝线分别紧紧结扎腰5脊神经，结扎后修剪结扎线，使其一端留有4厘米左右的残余，以用于标记结扎点(如图2是用医用丝线结扎腰5脊神经。白色箭所示为结扎处所在；图3是结扎后剪断结扎线，一段留有4厘米左右的断段(白色箭所示))。生理盐水反复冲洗手术野，直至手术野干净并没有鲜血渗出。术后缝合肌肉及皮肤；
4)将大鼠放回笼内饲养，并观察期术后情况。在大鼠清醒后12小时左右用VonFrey 丝测量其机械性痛敏(图4是腰5脊神经结扎所引起的神经病理性痛大鼠机械性痛敏的变化。A :结扎后手术组大鼠手术侧后足缩足反射阈值与对侧比明显降低；假手术组大鼠缩足反射潜伏期没有明显变化。B.标准化后的缩足反射潜伏期(同一只大鼠手术侧与非手术侧相比)。+++ P <0.001同一只大鼠手术前后比较；*林P <0.001手术组与假手术组相比)。出现明显机械性痛敏的动物继续下面的手术；
5)大约结扎后24小时，再次对大鼠进行VonFrey测试，之后将动物再次吸入麻醉后， 剪断皮肤处的缝合线，再次暴露结扎的腰5脊神经，沿留作标记的结扎线找到结扎点，生理盐水清洁后，在不损伤腰5脊神经的情况下，在体式显微镜下用手术剪刀轻轻剪开结扎线， 观察结扎线是否卷曲，只有卷曲部分才是结扎点处结扎线(如图5是释放结扎线，白色箭所示为释放后留下的结扎痕迹；图6白色箭所示为释放的结扎线)。生理盐水多次冲洗手术野，直至其干净并无鲜血渗出；缝合肌肉皮肤；
6)动物回笼饲养，在动物清醒后检查其行动力，证明其运动能力没有受到损伤；
7)进行旷场试验，检测动物的自发活动；高架十字迷宫试验、条件性位置偏爱试验以及强迫游泳试验等检测动物的高级脑功能改变；给予不同抗抑郁药如盐酸氟西汀，观察药物对大鼠抑郁症的治疗作用如图7。图7是盐酸氟西汀降低了腰五脊神经结扎大鼠强迫游泳试验的不动时间实验数据表。**，p <0. 01。强迫游泳是常用的检测动物抑郁状态的实验，大鼠在水中的不动时间越长，证明它的抑郁状态越明显。在本检测过程中，大鼠分为3组，分别是假手术组(即对照组，不结扎腰五脊神经)，手术组(即腰五脊神经结扎组)和盐酸氟西汀+手术组(即药物组， 结扎腰五脊神经后腹腔给予大鼠盐酸氟西汀)。实验结果发现，手术组与假手术组相比，大鼠的不动时间明显增长(手术组247±44s ;假手术组186±57s)，而给予盐酸氟西汀后， 手术组动物不动时间缩短(193±49s)，以上证据表明，腰五脊神经结扎可以导致大鼠明显的抑郁症状，而抗抑郁药盐酸氟西汀可以减轻该症状。
由此可建立神经病理性痛引起的抑郁症模型，模拟临床慢性痛患者的精神抑郁状况，为治疗疼痛及其相关的神经精神症状提供有力的研究工具。参考文献
1、周秋雯，徐建国。慢性疼痛动物模型的研究进展。医学研究生学报，2008，21: 638-642 ；
2、金小高，罗爱林，张广雄。三种大鼠神经病理性疼痛模型的制备和效果比较。临床麻醉学杂志，2005，21，338-340 ；
3、毛庆祥，杨天德。神经病理性疼痛动物模型。中国医药指南，2008，6，13-17。
权利要求
1.一种慢性痛相关的抑郁症大鼠模型在研究抗抑郁药对疼痛的作用机制及靶点中的应用，其特征是所述大鼠模型的制备方法包括以下步骤.1)大鼠的准备选用正常成年健康Wistar大鼠；.2)每只大鼠单独饲养，可自由获得饮食，生活环境12小时光照/12小时黑暗；.3)乙醚吸入麻醉大鼠，备皮后酒精消毒背部皮肤，在左侧腰背部皮肤距离中线I.5厘米处做I厘米左右的切口，腰4-骶I水平钝性分离左侧椎旁肌肉，切除腰6脊髓横突，在体式显微镜下分离腰4-腰6脊神经；.4)用3-0医用丝线分别紧紧结扎腰5脊神经，结扎后修剪结扎线，使其一端留有4厘米左右的残余，以用于标记结扎点；生理盐水反复冲洗手术野，直至手术野干净并没有鲜血渗出；术后缝合肌肉及皮肤；.5)大鼠清醒后12小时左右用VonFrey丝测量其机械性痛敏；出现明显机械性痛敏的动物继续下面的手术；.6)大约24小时左右，将动物再次吸入麻醉后，剪断皮肤处的缝合线，再次暴露结扎的腰5脊神经，生理盐水清洁后，沿结扎线找到结扎点，在不损伤腰5脊神经的情况下，在体式显微镜下用手术剪刀轻轻剪开结扎线，观察结扎线是否卷曲，只有卷曲部分才是结扎点处结扎线；生理盐水多次冲洗手术野，直至其干净并无鲜血渗出；缝合肌肉皮肤；.7)动物回笼饲养，并分别在不同时间点对其进行高级脑功能检测。
2.根据权利要求I所述的慢性痛相关的抑郁症大鼠模型在研究抗抑郁药对疼痛的作用机制及靶点中的应用，其特征是所述大鼠模型的制备方法中大鼠选择为大鼠选择为正常成年雄性，体重200克左右。
3.根据权利要求I所述的慢性痛相关的抑郁症大鼠模型在研究抗抑郁药对疼痛的作用机制及靶点中的应用，其特征是所述大鼠模型的制备方法中步骤4)中只结扎腰5脊神经，并使一端的结扎线留长，以作释放时的标识。
4.根据权利要求I所述的慢性痛相关的抑郁症大鼠模型在研究抗抑郁药对疼痛的作用机制及靶点中的应用，其特征是所述大鼠模型的制备方法中步骤5)中只选取出现了明显的机械性痛敏的动物继续下面的释放试验。
5.根据权利要求I所述的慢性痛相关的抑郁症大鼠模型在研究抗抑郁药对疼痛的作用机制及靶点中的应用，其特征是所述大鼠模型的制备方法中结扎后24小时，按照留长的结扎线所指，找到结扎点，将其释放。
6.根据权利要求I所述的慢性痛相关的抑郁症大鼠模型在研究抗抑郁药对疼痛的作用机制及靶点中的应用，其特征是所述大鼠模型的制备方法中造模成功后的大鼠出现明显的抑郁等情绪障碍。
全文摘要
本发明公开了一种慢性痛相关的抑郁症大鼠模型在研究抗抑郁药对疼痛的作用机制及靶点中的应用。本模型通过结扎大鼠的腰5脊神经从而导致明显的机械性痛敏和异常痛，同时伴有抑郁症状。之后将结扎释放，动物的痛行为异常逐渐消失，但其精神症状却持续存在。本发明制备的抑郁症模型可以模拟临床上慢性痛患者得到治疗后疼痛消失但情绪异常依然存在的现象，进而从根源上了解抗抑郁药对疼痛的作用机制及靶点。
文档编号A01K67/027GK102578040SQ20111039359
公开日2012年7月18日 申请日期2011年12月2日 优先权日2011年12月2日
发明者李云庆, 武胜昔, 王文, 董玉琳 申请人:中国人民解放军第四军医大学