一种培育抗白叶枯病植物的方法
【专利摘要】本发明公开了一种培育抗白叶枯病植物的方法。本发明提供了一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤：抑制出发植物中lc7基因的表达，得到抗病性增强的转基因植物；所述lc7基因为编码如下（a）或（b）所述蛋白质的基因：（a）由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；（b）将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病相关的由序列1衍生的蛋白质。本发明发明，抑制水稻品种“日本晴”中的所述lc7基因表达后，植株对白叶枯病的抗性大大增加且具有显著的矮化特征。本发明对于抗白叶枯病植物的育种和矮化植物的育种具有良好的应用前景，对水稻的种植和生产具有重大价值。
【专利说明】一种培育抗白叶枯病植物的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种培育抗白叶枯病植物的方法。
【背景技术】
[0002]水稻原产亚洲热带，在中国广为栽种后，逐渐传播到世界各地。水稻所结稻粒去壳后称大米或米。世界上近一半人口，都以大米为食。大米的食用方法多种多样，有米饭、米粥、米饼、米糕、米线等。水稻除可食用外，还可以酿酒、制糖作工业原料，稻壳、稻杆也有很多用处。
[0003]水稻主要的生长区域是中国南方、台湾、日本、朝鲜半岛、东南亚、南亚、欧洲南部地中海沿岸、美国东南部、中美洲、大洋洲和非洲部分地区，中国北方沿河地区也种植稻。也就是说，除了南极洲之外，几乎大部分地方都有稻米生长。在2003年统计，全世界的稻作产量高达5亿8900万吨。在亚洲就有5亿3400万吨的产量。而全世界稻田总面积可达150万平方公里。
[0004]水稻白叶枯病在欧洲、非洲、南美、美国、澳大利亚、亚洲都有发生；而以日本、印度、我国发生较重。白叶枯病原菌(白叶枯菌)属真细菌目，假单胞菌科，黄单胞菌属，为短杆状，一根极生鞭毛，不形成芽孢。病原菌形态特征:细菌杆状有单根极鞭毛，格兰氏染色反应阴性。菌落圆形，表面光滑有光泽，蜡黄色。白叶枯病主要发生于叶片及叶鞘上。初起在叶缘产生半透明黄色小斑，以后沿叶缘一侧或两侧或沿中脉发展成波纹状的黄绿或灰绿色病斑；病部与健部分界线明显；数日后病斑转为灰白色，并向内卷曲，远望一片枯槁色，故称白叶枯病。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种培育抗白叶枯病植物的方法。
[0006]本发明提供了一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤:抑制出发植物中lc7基因的表达，得到抗病性增强的转基因植物(lc7干扰植株)；
[0007]所述lc7基因为编码如下(a)或(b)所述蛋白质的基因:(a)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列1的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病相关的由序列I衍生的蛋白质。
[0008]所述lc7基因可为如下I)或2)或3)或4)的DNA分子:
[0009]1)序列表中序列2所示的DNA分子；
[0010]2)序列表中序列3所示的DNA分子；
[0011]3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交且编码植物抗病相关蛋白的DNA分子;
[0012]4)与I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码植物抗病相关蛋白的DNA分子。
[0013]上述严格条件可为在6XSSC，0.5%SDS的溶液中，在65°C下杂交，然后用2XSSC、0.1%SDS 和 I X SSC、0.1%SDS 各洗膜一次。
[0014]所述“抑制出发植物中lc7基因的表达”的实现方式具体如下:在出发植物中导入针对所述lc7基因的干扰载体。所述干扰载体可为将特异DNA片段-1和特异DNA片段-1I分别插入植物表达载体的不同多克隆位点得到的重组质粒；所述特异DNA片段-1如序列表的序列2自5’末端第1097至1431位核苷酸所示；所述特异DNA片段-1I与所述特异DNA片段-1反向互补。所述植物表达载体中可具有任何一种一般性启动子、增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入可选择性标记(⑶S基因、GFP和荧光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记基因(庆大霉素，卡那霉素等)。为了转基因植物释放的安全性，在构建植物表达载体时也可不携带任何标记基因，在苗期接种水稻白叶枯病菌种进行筛选。所述干扰载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导或基因枪等常规生物学方法转化植物。所述植物表达载体具体可为PTCK303载体。
[0015]所述抗病具体可为抗白叶枯病。所述白叶枯病具体可为白叶枯菌菲律宾6号小种PX099引起的白叶枯病。
[0016]所述出发植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物可为禾本科植物，具体可为稻属植物，更具体可为水稻品种“日本晴”。
[0017]发明人发现:lc7干扰植株中细胞内的活性氧清除酶活性增加以清除产生过多的活性氧，可能激发了细胞的防御反应，对白叶枯菌产生广谱抗性。
[0018]本发明还保护一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤:在出发植物中导入所述lc7基因，得到抗病性降低的转基因植物。所述抗病具体可为抗白叶枯病。所述白叶枯病具体可为白叶枯菌菲律 宾6号小种PX099引起的白叶枯病。所述出发植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物可为禾本科植物，具体可为稻属植物，更具体可为水稻品种“日本晴”。所述出发植物可为以上任一所述方法得到的抗病性增强的转基因植物(lc7干扰植株)。所述“在出发植物中导入所述lc7基因”的实现方法具体如下:在出发植物中导入含有所述lc7基因的表达载体。所述表达载体可为在植物表达载体的多克隆位点插入所述lc7基因得到的重组质粒。所述表达载体中，所述lc7基因的表达可由序列表的序列3自5’末端第I至1465位核苷酸所示的lc7基因启动子启动。所述植物表达载体中可具有任何一种一般性启动子、增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入可选择性标记(GUS基因、GFP和荧光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记基因(庆大霉素，卡那霉素等)。所述表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导或基因枪等常规生物学方法转化植物。所述重组质粒具体可如下:将pCAMBIA2300-Actin载体的多克隆位点分别插入所述lc7基因启动子和所述lc7基因。
[0019]本发明还保护一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤:抑制出发植物中所述lc7基因的表达，得到矮化的转基因植物(lc7干扰植株)。
[0020]所述“抑制出发植物中lc7基因的表达”的实现方式具体如下:在出发植物中导入针对所述lc7基因的干扰载体。所述干扰载体可为将特异DNA片段-1和特异DNA片段-1I分别插入植物表达载体的不同多克隆位点得到的重组质粒；所述特异DNA片段-1如序列表的序列2自5’末端第1097至1431位核苷酸所示；所述特异DNA片段-1I与所述特异DNA片段-1反向互补。所述植物表达载体中可具有任何一种一般性启动子、增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入可选择性标记(⑶S基因、GFP和荧光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记基因(庆大霉素，卡那霉素等)。为了转基因植物释放的安全性，在构建植物表达载体时也可不携带任何标记基因，直接通过矮化表型进行筛选。所述干扰载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导或基因枪等常规生物学方法转化植物。所述植物表达载体具体可为PTCK303载体。
[0021]所述出发植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物可为禾本科植物，具体可为稻属植物，更具体可为水稻品种“日本晴”。
[0022]本发明还保护一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤:在出发植物中导入所述lc7基因，得到株高增加的转基因植物。所述出发植物可为单子叶植物或双子叶植物。所述单子叶植物可为禾本科植物，具体可为稻属植物，更具体可为水稻品种“日本晴”。所述出发植物可为以上任一所述方法得到的矮化的转基因植物(lc7干扰植株)。所述“在出发植物中导入所述lc7基因”的实现方法具体如下:在出发植物中导入含有所述lc7基因的表达载体。所述表达载体可为在植物表达载体的多克隆位点插入所述lc7基因得到的重组质粒。所述表达载体中，所述lc7基因的表达可由序列表的序列3自5’末端第I至1465位核苷酸所示的lc7基因启动子启动。所述植物表达载体中可具有任何一种一般性启动子、增强启动子或诱导型启动子。为了便于对转基因植物进行鉴定及筛选，可对所使用的载体进行加工，如加入可选择性标记(GUS基因、GFP和荧光素酶基因等)或具有抗性的抗生素标记基因(庆大霉素，卡那霉素等)。所述表达载体可通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、微注射、电导、农杆菌介导或基因枪等常规生物学方法转化植物。
[0023]本发明发现，抑制水稻品种“日本晴”中的所述lc7基因表达后，植株对白叶枯病的抗性大大增加且具有显著的矮化特征。在所述lc7基因抑制植株中重新导入所述lc7基因，可以使其恢复水稻品种“日本晴”的表型，即对白叶枯病感病和株高增加。本发明对于抗白叶枯病植物的育种和矮化植物的育种具有良好的应用前景，对水稻的种植和生产具有重大价值。
【专利附图】
【附图说明】
[0024]图1为重组质粒甲的结构示意图。
[0025]图2为重组质粒乙的结构示意图。
[0026]图3为各个植株正常培养至孕穗期的照片。
[0027]图4为各个植株接种白叶枯菌菲律宾6号小种PX099两周被接种叶片的照片。【具体实施方式】
[0028]以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。 下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。pMD18-T购自TaKaRa公司。
[0029]pCAMBIA2300-Actin载体:公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；参考文献:Kejian Wang, Ding Tang, Lilan Hong, WenyingXu, Jian Huang, Ming Li,Minghong Gu,Yongbiao Xue,Zhukuan Cheng.DEP and AFO Regulate Reproductive Habitin Rice.January 2010.Volume 6。
[0030]pTCK303载体:公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；参考文献:ZHEN WANG, CHANGBIN CHEN, YUNYUAN XU, RONGXI JIANG, YE HAN, ZHIHONG XU, KANG CHONGPlant Molecular Biology Reporter,2004,22:409 - 417。
[0031]白叶枯菌菲律宾6号小种PX099:公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；参考文献:郑崇珂，王春连，于元杰，梁云涛，赵开军.水稻抗白叶枯病新基因Xa32(t)的鉴定和初步定位.作物学报，2009，35 (7):1173-1180。
[0032]农杆菌菌株EHA105:公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得；参考文献:H.Xiao, Y.Wang, D.F.Liu, ff.M.Wang, X.B.Li, X.F.Zhao, J.C.Xu, ff.X.Zhai, L.H.Zhu.Functional analysis of the rice AP3 homologue 0sMADS16 by RNA interference.Plant Molecular Biology (2003)52:957-966。
[0033]lc7基因的基因组DNA如序列表的序列3所示，长度为16579bp，由33个外显子组成。lc7基因的cDNA如序列表的序列2所示，长度为4848bp。lc7基因编码序列表的序列I所示的蛋白质(由1615个氨基酸残基组成)。
[0034]实施例1、重组质粒的构建
[0035]一、重组质粒甲的构建
[0036]1、提取水稻 品种“日本晴”的总RNA并反转录为cDNA。
[0037]2、以步骤I的cDNA为模板，用Fl和Rl组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩
增产物。
[0038]Fl:5' -GAGCTCatggccacgctcccacgtgc-3'；
[0039]Rl:5/ -GTCGACtcacttcgccgattgtactg-31。
[0040]3、用限制性内切酶Sac I和Sal I双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
[0041]4、用限制性内切酶Sac I和Sal I双酶切pCAMBIA2300_Actin载体，回收约IOkb的载体骨架。
[0042]5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒。
[0043]6、提取水稻品种“日本晴”的基因组DNA。
[0044]7、以步骤6提取的基因组DNA为模板，用F2和R2组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。
[0045]F2:5' -GAATTCttgtaaggctgctaggagcc-3'；
[0046]R2:5' -GAGCTCgcgtgatatatctccaacga-31 ；
[0047]8、用限制性内切酶EcoR I和Sac I双酶切步骤7的PCR扩增产物，回收酶切产物。
[0048]9、用限制性内切酶EcoR I和Sac I双酶切步骤5得到的重组质粒，回收约11.5kb的载体骨架。
[0049]10、将步骤8的酶切产物和步骤9的载体骨架连接，得到重组质粒甲(又称重组质粒pClc7c)。重组质粒甲的结构示意图见图1，NPTII代表新霉素磷酸转移酶II基因，CaMV35S ter代表CaMV35S基因终止子，p35S代表CaMV 35S基因启动子，lc7 promoer代表lc7基因启动子，lc7c代表lc7基因的cDNA。根据测序结果，对重组质粒甲进行结构描述如下:将pCAMBIA2300-Actin载体EcoR I和Sac I酶切位点之间的小片段取代为了序列表的序列3自5’末端第I至1465位核苷酸所示的lc7基因启动子，Sac I和Sal I酶切位点之间的小片段取代为了序列表的序列2所示的lc7基因。
[0050]二、重组质粒乙的构建
[0051]1、提取水稻品种“日本晴”的总RNA并反转录为cDNA。
[0052]2、以步骤I的cDNA为模板，用F3和R3组成的引物对进行PCR扩增，得到PCR扩
增产物。
[0053]F3:5' -ACTAGTGGTACCctaaagcatctgattcagca-31 ;
[0054]R3:5' -GAGCTCGGATCCtgactcatccattggtataa-31
[0055]3、用限制性内切酶Kpn I和BamH I双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。
[0056]4、用限制性内切酶Kpn I和BamH I双酶切pTCK303载体，回收约14.5kb的载体骨架。
[0057]5、将步骤3的酶切产物和步骤4的载体骨架连接，得到重组质粒。
[0058]6、用限制性内切酶SpeI和Sac I双酶切步骤2的PCR扩增产物，回收酶切产物。 [0059]7、用限制性内切酶Sac I和SpeI双酶切步骤5的重组质粒，回收约15kb的载体骨架。
[0060]8、将步骤6的酶切产物和步骤7的载体骨架连接，得到重组质粒乙(又称重组质粒pClc7RNAi)。重组质粒乙的结构示意图见图2，Hyg代表潮霉素磷酸转移酶基因，CaMV35Ster代表CaMV35S基因终止子，p35S代表CaMV 35S启动子，pUbi代表水稻Ubiquitin基因启动子，GUSa代表β-葡萄糖苷酸酶的外显子，NOS ter代表土壤农杆菌质粒的胭脂碱合成酶基因的终止子。根据测序结果，对重组质粒乙进行结构描述如下:以PTCK303载体为出发载体，用特异DNA片段-1 (即序列表的序列2自5’末端第1097至1431位核苷酸所示的双链DNA片段)取代了出发载体Kpn I和BamH I酶切位点之间的小片段，并且用特异DNA片段-1I取代了出发载体Sac I和SpeI酶切位点之间的小片段；特异DNA片段-1I与特异DNA片段-1反向互补，且一端增加了 Kpn I酶切识别序列另一端增加了 BamH I酶切识别序列。
[0061]实施例2、转基因植株的获得和鉴定
[0062]一、转基因植株乙的获得
[0063]1、将重组质粒乙导入农杆菌菌株EHA105，得到重组农杆菌乙。
[0064]2、将步骤I得到的重组农杆菌乙与水稻品种“日本晴”的成熟胚愈伤组织共培养，采用50mg/L潮霉素筛选抗性愈伤组织，然后经过预分化、分化、生根后得到Ttl代植株。
[0065]3、提取Ttl代植株的基因组DNA，用Hyg_F和Hyg_R组成的引物对进行PCR鉴定，目的条带约1035bp，PCR鉴定中扩增得到目的条带的植株即为转基因植株乙(lc7干扰植株)。
[0066]Hyg_F:5/ -TAGGAGGGCGTGGATATGTC-3'；
[0067]Hyg_R:5/ -TACACAGCCATCGGTCCAGA-3'。
[0068]二、转基因植株甲的获得
[0069]1、将重组质粒甲导入农杆菌菌株EHA105，得到重组农杆菌甲。
[0070]2、将步骤I得到的重组农杆菌甲与转基因植株乙的成熟胚愈伤组织共培养，采用120-200 μ g/L G418筛选抗性愈伤组织，然后经过预分化、分化、生根后得到Ttl代植株。[0071]3、提取Ttl代植株的基因组DNA，用NPT_F和NPT_R组成的引物对进行PCR鉴定，目的条带约411bp，PCR鉴定中扩增得到目的条带的植株即为转基因植株甲(lc7互补植株)。
[0072]NPT_F:5/ -GCAGGCATCGCCATGGG-3'；
[0073]NPT_R:5/ -GCCCTGAATGAACTGCA-3'。
[0074]三、对照植株的获得
[0075]用PTCK303载体代替重组质粒乙进行步骤一，得到转空载体植株乙。
[0076]用PCAMBIA2300载体代替重组质粒甲，并且用水稻品种“日本晴”代替转基因植株乙，进行步骤二，得到转空载体植株甲。
[0077]四、转基因植株的鉴定
[0078]1、将Ttl代lc7干扰植株、T0代lc7互补植株、T0代转空载体植株乙、T0代转空载体植株甲和水稻品种“日本晴”各8株正常培养至孕穗期后拍照。照片见图3，A为水稻品种“日本晴”，B为lc7干扰植株，C为转空载体植株乙。
[0079]水稻品种“日本晴”的平均株高为106.4±2.1cm。
[0080]转空载体植株甲的平均株高为106.4 ±2.5cm。
[0081]转空载体植株乙的平均株高为106.4± 1.9cm。
[0082]lc7互补植株的平均株高为106.3±2.9cm。
[0083]lc7干扰植株的平均株闻为88.6±2.2cm。
[0084]与水稻品种“日本晴”相比，lc7干扰植株具有矮化的表型。lc7互补植株、转空载体植株乙、转空载体植株甲的株高表型均与水稻品种“日本晴” 一致。
[0085]2、将Ttl代lc7干扰植株、T0代lc7互补植株、T0代转空载体植株乙、T0代转空载体植株甲和水稻品种“日本晴”各8株正常培养至分蘖盛期，采用Kauffman等(1973年)的人工剪叶接种白叶枯菌菲律宾6号小种PX099，具体如下:每株植株接种3-5个叶片，接种时先把剪刀在白叶枯菌菲律宾6号小种PX099的菌液(溶剂为无菌水，菌浓度为IO9个细胞/ml)菌液中浸泡一下，然后用剪刀剪去每个要被接种的叶片顶端3-5cm，接种两周后观察各个植株上被接种叶片的表型并拍照,根据叶片的表型进行病情分级。
[0086]水稻对白叶枯菌病情的分级标准见表2。
[0087]表2水稻对白叶枯菌病情的分级标准
[0088]
【权利要求】
1.一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤:抑制出发植物中1C7基因的表达，得到抗病性增强的转基因植物；所述lc7基因为编码如下(a)或(b)所述蛋白质的基因: Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病相关的由序列I衍生的蛋白质。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于:所述lc7基因为如下I)或2)或3)或4)的DNA分子: 1)序列表中序列2所不的DNA分子； 2)序列表中序列3所示的DNA分子； 3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交且编码植物抗病相关蛋白的DNA分子; 4)与I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码植物抗病相关蛋白的DNA分子。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述“抑制出发植物中lc7基因的表达”的实现方法如下:在出发植物中导入针对所述lc7基因的干扰载体。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于:所述干扰载体为将特异DNA片段-1和特异DNA片段-1I分别插入植物表达载体的不同多克隆位点得到的重组质粒；所述特异DNA片段-1如序列表的序列2自5’末端 第1097至1431位核苷酸所示；所述特异DNA片段-1I与所述特异DNA片段-1反向互补。
5.如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于:所述抗病为抗白叶枯病。
6.如权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于:所述出发植物为单子叶植物或双子叶植物。
7.一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤:在出发植物中导入lc7基因，得到抗病性降低的转基因植物；所述lc7基因为编码如下(a)或(b)所述蛋白质的基因: Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病相关的由序列I衍生的蛋白质。
8.一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤:抑制出发植物中lc7基因的表达，得到矮化的转基因植物；所述lc7基因为编码如下(a)或(b)所述蛋白质的基因: Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物矮化相关的由序列I衍生的蛋白质。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于:所述lc7基因为如下I)或2)或3)或4)的DNA分子: 1)序列表中序列2所不的DNA分子； 2)序列表中序列3所示的DNA分子； 3)在严格条件下与I)或2)限定的DNA序列杂交且编码植物抗病相关蛋白的DNA分子; 4)与I)或2)限定的DNA序列具有90%以上同源性且编码植物抗病相关蛋白的DNA分子。
10.一种培育转基因植物的方法，包括如下步骤:在出发植物中导入lc7基因，得到株高增加的转基因植物；所述lc7基因为编码如下(a)或(b)所述蛋白质的基因: Ca)由序列表中序列I所示的氨基酸序列组成的蛋白质； (b)将序列I的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗病相 关的由序列I衍生的蛋白质。
【文档编号】A01H5/00GK103882052SQ201210558838
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2012年12月20日 优先权日:2012年12月20日
【发明者】翟文学, 江光怀, 陈红霖 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所