专利名称：一种枣树试管苗诱变多倍体筛选的新方法
技术领域：
本发明涉及一种枣树试管苗诱变多倍体筛选的新方法，属于植物生物技术与植物遗传育种领域或者植物试管诱变育种领域。
背景技术：
我国是枣树发源地，黄河峡谷流域是枣树的发源地和优生区之一。陕北地区枣树种植资源丰富。木率为鼠李科(Rhamnaceae)率属(Zizyphus jujube Mill Muzao)植物，《中国果树志 枣卷》记载其果实中等大，圆柱形，侧面略扁，平均果重14.1 g，果肉厚，绿白色，质地硬，稍粗，汁液较少，昧甜，略具酸味。含可溶性固形物28% 33%，总糖21.7%，酸
O.79%，维生素C 461. 7mg / 100 g，含水68%，可食率96. 8%，适宜制干，品质中上等，制干率48.6%。木枣适应性强，耐旱涝、抗霜冻，山地、平原均可栽种。树势较强，发枝力中等，枝叶密度容易控制。根蘖萌生力弱，生长势强，根系较发达，是理想的退耕还林树种。植物多倍体诱导后的筛选方法很多，主要有外部形态比较果树多倍体一般茎变短、叶变厚，叶形指数变小；颜色变深，表面皱缩粗糙、生长缓慢；花、果变大，可育性低。气孔鉴定多倍体的气孔较二倍体大，叶片单位面积上的气孔数量相对减少。这是一种较为可靠的鉴定方法。花粉粒鉴定与二倍体相比，多倍体花粉粒体积大，生活力低。梢端组织发生层细胞鉴定用切片染色法比较组织发生层的三层细胞和细胞核的大小，多倍体的比二倍体的大。染色体记数(直接鉴定法)用植物的根尖细胞、茎尖细胞或花粉母细胞制片，在显微镜下直接观察染色体数目变化。分子水平鉴定采用流式细胞仪来测定单个细胞的DNA含量，再根据DNA含量比较来推断出细胞的倍性。宁强(2008)是通过形态学和细胞学经过比较来确定大田条件下枣树苗多倍体的。蒋洪恩(2004)采用Partec DPAC软件对倍性分析仪测定的DNA含量分布曲线分析，并对确定的四倍体做了气孔数量、叶绿体数量、花粉等研究，在他们的研究中发现了大量的嵌合体。王娜(2005)用组培苗的丛生芽通过秋水仙碱诱变处理获得了变异植株，并结果:Γ4代的继代培养纯化了嵌合体。严仁玲(1995)经过秋水仙碱处理并对细胞学和气孔做了研究，经过5代的继代培养获得了 8个稳定的多倍体系。齐向英(2011)通过染色体变异确定了京枣的同源四倍体，并对其做了气孔分析。 目前报道的均为先进行细胞染色体分析，然后再观察形态学、解破学、孢粉学变化，主要存在以下几个问题①诱变率多指发生染色体数目变化的数量，后续报道较少
嵌合体数量较多，纯化培养时间长；③纯化得到的四倍体突变体少。
发明内容
本发明实施例的目的在于提供一种枣树试管苗诱变多倍体筛选的新方法，旨在解决①诱变率多指发生染色体数目变化的数量，后续报道较少；②嵌合体数量较多，纯化培养时间长；③纯化得到的四倍体突变体少的问题。本发明实施例是这样实现的，一种枣树试管苗诱变多倍体筛选的新方法，包括以下步骤
①木枣试管苗诱变的基本程序；②根据形态学特征对诱变后的植株进行第一次筛选；③分化培养对分化出的丛生芽进行第二次筛选对筛选的目标丛生芽进行染色体分析对确定的多倍体进行培养。进一步，具体包括以下步骤(I)在木枣试管苗继代培养基中加入秋水仙碱溶液，灭菌冷却后，在超净工作台上将带茎尖枣树试管苗接种在培养基上，每瓶培养基可以接种5 7株试管苗；在光照I 500Ix±200 lx，每天给12 h的光照、湿度70%±5%、温度25±1°C条件下培养30d，完成诱变过程;(2)将第一步中的诱变过程完成的枣树试管苗按每瓶一个芽体的方式转接到不含秋水仙碱的新培养基中；
(3)将低温培养结束后的枣树试管苗接种在以MS为基本培养基，pH =6. O、附加琼脂 55g/L、蔗糖 30g/L、6-Al. Omg/L、IBAO. 2 mg/L、TDZO. 01 mg/L 的培养基上进行连续分化
培养；(4)将第三步获得的丛生芽按叶片形态是否变皱褶、茎干是否变粗壮、叶间距是否变短对其进行筛选。筛选后的植株再按单芽体进行培养；(5)对经过再次培养的疑是多倍体进行染色体压片观察，确认其是否是多倍体。进一步，在木枣试管苗继代培养基中加入30%的秋水仙碱溶液。进一步，MS培养基为NH4NO3 1650mg/L ；ΚΝ03 I 900 mg/L ； CaCl2 · 2H20 440mg/L ；MgSO4 ·7Η20 370 mg/L ；KH2PO4 170 mg/L ；KI 0. 83 mg/L ；H3BO3 6. 2 mg/L ；MnS04 ·4Η2022. 3 mg/L ；ZnSO4 · 7H20 8. 6 mg/L ；Na2MnO4 · 2H20 0. 25 mg/L ；CuSO4 · 5H20 0. 025 mg/L ；CoCl2 · 6H20 0. 025 mg/L ；FeS04 · 7H20 27. 8 mg/L ；Na2-EDTA · 2H20 37. 3 mg/L ； 有机物质肌醇100 mg/L ;烟酸0.5 mg/L ;盐酸批卩多醇0.5 mg/L ;盐酸硫胺素(维生素BI)O.1 mg/L ;甘氨酸 2. O mg/L O进一步，将低温培养结束后的枣树试管苗接种在以MS为基本培养基，pH =6.0、附加琼脂 55g/L、蔗糖 30g/L、6-Al. Omg/L、IBAO. 2 mg/L、TDZO. 01 mg/L 的培养基上进行连续分化培养，培养条件光照I 500 lx±200 lx，每天给12 h的光照、湿度70%±5%、温度25±1°C条件下培养；直到分化出不同形态的丛生芽；进一步，所用来筛选多倍体的木枣芽体为诱变后的试管苗单个芽体分化出的新芽体。本发明公开了一种枣树试管苗诱变多倍体筛选的新方法，包括以下步骤①木枣试管苗诱变的基本程序根据形态学特征对诱变后的植株进行第一次筛选；③分化培养对分化出的丛生芽进行第二次筛选；④对筛选的目标丛生芽进行染色体分析；⑤对确定的多倍体进行培养。本方法采用由表及里的方式结合连续分化培养来筛选枣树诱变试管苗多倍体，可使枣树试管苗四倍体的选出率大大提高、时间缩短。应用本方法在对木枣连续三次试验发现可在ll(Tl50d内选育出四倍体35. 0%以上。
图1是现有技术提供的单芽体继代分化培养的示意图；图2是本发明实施例提供的四倍体的示意图。
具体实施例方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。步骤一将木枣当年生枣头剪成长约20cm的枝条带回实验室。先在自来水下冲洗l(Tl5min，一边冲洗一边用软毛刷轻刷枝条，将枝条放在10%的洗衣服溶液中浸泡3(T60min，然后用84消毒液30ml加蒸馏水到500ml浸泡15min，无菌水清洗后转入超净工作台，用75%乙醇+1滴吐温20灭菌l(Tl5s，然后转入O. 1%氯化汞+1滴吐温20中灭菌8min，灭菌结束后用无菌水清洗3飞次。剪掉浸毒部位，余下的部分至少含一个芽体，接入准备好的MS培养基中。
等枣头长到5cm长，将其剪短，转入准备好的诱变培养基中，诱变培养基为MS基本培养基+30%秋水仙碱+琼脂55g/L+蔗糖30g/L，pH=6. O。在光照I 500 Ix±200 lx,每天给12 h的光照、湿度70%±5%、温度25±1°C条件下培养30d。培养结束后将经过秋水仙碱诱变处理的枣头按单个芽体的方式接种到MS基本培养基+琼脂55g/L+蔗糖30g/L，pH=6. O的新培养基中，在培养条件为光照强度I 500 lx±200 lx，每天给12 h的光照、湿度70%±5%、温度10±1°C条件下培养10d。IOd后将枣头按单芽体的方式接种以在MS为基本培养基，pH =6.0、附加琼脂558/1、蔗糖3(^/1、6-八1.011^/1、18八0.2 mg/L、TDZ0. 01 mg/L的培养基上进行连续分化培养，培养条件光照I 500 lx±200 lx，每天给12 h的光照、湿度70%±5%、温度25±1°C条件下培养。直到分化出不同形态的丛生芽。步骤二通过不定期观察，第一次筛选主要看分化出的不定芽是否发生叶片变皱褶、叶缘锯齿是否变大、叶脉是否变凸显、叶间距是否变大、茎是否变粗。根据以上特征进行第一次筛选。将叶片变皱褶、叶脉凸显、茎段变粗的植株从新转接到以MS为基本培养基，pH =6.0、附加琼脂55g/L、蔗糖30g/L、6-Al. Omg/L、IBAO. 2 mg/L,TDZO. 01 mg/L的培养基上进行分化培养，培养条件光照I 500 lx±200 lx，每天给12 h的光照、湿度70%±5%、温度25± 1°C条件下培养。对分化出的丛生芽进行第二次形态学筛选。步骤三将第二次形态学筛选确定的目标植株转入到分化培养基以MS为基本培养基，pH=6. O、附加琼脂 55g/L、蔗糖 30g/L、6-Al. Omg/L、IBAO. 2 mg/L,TDZO. 01 mg/L 的培养基上进行分化培养，培养条件光照I 500 lx±200 lx，每天给12 h的光照、湿度70%±5%、温度25±1°C条件下培养。对第三次获得的丛生芽进行细胞学分析。该研究第一次共接种168个外植体，通过上述步骤，共继代培养132d，经过分析获得59株同源四倍体，第二次接种303株外植体，共培养144d，经过分析获得106株同源四倍体，第三次共接种62株外植体，共培养109d，共获得25株同源四倍体。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种枣树试管苗诱变多倍体筛选的新方法，其特征在于，包括以下步骤①木枣试管苗诱变的基本程序；②根据形态学特征对诱变后的植株进行第一次筛选；③分化培养对分化出的丛生芽进行第二次筛选；④对筛选的目标丛生芽进行染色体分析；⑤对确定的多倍体进行培养。
2.根据权利要求1所述的该方法，其特征在于，具体包括以下步骤(I)在木枣试管苗继代培养基中加入秋水仙碱溶液，灭菌冷却后，在超净工作台上将带茎尖枣树试管苗接种在培养基上，每瓶培养基可以接种5 7株试管苗；在光照I 500 Ix±200 lx，每天给12 h的光照、湿度70%±5%、温度25±1°C条件下培养30d，完成诱变过(2)将第一步中的诱变过程完成的枣树试管苗按每瓶一个芽体的方式转接到不含秋水仙碱的新培养基中；⑶将低温培养结束后的枣树试管苗接种在以MS为基本培养基，pH =6. O、附加琼脂 55g/L、蔗糖 30g/L、6-Al. Omg/L、IBAO. 2 mg/L、TDZO. 01 mg/L 的培养基上进行连续分化培养;⑷将第三步获得的丛生芽按叶片形态是否变皱褶、茎干是否变粗壮、叶间距是否变短对其进行筛选。筛选后的植株再按单芽体进行培养；(5)对经过再次培养的疑是多倍体进行染色体压片观察，确认其是否是多倍体。
3.根据权利要求1所述的该方法，其特征在于，在木枣试管苗继代培养基中加入30%的秋水仙碱溶液。
4.根据权利要求1所述的该方法，其特征在于，MS培养基为=NH4NO31650mg/L ；ΚΝ03 I 900 mg/L ； CaCl2 · 2H20 440 mg/L ；MgS0 4 · 7H20 370 mg/L ；KH2PO4 170 mg/L ；KI0. 83 mg/L ；H3BO3 6. 2 mg/L ；MnSO4 · 4H20 22. 3 mg/L ；ZnSO4 · 7H20 8. 6 mg/L ；Na2MnO4 · 2H20 0. 25 mg/L ；CuSO4 · 5H20 0. 025 mg/L ；CoCl2 · 6H20 0. 025 mg/L ；FeS04 · 7H20 27. 8 mg/L ； Na2-EDTA · 2H 20 37. 3 mg/L ； 有机物质肌醇 100 mg/L ;烟酸 0· 5 mg/L ;盐酸吡哆醇O. 5 mg/L ;盐酸硫胺素O.1 mg/L ;甘氨酸2. O mg/L。
5.根据权利要求1所述的该方法，其特征在于，将低温培养结束后的枣树试管苗接种在以 MS 为基本培养基，pH =6. O、附加琼脂 55g/L、蔗糖 30g/L、6_Al· Omg/L、IBAO. 2 mg/L、 TDZO. 01 mg/L的培养基上进行连续分化培养，培养条件光照I 500 lx±200 lx，每天给12 h的光照、湿度70%±5%、温度25±1°C条件下培养；直到分化出不同形态的丛生芽。
6.根据权利要求1所述的该方法，其特征在于，所用来筛选多倍体的木枣芽体为诱变后的试管苗单个芽体分化出的新芽体。
全文摘要
本发明公开了一种枣树试管苗诱变多倍体筛选的新方法，包括以下步骤①木枣试管苗诱变的基本程序；②根据形态学特征对诱变后的植株进行第一次筛选；③分化培养对分化出的丛生芽进行第二次筛选；④对筛选的目标丛生芽进行染色体分析；⑤对确定的多倍体进行培养。本方法采用由表及里的方式结合连续分化培养来筛选枣树诱变试管苗多倍体，可使枣树试管苗四倍体的选出率大大提高、时间缩短。应用本方法在对木枣连续三次试验发现可在110~150d内选育出四倍体35.0%以上。
文档编号A01H4/00GK103004607SQ20131000396
公开日2013年4月3日 申请日期2013年1月6日 优先权日2013年1月6日
发明者齐向英, 张向前, 陈宗礼, 陈国梁, 薛皓, 高朋涛 申请人:延安大学