专利名称：一种饲料添加剂，预混料及配合料的制作方法
一种饲料添加剂，预混料及配合料技术领域
本发明属于动物饲料领域，具体涉及一种地衣芽孢杆菌与丁酸钠的组合物作为饲 料添加剂的应用。
背景技术：
丁酸作为哺乳动物大肠中的厌氧微生物发酵产生的一种短链脂肪酸(SCFA)，能为 结肠提供能量，增加小肠绒毛高度，同时丁酸也是肠粘膜细胞的主要能量来源。传统的饲料 添加剂使用丁酸，具有游离性和挥发性的特点，饲料生产中将其制成相对稳定的钠盐-丁 酸钠。丁酸钠无腐蚀性，无臭味，无有害残留性，能够到达更远的肠道，是热门的抗生素替代 品之一。
地衣芽孢杆菌在有氧及无氧环境中均能迅速生长繁殖，同时消耗肠道内的游离 氧，造成肠道内低氧环境，抑制肠道需氧致病菌的生长，并促进肠道有益菌群如双歧杆菌、 拟杆菌、乳酸菌等的生长。
针对当前养殖过程中面临的对动物长期、大量使用抗生素，造成的动物免疫力下 降、药物残留，从而严重威胁动物机体及人类健康等问题，开创无毒副作用、无残留、益生功 能显著的饲料添加剂成为了必然趋势。目前，还未见地衣芽孢杆菌与丁酸钠的饲料添加剂 出现的相关报道，因此，本发明的添加剂组合物，具有重要意义。发明内容
本发明的目的在于提供一种含有地衣芽孢杆菌CGMCC No. 7030与丁酸钠的饲料添 加剂，使益生菌与丁酸钠共同发挥作用，可有效改善动物健康状况，提高饲料转化率。
本发明提供的饲料添加剂是由地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis) CGMCC No. 7030冻干粉、丁酸钠及载体按重量比为O. 25 1. 25 :0. 5 1:1. 75 2混合配制而成的组合 物。
其中，所述地衣芽孢杆菌CGMCC No. 7030每克冻干粉的活菌数为100亿飞00亿。
其中，所述载体为玉米芯粉和/或稻壳粉。
本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)为申请人从鸭肠道中分离得 到。其营养细胞杆状，其芽孢为椭圆或长筒形，产生中生的椭圆形芽孢，孢囊膨大。革兰氏 染色为阳性。在牛肉膏蛋白胨培养基上形成白色，不透明，不规则菌落，边缘毛发状，无褶 皱。接触酶阳性，能利用丙酸盐。能产生多种活性酶，如蛋白酶、纤维素酶等，提高饲料利 用率，增强动物消化酶的活性，促进养殖动物的生长。本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)申请人已于2012年12月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普 通微生物中心，简称CGMCCJia :北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研 究所，保藏编号为CGMCC No. 7030。
本发明的饲料添加剂可添加到常规的畜禽预混料中，如矿物质维生素预混料，因 此，本发明还提供含有所述饲料添加剂的预混料。优选的，所述预混料中饲料添加剂的添加量为4 10%。
本发明的饲料添加剂可添加到常规的畜禽基础日粮中，因此，本发明还提供含有所述饲料添加剂的配合料。优选的，所述配合料中饲料添加剂的添加量为O. 5 1%。。
本发明的突出优点为本发明的地衣芽孢杆菌CGMCC No. 7030，能够通过发酵产生高活性的纤维素酶与蛋白酶，添加进动物饲料中可以增加饲料中蛋白质、纤维素和半纤维素等成分的分解，提高饲料营养成分利用率。
地衣芽孢杆菌CGMCC No. 7030与丁酸钠共同作用，可调节动物肠道结构与菌群，并为动物肠粘膜细胞提供能量。在基础日粮中添加本发明的饲料添加剂，可减少抗生素用量， 无毒副作用、无药物残留，促进饲料转化率降低疾病发生率，有益于动物与人类健康。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1地衣芽孢杆菌CGMCC No. 7030发酵液酶活的测定
将供试菌接种于牛肉膏蛋白胨固体培养基上，30°C培养24h后挑取菌种，悬于O.85%生理盐水中，血球计数板计数调节浓度约5. O X IO7个/mL在装有20mL产酶培养基的 IOOmL三角瓶内接入菌悬液2mL，自然补给氧30°C，170r/min条件下发酵培养24h，液体发酵液在5000r/min条件下离心分离15min,取上清液,即为粗酶液。
纤维素酶产酶培养基配方为蛋白胨O. 9%，酵母膏1. 0%，CMC-NaO. 5%, pH8. O.
蛋白酶产酶培养基配方为蛋白胨1. 0%,酵母膏O. 5%,葡萄糖1. 0%,可溶性淀粉O.5%, KH2P040. 2%, MgSO4 · 7H200. 05%, CaCl2 · 2H200. 02%, ρΗ7· 2。
(I)纤维素酶活力测定
纤维素酶活力测定按照国标ΝΥ/Τ912-2004绘制标准曲线，采用DNS法测定发酵液中的纤维素酶活性。以ImL含l%(w/v)CMC-Na的pH8. O磷酸缓冲液为底物，加入O. 2mL粗酶液，50°C保温30min，然后加入2. 5mL DNS试剂，沸水浴5min，冷却至室温后定容至5. OmL, 利用分光光度计测定波长540nm处的吸光度；以煮沸灭活粗酶液加入上述底物反应液作为空白对照，以底物溶液作为阴性对照；将ImL酶液每分钟产生Ig葡萄糖量定义为I个酶活力单位，U/mL。
经测定，地衣芽孢杆菌CGMCC7030的发酵粗酶液的纤维素酶活为230. 5U/mL。
(2)蛋白酶活力测定
蛋白酶活力的测定采用国标SB/T10317-1999蛋白酶活力测定法中的福林法绘制标准曲线。样品测定取15X IOOmm试管3支，编号1，2，3，每管内加入粗酶液ImL，置于40°C水浴中预热2min，再各加入经同样预热的2%酪蛋白溶液(pH7. 2) ImL,精确保温 lOmin，时间到后，立即再各加入0.4mol三氯乙酸2m L，以终止反应，继续置于水浴中保温 20min,使残余蛋白质沉淀后离心或过滤，然后另取15X 150mm试管3支，编号1，2，3，每管内加入滤液ImL,再加O. 4mol碳酸钠5mL,已稀释的福林试剂ImL摇勻,40°C保温发色20min 后在540nm下测定OD值。空白试验也取试管3支，编号(I)，(2)，(3)，测定方法同上，唯在加2%酪蛋白之前先加O. 4mol三氯乙酸2mL，使酶失活，再加入2%酪蛋白。
蛋白酶活力单位定义为lmL酶 液在40°C，pH7的条件下，每分钟水解酪蛋白产生 I μ g酪氨酸的酶量为一个酶活力单位，以(U/ml)表示。
福林试剂(Folin试剂)的配制方法于200mL磨口回流装置内，加入钨酸钠 (Na2WO4 ·2Η20) IOOg,钥酸钠(Na2MO4 ·2Η20) 25g，蒸馏水 700mL，85%磷酸 50mL，浓盐酸 lOOmL， 文火回流10h。取去冷凝器，加入硫酸锂(Li2SO4) 50g，蒸馏水50m L,混匀，加人几滴液体溴，再煮沸15min，以驱逐残溴除去颜色，溶液应呈黄色而非绿色。若溶液仍有绿色，需要再加几滴澳液，再煮沸除去之。冷却后，定容至IOOOmL,用细菌滤器(2. 2μπι)过滤，置于棕色瓶中保存。此溶液使用时加2倍蒸馏水稀释。即成已稀释的福林试剂。
经测定，每毫升地衣芽孢杆菌CGMCC7030发酵粗酶液的蛋白酶活力为1500U/mL。
产酶试验表明，本发明的地衣芽孢杆菌CGMCC No. 7030,能够通过发酵产生高活性的纤维素酶与蛋白酶，添加进动物饲料中可以增加饲料中蛋白质、纤维素和半纤维素等成分的分解，提高饲料营养成分利用率，同时降低动物粪便中营养物质的含量，减轻对环境的污染，具有很高的饲用价值。
实施例2地衣芽孢杆菌CGMCC No. 7030冻干粉的制备
地衣芽孢杆菌菌粉的制备方法，包括如下的步骤
(I)平板培养复壮将地衣芽孢杆菌菌种接种于平板培养基上，于30°C培养18h， 使地衣芽孢杆菌复壮，并形成单菌落，挑取单菌落于接种平板培养基上，30°C培养24h ；
所述平板培养基配方为胰蛋白胨1%，酵母提取物0. 5%，氯化钠1%，琼脂2%， ρΗ7· 0±0· 2。
(2)—级种子液的制备将步骤(I)培养的地衣芽孢杆菌菌种转接至装有IOmL培养基的试管中，30°C摇床培养16h，转速为170rpm，使处于对数后期，得一级种子液；
(3) 二级种子液的制备将步骤(2)制备的一级种子液按1%接种量接种于装有 75ml培养基的容量为250ml的锥形瓶中，30°C恒温摇床培养16h，转速为170rpm，得二级种子液；
种子培养基配方为胰蛋白胨1%，酵母提取物0. 5%，氯化钠1%，pH7. 0±0. 2。
(4)地衣芽孢杆菌发酵液的制备将步骤(3)中的种子液按接种量为1%接种到 100L的发酵罐中，装样量20%,温度30°C，转速250rpm好氧培养至芽孢生成率80%以上，活菌数为101(lCFU/ml以上，则放罐终止发酵，得地衣芽孢杆菌发酵液；
所述的发酵培养基为麸皮2%，玉米粉I %、豆柏2%，硫酸铵2%，硫酸镁0. 03% ;柠檬酸铵 0. 5%，pH 为 7. 0-7. 4。
(5)地衣芽孢杆菌冻干菌粉的制备将步骤(4)制备的发酵液离心后，在菌泥中加入10%的冻干保护剂(冻干保护剂配方为脱脂奶粉10%，乳糖10%，甘油0. 5%，维生素 CO. 2%，蒸馏水79. 3%)，混匀后冷冻干燥，得到水分含量< 5%的地衣芽孢杆菌菌粉，每克冻干菌`粉中活菌数约为400亿。
实施例3饲料添加剂的制备
将实施例1制备的地衣芽孢杆菌CGMCC No. 7030冻干粉与丁酸钠和玉米芯粉按0.25 1 2的重量比混合均匀，得到一种饲料添加剂。
本例配方比较适合仔猪用，试用效果很好。以本饲料添加剂进行断奶仔猪试验。
L I试验设计
将72头健康的30日龄三元杂交断奶仔猪(杜X长X大)，体重平均为7. 6kg，按公母各半的原则随机分为4组，每组3个重复，每个重复6头猪，组1、组2、组3、组4在饲喂基础日粮的基础上分别添加本饲料添加剂0、0. 5%。、0. 8%。、1%。。
1. 2实验日粮
实验采用玉米-豆柏型日粮，参照NRC (1998)猪饲养标准进行配制。
1. 3饲养管理
试验猪饲养在封闭式猪舍内，水泥地面，通风良好，舍温保持在18_22°C，每天上午和下午各加料至少2次，保证料槽中始终有料，自由采食和自由饮水。按照猪场常规方法进行免疫。
1. 4测定指标
试验进行过程中每日观察仔猪精神状况、排粪情况以及持续时间。腹泻的判断以采集粪样含水量大于10%，不成形为准，分别记录各重复每天仔猪腹泻数，试验第28天晚上停止喂料，照常供水，于次日早上对猪只空腹逐个称重，试验结束后，记录耗料量，计算出平均日增重(ADG)，平均日采食量(ADFI)与腹泻率。
腹泻频率=(腹泻仔猪头数X腹泻天数)/ (试验仔猪头数X试验期天数)X 100%
1. 5数据分析
采用SPSS16. O软件进行数据统计分析。
试验结果用平均值土标准差表示，采用单因子方差分析，各处理间平均值的比较采用LSD多重比较进行差异显著性检验，以p〈0. 05为差异显著。
2试验结果
本饲料添加剂对仔猪生产性能的影响见下表
表I本饲料添加剂对仔猪生产性能的影响
权利要求
1.一种饲料添加剂，其特征在于，该饲料添加剂是由地衣芽孢杆菌(BacillusLicheniformis)CGMCC No. 7030 冻干粉、丁酸钠及载体按重量比 O. 25 1. 25 :0. 5 1:1. 75 2混合配制而成的组合物。
2.根据权利要求1所述的饲料添加剂，其特征在于，地衣芽孢杆菌CGMCCNo. 7030每克冻干粉的活菌数为100亿 500亿。
3.根据权利要求1所述的饲料添加剂，其特征在于，所述的载体为玉米芯粉和/或稻壳粉。
4.含有权利要求f3任一项所述的饲料添加剂的预混料，其特征在于，所述预混料中饲料添加剂的添加量为4 10%。
5.含有权利要求Γ3所述的饲料添加剂的配合料，其特征在于，所述配合料中饲料添加剂的添加量为O. 5 1%。。
全文摘要
本发明公开了一种饲料添加剂，该饲料添加剂是由地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)CGMCC No.7030冻干粉、丁酸钠及载体按重量比0.25~1.250.5~11.75~2混合配制而成的组合物。本发明的突出优点为地衣芽孢杆菌CGMCC No.7030能够通过发酵产生高活性的纤维素酶与蛋白酶，添加进动物饲料中可以增加饲料中蛋白质、纤维素和半纤维素等成分的分解，提高饲料营养成分利用率。地衣芽孢杆菌CGMCC No.7030与丁酸钠共同作用，可调节动物肠道结构与菌群，并为动物肠粘膜细胞提供能量。在基础日粮中添加本发明的饲料添加剂，可减少抗生素用量，无毒副作用、无药物残留，促进饲料转化率降低疾病发生率，有益于动物与人类健康。
文档编号A23K1/16GK103039716SQ20131000932
公开日2013年4月17日 申请日期2013年1月10日 优先权日2013年1月10日
发明者王凡, 李晓清, 刘婷, 陈丽仙, 王安如 申请人:北京大北农科技集团股份有限公司, 漳州大北农农牧科技有限公司, 哈尔滨大北农牧业科技有限公司