专利名称：一种促进带叶兜兰种子共生萌发的真菌及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种促进带叶兜兰种子共生萌发的真菌及其应用。
背景技术：
兜兰属(Paphiopedilum)植物，花形奇特，花色艳丽，是人们最喜爱的兰科植物之一，人们常称兜兰为“拖鞋兰”、“仙履兰”。近十几年来，由于猖獗走私以及生境破坏等原因，野生兜兰的数量急剧减少，分布区逐渐萎缩，不少种类已经到了灭绝的边缘。为了缓解对野生植株的采集压力，保护濒危物种，以及满足人们对兜兰属植物的需求，国内外学者对兜兰植物的人工繁殖进行了大量地研究。目前，部分兜兰种类的无菌播种和组织培养技术已获成功，但无菌苗栽培后生长缓慢，成活率低，制约着兜兰的人工繁育。在自然条件下，兰科植物种·子需要有合适的菌根真菌侵染，为其提供营养才能正常萌发，并帮助植物度过脆弱的幼苗期长成植株。国内外学者利用兰科菌根真菌与其种子进行共生萌发的技术已用于多种兰科植物，但因为兜兰属植物菌根真菌分离培养困难，尚缺乏可以与3 兰种子共生萌发的菌株。
发明内容
本发明的目的是提供一种促进带叶兜兰种子共生萌发的真菌及其应用。本发明提供的菌株PhI17，经形态学和分子生物学鉴定为担子菌亚门胶膜菌科的瘤菌根菌属(Epulorhiza sp.)，已于2012年11月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC N0.6756。所述菌株PhI17可用于促进带叶兜兰种子萌发。本发明还保护一种促进带叶兜兰种子萌发的方法，包括如下步骤:将所述菌株PhI17和带叶兜兰种子共培养。所述共培养具体可在燕麦培养基上进行。所述共培养的条件具体可为:23°C黑暗培养。所述菌株PhI17可用于促进带叶兜兰幼苗生长。本发明还保护一种带叶兜兰育苗方法，包括如下步骤:将所述菌株PhI17和带叶兜兰种子共培养，直至种子萌发并长出真根。所述共培养具体可在燕麦培养基上进行。所述共培养的条件具体可为:23°C黑暗培养。所述育苗方法还可包括将长出真根的幼苗移栽至燕麦培养基进行23°C光照培养的步骤。所述育苗方法还可包括如下步骤:进行所述光照培养直至幼苗叶片长度大于3cm，然后将所述幼苗移栽至混合基质中，25°C培养(每天12小时光照，12小时黑暗)。所述燕麦培养基的具体制备方法如下:将8g燕麦片加入蒸懼水中，煮沸30分钟，纱布过滤后收集滤液，用蒸懼水定容至1000ml,再加入IOg琼脂和0.05g氯霉素。将所述菌株PhI17与带叶兜兰种子共培养可以成功促进带叶兜兰种子萌发，并进一步促进幼苗发育，长出能进行光合作用的叶片，将幼苗移栽至基质培育，幼苗均能存活且生长良好。采用本发明提供的方法促进带叶兜兰种子萌发或进行带叶兜兰育苗，操作简单、成本低廉。本发明对于带叶兜兰的人工繁育有重要的经济价值。
图1为菌株PhI17的形态。图2为菌株PhI 17和带叶兜兰种子共生培养75天的照片。图3为将长出真根的原球茎移至装有燕麦培养基的三角瓶，23°C培养过程中幼苗的照片。图4为将幼苗移栽至混合基质，25°C培养过程中幼苗的照片。
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。带叶览兰(P.hirsutissimum):参考文献:刘仲健，陈心启，陈利君等，中国5 兰属植物.2009,北京:科学出版社.pp93-100。燕麦培养基的制备方法:将8g燕麦片加入蒸馏水中，煮沸30分钟，用纱布过滤并收集滤液，用蒸懼水定容至1000ml,再加入IOg琼脂和0.05g氯霉素,加热搅拌至琼脂 溶解，分装后121°C湿热灭菌20分钟。混合基质的制备方法:将等体积的沙子和蛭石混合，表面覆盖一层苔藓。实施例1、菌株的获得、鉴定与保藏一、菌株PhI 17的获得取生长良好的野外采集的带叶览兰(P.hirsutissimum)营养根段，将其根段绒毛状根被轻轻剥去，在自来水下冲洗干净。光学显微镜下镜检，选出形成丰富菌丝团的根段。在超净工作台上，用75%的酒精浸泡30s，再用1%的NaClO根表灭菌4min，无菌水清洗3-4次，用无菌滤纸吸干水分。用灭菌刀片将根段切成若干厚度约0.5mm的薄片，平铺于I / 5PDA分离培养基上，25°C培养箱培养。当菌丝从根片上长出后，转移至PDA培养基进行纯化培养，最后以POA培养基试管斜面4°C保存。每升I / 5PDA分离培养基是由40g去皮马铃薯，4g葡萄糖，17g琼脂和IOOOml蒸馏水组成。倒平板前，待培养基温度降到45°C左右加入硫酸链霉素(50 μ g/ml)和氨苄青霉素(50 μ g/ml)。每升POA培养基是由50g去皮马铃薯、8g燕麦片、17g琼脂、0.05g氯霉素、1000ml蒸馏水组成。将分离得到的一株纯培养的菌株命名为菌株PhI 17。二、菌株的鉴定1、形态鉴定菌株PhI17的形态见图1。图1A显示菌株PhI17在PDA培养基上的菌落特征。图IB显示菌株PhI 17在光学显微镜下的菌丝特征。菌株PhI 17的菌落乳白色，菌丝较发达，生长后期菌落中间偶出现菌丝黏滑，菌丝直角分支，近分支处有隔膜，不产生孢子，为典型的Rhizoctonia-1ike 真菌。2、分子鉴定挑取燕麦液体培 养基培养的菌株PhI 17的菌丝球，无菌滤纸吸干多余水分，使用普通植物基因提取试剂盒(TIANGEN，China)提取rDNA。利用ITSl / ITS4对真菌rDNA上的ITS区域进行PCR扩增。扩增反应体系(25 μ I)包括:16.25 μ I ddH20, 2.5 μ 110XPCRbuffer,2.5 μ I dNTP (2.5mM),I μ I ITSl (IOmM),I μ I ITS4 (10mM)，0.25 μ I Taqpolymerase, 1.5 μ I DNA。PCR扩增反应程序为:95 °C预变性5min后进入30个循环(即950C 30s, 500C 30s，72。。30s)，循环完成后，72°C延伸IOmin0取4 μ I扩增产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，有明亮单一条带的扩增产物送北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序。测序结果如序列表中序列I所示。将测序结果在GenBank(www.ncb1.nlm.nih.gov/BLAST)进行在线比对，该菌株与JQ713581 (Tulasnella sp.)的相似性较高，为97%。根据以上形态和分子特征,菌株PhI17属于瘤菌根菌属(Epulorhiza sp.)。菌株PhI17已于2012年11月01日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为 CGMCC N0.6756。实施例2、菌株PhI17与带叶兜兰种子的共生萌发一、带叶兜兰种子的获得采集野外自然结实，生长发育良好，果实饱满，七八成熟且未开裂的带叶兜兰蒴果，用75%酒精棉反复擦拭蒴果表面除去果皮绒毛，在超净工作台上，用75%的酒精浸泡30s,再用4.5%的NaClO灭菌8min，无菌水清洗3_4次。将蒴果置于事先放置无菌滤纸的培养皿内，一只手用镊子夹住蒴果，另一只手用解剖刀纵切果实，取出种子。取少量种子观察有胚率，确保用于试验的种子有胚率大于80%。二、菌株PhI17的琼脂块的获得挑取PhI17菌落接种至PDA培养基平板上，25°C培养箱培养8天，用灭菌后的打孔器打孔，得到直径约0.5cm、表面覆盖菌株PhI17的菌丝的琼脂块。三、菌株PhI17与带叶兜兰种子的共生萌发1、无菌条件下，在燕麦培养基平板上放射状排列放置I X 3.5cm的滤纸条(Shuangquanpai 102, China)5片,用小药勺将带叶5 兰种子均勻洒在滤纸条上,每片滤纸条上40-80粒种子。2、分组处理实验组:在燕麦培养基平板中心接种一个步骤二得到的琼脂块，用封口膜密封后23 °C黑暗培养。对照组:在燕麦培养基平板中心接种直径约0.5cm的无菌PDA琼脂块，用封口膜密封后23 °C黑暗培养。进行三次重复实验，每次重复实验中每个处理包括三个燕麦培养基平板。共生培养过程中，持续观察带叶兜兰种子的萌发情况并拍照。共生培养75天的照片见图2。图2中的阿拉伯数字表示带叶兜兰种子和原球茎所处的发育阶段；0代表阶段O，即种皮完好，未萌发；1代表阶段1，即种胚膨大，种皮破裂；2代表阶段2，即种胚继续膨大，假根毛出现；3代阶段3，即表叶原基出现；4代表阶段4，即第一片叶出现；5代表阶段5，即真根出现。共生培养35天时，带叶兜兰种子明显膨大，突破种皮。共生培养55天时，第3阶段的原球茎出现。共生培养75天时，第5阶段的原球茎出现。共生培养75天后在超净工作台上用体视显微镜统计所有种子中处于不同萌发阶段的种子的比率。进行三次重复实验，结果取平均值。结果见表I。表I共生培养75天后处于不同萌发阶段的种子的比率
权利要求
1.株(Epulorhizasp.)PhI17，它的保藏编号为 CGMCC N0.6756。
2.权利要求1所述的菌株在促进带叶兜兰种子萌发中的应用。
3.权利要求1所述的菌株在促进带叶兜兰幼苗生长中的应用。
4.一种促进带叶兜兰种子萌发的方法，包括如下步骤:将权利要求1所述的菌株和带叶兜兰种子共培养。
5.一种带叶兜兰育苗方法，包括如下步骤:将权利要求1所述的菌株和带叶兜兰种子共培养，直至种子萌发 并长出真根。
全文摘要
本发明公开了一种促进带叶兜兰种子共生萌发的真菌及其应用。本发明提供的菌株PhI17，鉴定为瘤菌根菌属(Epulorhiza sp.)，保藏号为CGMCC No.6756。将所述菌株PhI17与带叶兜兰种子共培养可以成功促进带叶兜兰种子萌发，并进一步促进幼苗发育，长出能进行光合作用的叶片，将幼苗移栽至基质培育，幼苗均能存活且生长良好。采用本发明提供的方法促进带叶兜兰种子萌发或进行带叶兜兰育苗，操作简单、成本低廉。本发明对于带叶兜兰的人工繁育有重要的经济价值。
文档编号A01G1/00GK103087927SQ20131002137
公开日2013年5月8日 申请日期2013年1月21日 优先权日2013年1月21日
发明者刘红霞, 孙晓颖, 毛益婷, 罗毅波 申请人:北京林业大学