专利名称：一种枯草芽孢杆菌9a及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及农业微生物技术领域，具体地涉及一种枯草芽孢杆菌9A及其应用。
背景技术：
胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporioides)引起的祀果炭疽病是祀果生产上的主要病害之一，在世界上各杧果产区均有发生。该病菌能侵染杧果的叶梢、花穗及果实，引起梢枯、叶斑、落叶、落花和落果等，并且该菌具有潜伏侵染特性，在采后贮运期可引起果皮出现黑斑块及果实腐烂，大大缩短商品杧果的货架期。目前该病主要采用化学药剂来防治，但长期使用化学农药会使病原菌产生抗药性，并带来污染环境和农药残留的安全问题，因此，开发和利用自然界存在的生防菌具有重要的实践意义。细菌在地球分布广泛，种类繁多，资源丰富，利用拮抗细菌作为作物病害防治材料具有明显的资源优势。
发明内容
本发明的目的是提供一株可用于防治杧果炭疽病的枯草芽孢杆菌及菌剂。本发明又一目的是提供上述枯草芽孢杆菌及其菌剂在防治植物炭疽病的应用。本发明的枯草芽孢杆菌9A (Bacillus subtilis)已于2012年12月3号保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC ;地址:中国.武汉.武汉大学；邮编:430072)，保藏编号 CCTCC N0.M2012493。
本发明提供的枯草芽孢杆菌9A菌剂的活菌数为109cfu/ml。优选3_8X 109cfu/ml ο所述枯草芽孢杆菌9A菌剂的制备方法，包括以下步骤:(I)菌株活化:将枯草芽孢杆菌9A接种于固体培养基上，于25°C -28°C下培养1_2天;(2)发酵种子培养:将上述活化菌株接种于液体培养基中，于25°C -28°c下振荡培养12-24小时，制得种子液；(3)菌剂发酵:将上述种子液接种到菌剂发酵培养液中，25°C _28°C下振荡培养48-72小时，制得枯草芽孢杆菌9A的菌剂。菌株活化培养用固体培养基配方为:牛肉膏5.0g，蛋白胨l0.0g，NaC15.0g，蒸馏水 IOOOmL,琼脂粉 15g，ρΗ7.0-7.2。菌株发酵种子培养用液体培养基配方为:牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g, NaC15.0g,蒸馏水 IOOOmL, ρΗ7.0-7.2。菌剂发酵培养液配方:南瓜汁(200g南瓜煮汁)IOOOmL,葡萄糖10g，蛋白胨10g。其中，步骤(3)中种子液的接种量为0.05-0.1% (体积百分比)。本发明提供的枯草芽孢杆菌9A及其发酵液菌剂对杧果炭疽病病菌菌丝有抑制生长和致畸作用，对杧果炭疽病病菌的分生孢子有抑制萌发和致死作用。本发明提供的枯草芽孢杆菌9A的菌剂用于植物炭疽病，尤其是杧果炭疽病的防治。本发明的有益效果是:本发明所述枯草芽孢杆菌9A及其菌剂对杧果炭疽病病菌生长有抑制作用，对其分生孢子有强烈的抑制作用甚至致死作用，在施用对象表面能形成一层保护膜阻止病菌侵入，有效减少杧果炭疽病的发生，并且对杧果无药害，对环境无污染，具有良好的生物农药开发前景。
图1为枯草芽孢杆菌9A在PDA平板上的菌落形态； 图2为透射电镜观察枯草芽孢杆菌9A菌体形态；图3为枯草芽孢杆菌9A发酵液滤液对杧果炭疽菌菌丝生长的抑制作用；A为杧果炭疽菌菌丝正常生长情况，B为混有9A培养滤液时炭疽菌菌丝的生长情况；图4为枯草芽孢杆菌9A发酵液滤液对杧果炭疽菌菌丝形态的影响；A为炭疽菌正常菌丝形态，B为9A培养滤液处理后的菌丝形态；图5为枯草芽孢杆菌9A发酵液滤液对杧果炭疽菌分生孢子的萌发抑制作用；A为正常萌发的炭疽菌孢子为用9A培养滤液处理后的炭疽菌孢子；图6为枯草芽孢杆菌9A发酵液对杧果离体果实炭疽病的防治效果；A为无菌水处理的离体果实为9A菌剂处理的离体果实；图7为枯草芽孢杆菌9A发酵液对杧果离体叶片炭疽病的防治效果；A为无菌水处理对照的离体叶片；B为9A菌剂处理的离体叶片。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。实施例1枯草芽孢杆菌9A的分离、筛选及鉴定1.1细菌的分离用经灭菌的毛笔在瓜叶白粉病病斑上轻扫，扫落物落于PDA培养基平板上，置于培养箱中26°C自然光照培养。培养期间定期观察，对外观形态颜色明显差异的细菌菌落进行纯化，保存备用。PDA培养基配方:马铃薯200g，葡萄糖10g，琼脂16g，蒸馏水1000ml。1.2拮抗菌株9A的筛选获得初筛:采用平板对峙生长法以一株杧果炭疽菌作为指示菌在PDA平板上对1.1中分离纯化得到的各细菌菌株进行拮抗筛选，将具有拮抗作用的菌株保存备用。复筛:将初筛获得的拮抗菌株在牛肉膏蛋白胨固体培养基上培养48_72h,取各菌苔一环分别接入IOOmL种子培养液中培养12_48h作种子液，再分别吸取100 μ L种子液注入150ml菌剂发酵培养液中，置于摇床中28°C、180r/min条件培养48-120h。取各培养液于10000r/min离心lOmin，取上清液经0.22 μ m滤膜过滤得上清滤液，吸取各上清滤液与温度约为45°C PDA培养基混合制成含上清滤液浓度为8%的平板，采用生长速率法筛选出对杧果炭疽菌菌丝生长抑制作用最强的菌株，得到目标菌株9A。牛肉膏蛋白胨固体培养基配方:牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g，NaC15.0g，蒸馏水lOOOmL，琼脂粉 15g, ρΗ7.0-7.2。种子培养液配方:牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g, NaC15.0g,蒸馏水IOOOmL,ρΗ7.0-7.2。菌剂发酵培养液配方:南瓜汁(200g南瓜煮汁)lOOOmL，葡萄糖10g，蛋白胨10g。1.3枯草芽孢杆菌9A的鉴定形态观察的结果表明，菌株9A在PDA培养基上菌落白色，椭圆形，边缘整齐，表面干燥，不透明。透射电镜观察结果表明，9A菌体杆状，周生鞭毛。生理生化测定结果为触酶试验阳性、v-p试验阳性、淀粉水解酶阳性、甲基红试验阴性、苯丙氨酸酶试验阴性、酪氨酸酶试验阴性、D-葡萄糖L-阿拉伯糖D-木糖D-甘露醇产酸阳性产气阴性、10%NaCL生长阳性、50°C生长阴性、45°C生长阳性、10°C生长阳性、5°C生长阴性、游动性试验阳性、纤维素酶阴性、硝酸盐还原阳性、反硝酸还原阴性、乙醇氧化阴性、脂酶(吐温80)阴性、卵黄脂酶阳性。16SrDNA序列分析结果表明，该菌的16SrDNA序列与一些已报道的枯草芽孢杆菌具有较高的同源性。综合以上结果，将菌株9A鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。实施例2枯草芽孢杆菌9A发酵液的制备(I)菌株活化:将枯草芽孢杆菌9A接种于固体培养基上，于25V _28°C下培养I天;(2)发酵种子培 养:将上述活化菌株的菌苔一环接种于IOOml的种子培养液体培养基中，于25°C -28°C下180r/m振荡培养12小时，制得种子液；(3)菌剂发酵:按0.05% (V/V)的接种量，将上述种子液接种到菌剂发酵培养液中，25°C -28°C下180r/m振荡培养48小时，制得枯草芽孢杆菌9A的菌剂(活菌数约为
3.0X109cfu/ml)o菌株活化培养用固体培养基配方为:牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g, NaC15.0g，蒸馏水 IOOOmL,琼脂粉 15g，ρΗ7.0-7.2。菌株发酵种子培养用液体培养基配方为:牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g, NaC15.0g,蒸馏水 IOOOmL, ρΗ7.0-7.2。菌剂发酵培养液配方:南瓜汁(200g南瓜煮汁)lOOOmL，葡萄糖10g，蛋白胨10g。实施例3枯草芽孢杆菌9A发酵液的制备(I)菌株活化:将枯草芽孢杆菌9A接种于固体培养基上，于25°C _28°C下培养2天;(2)发酵种子培养:将上述活化菌株的菌苔一环接种于IOOml的种子培养液体培养基中，于25°C -28°C下180r/m振荡培养24小时，制得种子液；(3)菌剂发酵:按0.1% (V/V)的接种量，将上述种子液接种到菌剂发酵培养液中，25°C -28°C下180r/m振荡培养72小时，制得枯草芽孢杆菌9A的菌剂(活菌数约为
8.0X109cfu/ml)o菌株活化培养用固体培养基配方为:牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g, NaC15.0g，蒸馏水 IOOOmL,琼脂粉 15g，ρΗ7.0-7.2。
菌株发酵种子培养用液体培养基配方为:牛肉膏5.0g，蛋白胨10.0g, NaC15.0g,蒸馏水 IOOOmL, ρΗ7.0-7.2。菌剂发酵培养液配方:南瓜汁(200g南瓜煮汁)IOOOmL,葡萄糖10g，蛋白胨10g。实施例4枯草芽孢杆菌9A发酵液滤液对杧果炭疽菌菌丝生长以及孢子萌发的影响4.1枯草芽孢杆菌9A发酵液滤液对杧果炭疽菌菌丝生长的抑制作用在PDA平板上打孔，注入实施例2制备的枯草芽孢杆菌9A发酵液的离心上清液经
0.22 μ m滤膜过滤得到的发酵液滤液，于距孔25mm处接上杧果炭疽菌菌块，于26°C培养箱中培养，待出现抑菌带时，挑取抑菌带上的菌丝于显微镜下观察。如图3、图4所示，结果表明，枯草芽孢杆菌9A发酵液滤液可抑制炭疽菌菌丝生长，导致炭疽菌菌丝形态发生改变如菌丝分枝增多、扭曲、膨大等。4.2枯草芽孢杆菌9A发酵液滤液对杧果炭疽菌分生孢子萌发的抑制作用取实施例2制备的枯草芽孢杆菌9A发酵液的离心上清液经0.22 μ m滤膜过滤得到的发酵液滤液与温度 约为45°C PDA培养基混合制成含发酵液滤液浓度为1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、10%的平板，吸取分生孢子悬浮液0.1mL在平板表面均匀涂布，于26°C培养箱中培养，分别于8h、18h、36h、72h、240h进行观察记录，如图5所示，结果表明浓度为4%的滤液可完全抑制炭疽菌分生孢子的萌发。实施例5枯草芽孢杆菌9A发酵液对杧果叶片炭疽病的防治效果5.1枯草芽孢杆菌9A发酵液对离体叶片炭疽病的防治效果测定取大小相近无病健康的嫩叶摆于篮内，在中叶脉两边叶面上用记号笔各画三个直径约3mm的圆圈，在各圆圈上涂抹实施例2制备的枯草芽孢杆菌9A发酵液，24小时后人工接种杧果炭疽菌分生孢子悬浮液。每叶共六个圆圈，重复12张叶片。以无菌水及咪鲜胺水乳剂(有效成分450g/L)1000倍液代替枯草芽孢杆菌9A发酵液作对照，套袋保湿于26°C培养箱中培养，观察各处理发病情况。如图6所示，结果表明，接种后第五天无菌水对照组发病率为100%，枯草芽孢杆菌9A发酵液及咪鲜胺处理组未见发病。5.2枯草芽孢杆菌9A发酵液对杧果叶片炭疽病的田间防治试验在树冠圆周各方向随机选取无病斑嫩梢,喷施实施例2制备的枯草芽孢杆菌9A发酵液至叶面均匀湿润，24小时后喷雾接种杧果炭疽菌分生孢子悬浮液至叶面均匀湿润，处理完毕后用塑料袋套梢，重复9梢，以无菌水及咪鲜胺水乳剂(有效成分450g/L) 1000倍液代替枯草芽孢杆菌9A发酵液作对照，于第七天从每梢上随机抽5叶调查发病情况。结果表明，于接种后第七天无菌水对照组病情指数达88.33%，咪鲜胺组病情指数为20%，防病效果为77.36%，枯草芽孢杆菌9A发酵液组病情指数平均为15.00%,防病效果为83.02%。枯草芽孢杆菌9A发酵液的防效显著高于对照药剂咪鲜胺1000倍液的防治效果。实施例6枯草芽孢杆菌9A发酵液对杧果果实炭疽病的防病效果6.1枯草芽孢杆菌9A发酵液对离体果实炭疽病的防治效果测定取大小相近无病健康的嫩果摆于篮内，于朝上一面用记号笔画一直径约3mm的圆圈，在各圆圈上涂抹实施例2制备的枯草芽孢杆菌9A发酵液，24小时后人工接种杧果炭疽菌分生孢子悬浮液，重复20个果实，以无菌水及咪鲜胺水乳剂(有效成分450g/L)1000倍液代替枯草芽孢杆菌9A发酵液作对照，套袋保湿于26°C培养箱中培养，观察果实发病情况。如图7所示，结果表明，接种后第五天无菌水对照组发病率为100%，枯草芽孢杆菌9A发酵液及咪鲜胺处理组未见发病，枯草芽孢杆菌9A发酵液与咪鲜胺1000倍液对离体果实炭疽病的防治效果相当。6.2枯草芽孢杆菌9A发酵液对杧果果实炭疽病的田间防治试验在树冠周下各方向随机选取表面无病斑青果用清水擦洗晾干，全果涂抹实施例2制备的枯草芽孢杆菌9A发酵液至果实底尖出现液滴，24小时后喷雾接种杧果炭疽菌分生孢子悬浮液至果实表面布满孢子液并在果实底尖形成液滴滴下为止，处理完毕后用塑料袋套果，在塑料袋与果实之间留空间，重复15果，以无菌水及咪鲜胺水乳剂(有效成分450g/L) 1000倍液代替枯草芽孢杆菌9A发酵液作对照，观察发病情况。结果表明，于接种后第七天无菌水对照组病情指数平均达94.08%,咪鲜胺组病情指数平均为20%，防病效果为78.82%，枯草芽孢杆菌9A发酵液组病情指数平均为1.48%，防病效果为98.41%。枯草芽孢杆菌9A发酵液的防病效果显著高于对照药剂咪鲜胺1000倍液的防治效果。
对于实施例4-6中，将实施例2制备的枯草芽孢杆菌9A发酵液替换为实施例3制备的枯草芽孢杆菌9A发酵液，具有同样的应用效果。虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
权利要求
1.一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 9A，其保藏号为 CCTCC N0.M2012493o
2.含有权利要求1所述枯草芽孢杆菌9A的菌剂。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂的活菌数为109cfu/ml。
4.权利要求2或3所述菌剂的制备方法，包括以下步骤:(1)菌株活化:将枯草芽孢杆菌9A接种于固体培养基上，于25°C-28°C下培养1_2天； (2)发酵种子培养:将上述活化菌株接种于液体培养基中，于25°C_28°C下振荡培养12-24小时，制得种子液； (3)菌剂发酵:将上述种子液接种到菌剂发酵培养液中，25°C_28°C下振荡培养48-72小时，制得枯草芽孢杆菌9A的菌剂。
5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(I)中所述固体培养基为:牛肉膏 5.0g，蛋白胨 10.0g, NaC15.0g，蒸馏水 lOOOmL，琼脂粉 15g，ρΗ7.0-7.2。
6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述种子培养的液体培养基为:牛肉膏 5.0g，蛋白胨 10.0g, NaC15.0g，蒸馏水 IOOOmL, ρΗ7.0-7.2。
7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中所述菌剂发酵培养液配方为:南瓜汁1000mL，葡萄糖IOg,蛋白胨IOg0
8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤(3)中种子液的接种量为0.05-0.1%。
9.权利要求1所述枯草芽孢杆菌9A、权利要求2或3所述菌剂在防治植物炭疽病中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述植物炭疽病为杧果炭疽病。
全文摘要
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌9A及其应用。所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)9A，其保藏号为CCTCC No.M2012493，并提供了所述枯草芽孢杆菌9A菌剂的制备方法。本发明的枯草芽孢杆菌9A及其菌剂对杧果炭疽病病菌生长有抑制作用，对其分生孢子有强烈的抑制作用甚至致死作用，在施用对象表面能形成一层保护膜阻止该病菌侵入，有效减少杧果炭疽病的发生，并且对杧果无药害，对环境无污染，具有良好的生物农药开发前景。
文档编号A01P3/00GK103114055SQ20131002094
公开日2013年5月22日 申请日期2013年1月21日 优先权日2013年1月21日
发明者莫贱友, 潘朝勃, 李其利, 郭堂勋, 黄穗萍 申请人:广西壮族自治区农业科学院植物保护研究所