专利名称：一种悬浮液接种培育夏块菌根苗的方法
技术领域：
本发明涉及一种菌根苗人工接种培育方法，尤其涉及一种悬浮液接种培育夏块菌根苗的方法。
背景技术：
块菌通常与林木根系具有共生关系，是重要的野生食用菌，其子囊果含有较高的营养成分，商业价值为世人所瞩目。法国、意大利的黑孢块菌(Tuber melanosporum)和白块菌(Tuber magnatum)在国际市场上价格贵如白金,并已经成为当地文化的重要组成部分。夏块菌(拉丁学名:tube aestivum vitt.)，子囊果呈不规则球形，基部常有凹陷，直径3-6cm，表面具有5-6边的角形疣凸，疣的直径可达0.5cm，较黑孢块菌和印度块菌子囊要表面特征明显。内部(孢体)苍白色，后呈奶油色或褐黄色，内有相互交连和分枝的脉络。国内目前已经发现了印度块菌、夏块菌、白块菌等20余种块菌种类，主要分布于我国西南各省，出产季节为每年的10月一第2年2月，幼时白色至灰白色，成熟呈黑色或者褐色，具有清晰的乳白色菌脉，食之味美，含有丰富的蛋白质及多种维生素，尤其是维生素
A、维生素B2含量极高。由于块菌的生长必需与合适的宿主植物根系营共生生活，否则将无法形成子囊果，这就意味着人工栽培块菌离不开活体宿主植物，因而块菌人工栽培比较困难，技术含量高，要实现块菌的人工栽培必须首先突破菌根南的培育技术。国内虽然对我国的中国块菌和印度块菌在生理生态方面的研究较多，对其块菌菌根首合成培育技术也有初步研究和报道。但是，技术在实验室操作性过多，生产操作性不强，而且夏块菌菌根苗培育技术鲜有见报道。接近的专利发明《一种块菌与菌根合成方法》，专利申请号200810058447.9 存在问题一:《一种块菌与菌根合成方法》供试树种单一，块菌菌种单一。方法中只涉
及了针叶树种，未涉及阔叶树种；方法中只涉及了中国块菌，即印度块菌，未涉及国际公认价值较高的夏块菌、白块菌。存在的问题二:无菌苗培育。《一种块菌与菌根合成方法》中无菌苗基质采用灭菌I小时的珍珠岩和蛭石(1/1混合)，能够保证苗木培育中的透水性，但不能解决苗木生长的养分营养需求问题，苗木生长缓慢，并且基质灭菌时间不够，容易出现污染。而且无菌苗培育应该在高架相对封闭的温室内进行培育，才能保障无菌苗培育过程中不受其它杂菌尤其是真菌的侵染。存在的问题三:《一种块菌与菌根合成方法》中接种基质配方为腐殖质、水、蛭石1/1/1混合，PH值调整到7.0。实际上不同树种间基质配比差异性较大，就印度块菌的华山松菌根苗而言，过筛红土与蛭石按1/1混合效果好得多，而土壤PH值调整应当在6.5-7.0的区间范围内。存在的问题四:《一种块菌与菌根合成方法》菌剂制备和接种技术苗圃操作性不强，易造成2次污染。一是块菌子囊果取出后，未对其表面灭菌，其子囊果表面可能含有的其它真菌和泥土是不能无菌水洗掉的，可能造成菌根苗的直接污染。二是接种方式采取的是蘸根，接种液的浓度也偏小，蘸取过程中因为根系发育等不一致，将造成接种各苗之间孢子量不对称。存在的问题五:《一种块菌与菌根合成方法》缺乏炼苗过程。《一种块菌与菌根合成方法》中菌根苗培育是直接放置在自然通风的大棚内进行，在苗木培育初始的15-30天，需要相对空间无菌的空间进行炼苗，块菌菌根形成效果会更稳定，杜绝初期受外界杂菌的
竞争影响。
发明内容
本发明的目的就在于提供一种解决上述问题，针对夏块菌菌根苗的人工接种培育方法。为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是:一种悬浮液接种培育夏块菌根苗的方法，包括如下步骤，
(1)培育宿主植物苗，具体如下，
A、采集、遴选宿主植物种子；
所述宿主植物选用云南松、华山松、板栗之一种；
B、处理宿主植物种子；
将步骤A收集的种子水选去出空壳，用30%的H2O2浸泡处理40分钟后，用蒸馏水冲洗，直至无H2O2气味为止；
C、制备培养基；
将蛭石与泥炭土按体积比1:1混合装入育苗框内，经高温121-126 高压1.5kg/cm2灭菌2小时以上，形成无菌基质育苗框；
D、培育宿主植物；
将经步骤B处理后的植物种子及时播入无菌基质育苗框内，然后放置于温室内催芽，出芽后移入大棚育株，直至长出根苗；
(2)制备菌剂，具体如下，
A、收集和保存菌种；
采集夏块菌子实体，先用刷体轻轻洗净表面泥土，再在75%的酒精中浸泡3min对其表面灭菌，同时再在酒精灯火焰上快速灼烧，继续灭菌，然后置于经高温高压灭菌后的河沙中，于3-5°C的温度下冷藏保存备用，所述河沙采用高温121-126°C高压1.5kg/cm2灭菌2小时以上；
B、制备菌剂；其配制方法如下，
第一步，先称取一定量的块菌，用75%的酒精中浸泡1-3分钟对其表面灭菌，然后再在酒精灯火焰上快速灼烧，继续灭菌，置于灭菌后的操作台上，用酒精灭菌后的打浆机将其粉碎成粒径小于Imm悬浮液，使菌种的孢子出壳，悬浮液中块菌与蒸馏水体积比为1:5 ；第二步，将高吸水性丙烯酸树脂与块菌悬浮液按体积比1:400配制；
第三步，将吲哚乙酸速溶后配制60PPM浓度的蒸馏水溶液；
第四步，将第二步制作的悬浮液与第三步制作的蒸馏水溶液按体积比1:1配制成块菌接种剂；
(3)接种，采用悬浮液接种法，具体如下，A、整理育好的宿主植物苗，减去多余的根、叶；
B、在接种杯内填入经消毒杀菌的无菌土，无菌土填装量约占接种杯容积的1/3，再将宿主植物苗放入杯中央；
C、向宿主植物苗根部撒上块菌悬浮液菌剂，使之附着在根系上；
D、装填接种培育基质，将根系覆盖；
(4)炼苗；
刚接种块菌的植株先放置于温度在15_25°C之间，基质的湿度保持在50-80%的炼苗室内育苗架上培育15-30天，使菌种在宿主上寄生成功；
(5)培育菌根苗；
将已经寄生成功的植株移出到玻璃大棚的育苗架上培育6-24个月，成为可供大田栽培的商品苗。作为优选，所述无菌苗培育的步骤C中，所述云南松、华山松种子均匀撒播在育苗框内，上覆Icm灭菌基质，而板栗种子采用点播在育苗框内，上覆2-3cm灭菌基质，用清水将基质浇透后放置于温度25°C的温室中进行催芽，待80%以上的种子发芽后再移入温度为10-35°C的大棚中进行植株培育，同时将基质的湿度保持在50 - 80%。
作为优选，所述菌剂制备步骤中，菌种的一般保存期为1-3个月；若长期保存，要置于-18°C的冷冻室内真空保存。作为优选，所述接种步骤D中，所述接种培育基质使用高温121_126°C高压1.5kg/cm2灭菌2小时以上的无菌基质，根据树种的差异，云南松宜采用的泥炭土与蛭石比例按体积比1:1混合；华山松和板栗宜采用的自然土与蛭石比例按体积比1:1混合；基质的PH值用生石灰调节，维持在7.5。作为优选，所述遴选宿主植物种子的方法是，云南松和华山松用水选去除空壳后晾干后常温储藏备用；板栗种子水选去除霉烂和不饱满的种子，晾干表面水分，再与湿度为25 - 35%的洁净河沙按体积比1:2的比例混合，并置于5°C的冰箱中保存备用。作为优选，所述人工接种的步骤C中，所述接种量2_5g /株。与现有技术相比，本发明的优点在于:本发明解决了夏块菌人工接种的难题，以华山松、板栗、云南松为宿主，将夏块菌孢子在相对无菌的条件下，即杜绝真菌的竞争和多数霉菌侵染的条件下，足量与夏块菌宿主树种根部接触，在一定时间内保持夏块菌孢子单一的感染优势，形成稳固和大量的夏块菌菌根。采用悬浮液接种，将添加了高吸水性树脂的悬浮液能够完全吸附在液体中悬浮的孢子，确保孢子悬浮液分布的均匀性，并且能够更有效地吸附在植物的根部，并且在苗木培育和出栽时都能起到保水作用。而且增加低浓度植物生长激素吲哚乙酸，能够刺激植株根部生长和须根的数量和质量上增大，提高块菌孢子的接种效率和形成菌根的数量，悬浮液接种法对须根生长少，缓慢的针叶类植物特别显著。
图1为本发明的流程示意图。
具体实施例方式下面将结合附图对本发明作进一步说明。
实施例:参见图1，一种悬浮液接种培育夏块菌根苗的方法，包括如下工艺步骤，
(O培育宿主植物苗，具体如下，
A、采集、遴选宿主植物种子；
所述宿主植物选用云南松、华山松、板栗之一种；所述遴选宿主植物种子的方法是，云南松和华山松用水选去除空壳后晾干后常温储藏备用；板栗种子水选去除霉烂和不饱满的种子，晾干表面水分，再与湿度为25 - 35%的洁净河沙按体积比1:2的比例混合，并置于5 °C的冰箱中保存备用；
B、处理宿主植物种子；
将步骤A收集的种子水选去出空壳，用30%的H2O2浸泡处理40分钟后，用蒸馏水冲洗，直至无H2O2气味为止；
C、制备培养基；
将蛭石与泥炭土按体积比1:1混合装入育苗框内，经高温121-126 高压1.5kg/cm2灭菌2小时以上，形成无菌基质育苗框；
D、培育宿主植物；
将经步骤B处理后的植物种子及时播入无菌基质育苗框内，然后放置于温室内催芽，出芽后移入大棚育株，直至长出根苗；
所述云南松、华山松种子均匀撒播，上覆Icm灭菌基质，板栗种子点播在育苗框内，上覆2-3cm灭菌基质，用清水将基质浇透后放置于温度25°C的温室中进行催芽，待80 %以上的种子发芽后再移入温度为10_35°C的大棚中进行植株培育，同时将基质的湿度保持在50 — 80%。
(2)制备菌剂，具体如下，
A、收集和保存菌种；
在夏块菌成熟的季节9-12月收集成熟、个头大、外型好、无损伤、香味相对较浓的夏块菌子实体，先用牙刷轻轻洗净表面泥土，再在75%的酒精中浸泡3min对其表面灭菌，同时再在酒精灯火焰上快速灼烧后置于高温121-126°C高压1.5kg/cm2灭菌2小时以上的河沙中，于3-5°C的温度下冷藏保存备用；一般保存期为1-3个月；若长期保存，要置于_18°C的冷冻室内真空保存；
B、制备菌剂；其配制方法如下，
第一步，先称取一定量的块菌，用75%的酒精中浸泡1-3分钟对其表面灭菌，然后再在酒精灯火焰上快速灼烧，继续灭菌，置于灭菌后的操作台上，用酒精灭菌后的打浆机将其粉碎成粒径小于Imm悬浮液，使菌种的孢子出壳，悬浮液中块菌与蒸馏水体积比为1:5 ；
第二步，将高吸水性丙烯酸树脂与块菌悬浮液按体积比1:400配制；
第三步，将吲哚乙酸速溶后配制60PPM浓度的蒸馏水溶液；
第四步，将第二步制作的悬浮液与第三步制作的蒸馏水溶液按体积比1:1配制成块菌接种剂；
所述块菌的菌剂一般应现用现配，如果配制好的块菌菌剂未用完，可用密封灭菌容器暂时存放于3 - 5 °C的冰箱中备用。(3)接种，采 用悬浮液接种法，具体如下，
在接种室内安放洁净的不锈钢工作台，先用75%的酒精将桌面擦干净后，选择长势好，根系发达的无菌苗，用剪刀剪去部分根系和多余生长叶，放在已灭菌处理过的容器中备用；选择一只已经使用0.5%高锰酸钾溶液灭菌的育苗杯Φ 10 X 15cm，先在杯中装入占杯体积
I/ 3的灭菌土，再将植株放入杯中央，用IOml的定量小勺将配制好的块菌悬浮液撒在根上，最后加入灭菌接种基质至距育苗杯边缘0.5cm处，块菌菌剂的接种量为2-5g /株。接种培育基质使用高温121_126°C高压1.5kg/cm2灭菌2小时以上的无菌基质，根据树种的差异，云南松宜采用的泥炭土与蛭石比例按体积比1:1混合；华山松和板栗宜采用的自然土与蛭石比例按体积比1:1混合；基质的PH值用生石灰调节，一般维持在7.5比较适宜。(4)炼苗；
刚接种块菌的植株先放置于温度在15_25°C之间，基质的湿度保持在50-80%的炼苗室内育苗架上培育15-30天，使菌种在宿主上寄生成功；
(5)培育菌根苗；
将已经寄生成功的植株移出 到玻璃大棚的育苗架上培育6-24个月，成为可供大田栽培的商品苗，在菌根苗培育期间，要注意大棚周边的卫生，根据温度和湿度的变化及时给苗木补充水分；并且注意观察植株的养分缺失情况，通过叶面施肥适当补充养分。(6)检测确认
夏块菌接种3个月后，可通过块菌菌根苗的显微特征，评估感染率和感染指数；接种成功的块菌菌根在40-60倍的立体显微镜下可进行观察，形态多为棒状、二叉状，多叉状和珊瑚状；菌根初期，端部呈白色或浅金黄色，之后颜色逐渐变深呈浅棕色；在显微镜下可清晰看到表面有半透明的金黄的菌丝，且无序地生长在菌根表面；在600倍显微镜下可观察到菌根表层形成哈蒂氏网层的鞘细胞组织，夏块菌的呈线条分明的多边形，不同于印度块菌与黑孢块菌形成的不规则弧形花纹。本发明解决了夏块菌人工接种的难题，以华山松、板栗、云南松为宿主，将夏块菌孢子在相对无菌的条件下，即杜绝真菌的竞争和多数霉菌侵染的条件下，足量与夏块菌宿主树种根部接触，在一定时间内保持夏块菌孢子单一的感染优势，形成稳固和大量的夏块菌菌根。采用悬浮液接种，将添加了高吸水性树脂的悬浮液能够完全吸附在液体中悬浮的孢子，确保孢子悬浮液分布的均匀性，并且能够更有效地吸附在植物的根部，并且在苗木培育和出栽时都能起到保水作用。而且增加低浓度植物生长激素吲哚乙酸，能够刺激植株根部生长和须根的数量和质量上增大，提高块菌孢子的接种效率和形成菌根的数量，悬浮液接种法对须根生长少，缓慢的针叶类植物特别显著。以上对本发明所提供的悬浮液接种培育夏块菌根苗的方法进行了详尽介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式
及应用范围上均会有改变之处，对本发明的变更和改进将是可能的，而不会超出附加权利要求所规定的构思和范围，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。
权利要求
1.一种悬浮液接种培育夏块菌根苗的方法，其特征在于:包括如下步骤， (1)培育宿主植物苗，具体如下， A、采集、遴选宿主植物种子； 所述宿主植物选用云南松、华山松、板栗之一种； B、处理宿主植物种子； 将步骤A收集的种子水选去出空壳，用30%的H2O2浸泡处理40分钟后，用蒸馏水冲洗，直至无H2O2气味为止； C、制备培养基； 将蛭石与泥炭土按体积比1:1混合装入育苗框内，经高温121-126 高压1.5kg/cm2灭菌2小时以上，形成无菌基质育苗框； D、培育宿主植物； 将经步骤B处理后的植物种子及时播入无菌基质育苗框内，然后放置于温室内催芽，出芽后移入大棚育株，直至长出根苗； (2)制备菌剂，具体如下， A、收集和保存菌种； 采集夏块菌子实体，先用刷体轻轻洗净表面泥土，再在75%的酒精中浸泡3min对其表面灭菌，同时再在酒精灯火焰上快速灼烧，继续灭菌，然后置于经高温高压灭菌后的河沙中，于3-5°C的温度下冷藏保存备用，所述河沙采用高温121-126°C高压1.5kg/cm2灭菌2小时以上； B、制备菌剂；其配制方法如下， 第一步，先称取一定量的块菌，用75%的酒精中浸泡1-3分钟对其表面灭菌，然后再在酒精灯火焰上快速灼烧，继续灭菌，置于灭菌后的操作台上，用酒精灭菌后的打浆机将其粉碎成粒径小于1mm悬浮液，使菌种的孢子出壳，悬浮液中块菌与蒸馏水体积比为1:5 ； 第二步，将高吸水性丙烯酸树脂与块菌悬浮液按体积比1:400配制； 第三步，将吲哚乙酸速溶后配制60PPM浓度的蒸馏水溶液； 第四步，将第二步制作的悬浮液与第三步制作的蒸馏水溶液按体积比1:1配制成块菌接种剂； (3)接种，采用悬浮液接种法，具体如下， A、整理育好的宿主植物苗，减去多余的根、叶； B、在接种杯内填入经消毒杀菌的无菌土，无菌土填装量约占接种杯容积的1/3，再将宿主植物苗放入杯中央； C、向宿主植物苗根部撒上块菌悬浮液菌剂，使之附着在根系上； D、装填接种培育基质，将根系覆盖； (4)炼苗； 刚接种块菌的植株先放置于温度在15_25°C之间，基质的湿度保持在50-80%的炼苗室内育苗架上培育15-30天，使菌种在宿主上寄生成功； (5)培育菌根苗； 将已经寄生成功的植株移出到玻璃大棚的育苗架上培育6-24个月，成为可供大田栽培的商品苗。
2.根据权利要求1所述一种悬浮液接种培育夏块菌根苗的方法，其特征在于:所述无菌苗培育的步骤C中，所述云南松、华山松种子均匀撒播在育苗框内，上覆Icm灭菌基质，而板栗种子采用点播在育苗框内，上覆2-3cm灭菌基质，用清水将基质浇透后放置于温度25°C的温室中进行催芽，待80%以上的种子发芽后再移入温度为10-35°C的大棚中进行植株培育，同时将基质的湿度保持在50 — 80%。
3.根据权利要求1所述一种悬浮液接种培育夏块菌根苗的方法，其特征在于:所述菌剂制备步骤中，菌种的一般保存期为1-3个月；若长期保存，要置于_18°C的冷冻室内真空保存。
4.根据权利要求1所述一种悬浮液接种培育夏块菌根苗的方法，其特征在于:所述接种步骤D中，所述接种培育基质使用高温121-126°C高压1.5kg/cm2灭菌2小时以上的无菌基质，根据树种的差异，云南松宜采用的泥炭土与蛭石比例按体积比1:1混合；华山松和板栗宜采用的自然土与蛭石比例按体积比1:1混合；基质的PH值用生石灰调节，维持在7.5。
5.根据权利要求1所述一种悬浮液接种培育夏块菌根苗的方法，其特征在于:所述遴选宿主植物种子的方法是，云南松和华山松用水选去除空壳后晾干后常温储藏备用；板栗种子水选去除霉烂和不饱满的种子，晾干表面水分，再与湿度为25 - 35%的洁净河沙按体积比1:2的比例混合，并置于5°C的冰箱中保存备用。
6.根据权利要求1所述一种悬浮液接种培育夏块菌根苗的方法，其特征在于:所述人工接种的步骤C中， 所述接种量2-5g /株。
全文摘要
本发明公开了一种悬浮液接种培育夏块菌根苗的方法，通过无菌苗培育、菌剂制备、悬浮液接种法、炼苗、菌根苗培育、检测确认步骤，攻克了夏块菌人工接种的难题，与现有培育方法相比较，本发明以华山松、板栗、云南松为宿主，将夏块菌孢子在相对无菌的条件下，即杜绝真菌的竞争和多数霉菌侵染的条件下，足量与夏块菌宿主树种根部接触，在一定时间内保持夏块菌孢子单一的感染优势，形成稳固和大量的夏块菌菌根。
文档编号A01G1/04GK103070014SQ201310035568
公开日2013年5月1日 申请日期2013年1月30日 优先权日2013年1月30日
发明者韩灯, 林强, 雷彻虹, 柳成益, 李荣伟, 陈宾, 唐平, 叶光志 申请人:攀枝花市林业科学技术推广站(攀枝花市林业工作总站)