专利名称：一种杉木体细胞胚胎发生方法
技术领域：
本发明属林业生物技术领域，具体涉及一种杉木体细胞胚胎发生方法，对杉木体细胞胚胎发生体系进行优化，提高杉木体胚发生频率。
背景技术：
衫太XCunninghamialanceolata (Lamb.) Hook)隶属杉科(Taxodiaceae)杉木属(Cunninghamia)，是我国特有的常绿针叶树种之一，广泛分布于我国南方山区。杉木生长快，干形通直圆满，耐腐蚀，且木材纹理十分美观，是重要的商品用材和造林树种。我国杉木的栽培历史可以追溯到3000多年前。经过“六五”至“九五”杉木攻关计划的系统研究，用常规育种手段已选育出一大批杉木优良种源、家系和优良无性系供生产使用，为我国速生丰产林建设作出了重要贡献。由于杉木造林形势的迫切需求，一种快速有效的杉木优良种质资源的无性繁殖技术一体胚发生技术应运而生。体胚发生技术是指在体外条件下，未经性细胞融合的体细胞模拟合子胚发育过程再生植株的一种技术。这种技术不受自然条件的约束，能大大缩短培养周期，快速繁育一大批品质稳定的优良种苗，是实现杉木优良种苗的商业化和工厂化经营的重要手段。目前，陈金慧等(ZL 201010275858.0)已经建立了以杉木优树未成熟合子胚诱导ESM、通过液体增殖ESM、并诱导体胚发生这一间接体胚发生途径并实现植株再生的成功方法，然而受杉木自然属性的影响，杉木次生代谢物丰富，而且其EMS结构较松散，受液体剪切力作用后，胚柄结构极易遭到破坏，通过液体增殖EMS时褐化严重，所以增殖效率十分有限，诱导体胚发生时，配`方还不够完善，受材料状态影响很大，诱导频率不稳定，距离产业化生产有很大差距。PSK能有效抑制EMS褐化的现象，提高其增殖效率。不管从间接体胚方式还是直接体胚发生方式都能有效提高体胚发生的频率，缩短培养时间。植物磺肽素(Phytosulfokine, PSK),是新近在植物中发现的硫酸酯化的短肽类生长调节物质。已有研究表明其具有促进悬浮细胞生长和增殖、导管分化、胚性细胞形成及提高花粉的群体效应和植物耐热性等生理效应。PSK以两种形式存在，分别是PSK-a [Tyr (SO3H) -1le-Tyr (SO3H) -Thr-Gln]和 PSK- β [Tyr (SO3H) -1le-Tyr (SO3H) -Thr]。已有研究多集中于PSK-α。
发明内容
发明目的:针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种杉木体细胞胚胎发生方法，通过对杉木体细胞胚胎发生体系进行优化，提高杉木体胚发生频率，以建立稳定高效的杉木体细胞胚胎发生体系。技术方案:为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下:
一种杉木体细胞胚胎发生方法，包括以下步骤:
(I)胚性胚柄细胞团的起始诱导
采集的未成熟杉木优树球果于4°c保存一周后，经表面灭菌后接种到添加了 PSK的诱导培养基中，23°C、暗培养20-25天；其中，诱导培养基的配方为:DCR(Gupta and Durzan基本培养基)，2 6mg/L 2,4-D (2，4-二氯苯氧乙酸)，0.5 1.0mg/L 6-BA (6-苄氨基腺嘌呤)，0.5mg/L KT (6-呋喃氨基嘌呤)，I Omg/L Vc (维生素C)，0.5g/L水解酪蛋白，15g/L麦芽糖，
2.5g/L Ac (活性炭)，2.3g/L水晶洋菜。(2) EMS的维持与增殖
将诱导后的球果转移至添加了 PSK的增殖培养基上，23°C、暗培养15-25天；其中，增殖培养基的配方为:DCR, 0.5 2mg/L 2，4-D，0.2 0.5mg/L 6-BA, I Omg/L 维生素 C，0.5g/L水解酪蛋白，30g/L麦芽糖；
(3)体胚发育与成熟
采用间接体胚发生方式或直接体胚发生方式；其中，间接体胚发生方式如下:
a.液体悬浮系的建立
先将维持与增殖后的EMS转入液体增殖培养基，建立液体悬浮细胞系，进行加速增殖，培养细胞的初始V/V密度为1.20%,摇床转速为85 90r.p.m, 23°C、暗培养7天，然后转入预处理培养基进行预处理，摇床转速仍然控制在85r.p.m左右，23°C、暗培养7天；其中，液体增殖培养基为:DCR,0.5 2mg/L 2，4-D, 0.2mg/L 6-BA, 0.5g/L 水解酪蛋白，2g/L 肌醇，30g/L 麦芽糖，0.0Tlmg/L PSK ;预处理培养基:DCR，5 I Omg/L ΑΒΑ, 0.1 1.0mg/L GA,I Omg/L 维生素 C，0.5g/L 水解酪蛋白，30g/L 麦芽糖，0.0flmg/L PSK0b.体胚的成熟培养
预处理后的悬 浮细胞系转移到成熟培养基，23°C，暗培养60-80天，其中，成熟培养基的配方为:DCR,3 8mg/L ABA (脱落酸)，I 5mg/L GA (赤霉素)，I Omg/L维生素C, 100 200g/L聚乙二醇(PEG 8000),0.5g/L水解酪蛋白，30g/L麦芽糖，2g/L活性炭，2.8g/L水晶洋菜。直接体胚发生方式如下:
将继代2(Γ25天的增殖培养基上的EMS团直接平铺到体胚成熟培养基上进行萌发，直至体胚成熟；成熟培养基的配方为:DCR, 3 8mg/L ΑΒΑ, I 5mg/L GA, I Omg/L维生素C,100 200g/L聚乙二醇，0.5g/L水解酪蛋白，30g/L麦芽糖，2g/L活性炭，2.8g/L水晶洋菜；
(4)体胚萌发成苗
将发育成熟的体胚转移到DCR基本培养基进行培养萌发，即可实现植株的再生和培育成苗。步骤(I)中，PSK的添加量为0.0rimg/Lo步骤(2)中，PSK的添加量为0.0rimg/Lo步骤(3)中，体胚发育与成熟采用直接体胚发生方式进行。有益效果:与现有技术相比，本发明的杉木体细胞胚胎发生方法，能有效改善常规液体悬浮系建立过程中的褐化现象，启动低密度条件下的细胞分裂，维持胚柄细胞的稳定性，从而建立稳定增殖的液体悬浮细胞系；通过直接和间接的体胚发生方式，可以将杉木体胚发生的频率最多提高20倍左右，很好地解决了因杉木体胚发生体系不完善而引起的体胚发生频率低的问题，节约了成本，为实现杉木工厂化生产准备了条件，加速其实现产业化生产的步伐。
图1是初始EMS从胚珠孔增殖而出显微照片 图2是PSKa对第一批未成熟合子胚胚性材料诱导和早熟萌发的影响结果图；横坐标表示PSK浓度-预处理处理时间，其中2w表示2周，3w表示3周。图3是PSKa对第二批未成熟合子胚胚性材料诱导和早熟萌发的影响结果 图4是PSKa对第三批未成熟合子胚胚性材料诱导和早熟萌发的影响结果 图5 PSKa β对液体悬浮系增殖的影响结果 图6是添加PSK的悬浮EMS显微照片 图7是液体悬浮系两周添加PSK与未添加对比 图8是PSK a及处理时间对间接体胚发生频率的影响结果 图9是添加PSK直接体胚发生照片；
图10是添加PSK直接体胚发生照片。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明。以下实施例中，使用的DCR (Gupta and Durzan medium)基本培养基的构成和标准配方为:340 mg/L KNO3, 556 mg/L Ca (NO3) 2.4Η20，400 mg/L NH4NO3,170 mg/L KH2PO4,85mg/L CaCl2.2H20，370 mg/L MgSO4*7H20, 37.3 mg/L Na2_EDTA.H20，27.9 mg/L FeS04.7H20，6.2 mg/L H3BO3,22.3 mg/L MnSO4*4H20,8.6 mg/L ZnS04*7H20,0.25 mg/L Na2MoO4*2H20,0.25mg/L CuS04*5H20, 0.83 mg/L KI, 0.025 mg/L CoCl2,200 mg/L MyO-1nositol, 2.0 mg/LGlycine,1.0 mg/L Thiamine1HCl,0.5 mg/L Nictinic*acid,0.5 mg/L Pyridoxine*HCl。实施例1胚性胚柄团(EMS)的诱导。供试材料为6-7月每周分别采自福建顺昌和卫闽两地的杉木无性系嫁接种子园的杉木优树的未成熟球果。各个采种时间点相对应的种子发育阶段分别为幼胚至成熟胚发育阶段进程。球果采集后，现场置预冻好的冰盒中，湿润纱布包裹防止失水；随后速置于4°C冰箱冷藏保存备用。接种前，将备用球果从冰箱取出，用解剖刀和镊子取出球果中带种翅、发育良好的未成熟种子，用雕牌洗洁精富含高效复合活性剂，配成1:50浓度的洗液浸泡清洗lOmin，然后流水冲洗30min。在无菌环境中，将经过初步清洗的未成熟种子转移到高压灭菌的三角瓶中，75%酒精中速泡30秒，再用0.l%HgCl2灭菌9min，最后用无菌水冲洗3遍，置于无菌滤纸上吸干，随后用解剖刀和镊子去除种皮，接种于分别添加PSK 0,0.01,0.l，lmg/L的诱导培养基，每皿接种8粒种子，每个处理接种5皿。控温23°C、暗培养20-25天为一个继代周期。本发明的诱导培养基以DCR为基本培养基，附加2，4-D 2飞mg/L, 6-BA
0.5^1.0mg/L, KT 0.5mg/L, Vc 10 mg/L，水解酪蛋白 0.5 g/L，麦芽糖 15g/L，Ac 2.5g/L，水晶洋菜2.3 g/L。未成熟胚接种至上述诱导培养基中，添加PSK的7天即可见诱导的ESM呈半透明状含水量高的物质从胚珠孔增殖而出后在培养基上扩展，如图1所示，而未添加的对照则要15天左右才可见诱导出的EMS。一个月后统计诱导出EMS及早熟萌发的频率，如图2、3、4所示，添加PSK后其EMS诱导率最多可提高40%左右， 而早熟萌发的频率也相对提高。同时，PSK对EMS诱导的促进作用随未成熟合子胚的发育状态变化。利用早期合子胚诱导EMS较易成功，PSK的促进作用相对削弱，随着合子胚的发育，至子叶胚时，其更易早熟萌发，PSK对EMS诱导的促进作用更加显现。诱导ESM增殖的继代周期约为25天，23°C、暗培养。实施例2 EMS的维持与增殖培养。EMS的维持和增殖培养基，组成成分与诱导EMS的基本培养基相同，但将生长素浓度降低。杉木ESM维持和增殖培养以DCR为基本培养基，附加2，4-D 2飞mg/L，6_BA0.5^1.0mg/L, KT 0.5mg/L, Vc 10 mg/L，水解酪蛋白 0.5 g/L，麦芽糖 15g/L，Ac 2.5g/L，水晶洋菜2.3 g/L的固体培养基，添加PSK (0.0fl mg/L)，继代周期25天，23°C、暗培养。可以观察到添加了 PSK的增殖培养基上，其EMS胚柄细胞发育更好，同时材料分散性更好。实施例3体胚的发育与成熟。(I)间接体胚发生方式 A、液体悬浮培养
液体增殖培养基同以DCR为基本培养基，附加2，4-D 0.5^2 mg/L，6_BA 0.2mg/L，谷氨酰胺0.45 g/L，水解酪蛋白0.5 g/L，麦芽糖30 g/L。培养细胞的初始密度为1.20%(V/V)，摇床转速为85 90r.p.m，23°C、暗培养，增殖培养的时间控制为7天左右。并在液体增殖培养基中添加不同浓度的PSK (0.0f lmg/L)，进行培养试验。液体预处理培养基(DCR,5 10mg/L ΑΒΑ, 0.1 1.0mg/L GA, I Omg/L 维生素 C,
0.5g/L水解酪蛋白，30g/L麦芽糖)去除所有附加的激素，添加ABA (脱落酸)5 10mg/L，终止ESM继续裂生,转向体胚的成熟发育进程。摇床转速仍然控制在85r.p.m左右,23°C、暗培养7天左右。杉木次生代谢物十分丰富，且其EMS结构很容易被液体的剪切力破坏，建立液体悬浮系时不像其他裸子植物那么容易。按常规方法建立液体悬浮系时，材料很容易褐化，且对摇床转速很苛刻，高于85rpm褐化加剧，只能通过提前添加ABA进行成熟前预处理才能抑制材料的褐化现象，尽管如此，褐化现象还是不能有效制止。添加了 PSK后能有效抑制褐化，同时明显提高了增殖效率，如图5，材料对摇床转速也不严格，特别是其能在添加2，4-D的培养基中建立液体快速增殖体系。添加了 0.lmg/L PSK后，当转速为95rpm时也能稳定增殖并获得较分散的胚性胚柄团结构，如图6，而未加PSK的悬浮系一周后严重褐化，两周后即死亡，如图7所示。B、体胚的成熟培养
体胚的成熟培养，采用DCR基本培养基，附加:T8mg/L ABA和f 5 mg/L赤霉素GA，活性炭2g/L，水晶洋菜2.8g/L。为了调节渗透压，添加10(T200g/L PEG (聚乙二醇)8000，另外加入试剂级纯度的麦芽糖30g/L，水解酪蛋白0.5 g/L。体胚的成熟培养时间控制为60-80天，23°C，暗培养。并在培养基中添加不同浓度的PSK ((Tl.0mg/L)，进行培养试验。如图8所示，添加了 PSK后，体胚成熟时间提前，30-50天即有大量成熟体胚，且体胚发生频率可提高20倍左右。同时，PSK的处理时间也对体胚发生有明显作用，处理2周的材料其体胚发生能力明显高于处理3周的材料。(2)直接体胚发生 将继代20天左右的增殖培养基上的EMS团直接平铺到体胚成熟培养基(成熟培养基的配方为:DCR,3 8mg/L ΑΒΑ, I 5mg/L GA, I Omg/L 维生素 C, 100 200g/L 聚乙二醇，
0.5g/L水解酪蛋白，30g/L麦芽糖，2g/L活性炭，2.8g/L水晶洋菜)上进行萌发。23 °C，暗培养。如图9和图10所示，添加了 lmg/L PSK的成熟培养基上的EMS的体胚发生频率比未添加的高出10多倍。其省去了液体继代等繁琐的过程，且发生频率非常高，易于工厂化生产的实施。
实施例4体胚萌发成苗
将发育成熟的体胚(实施例3培育)转移到DCR基本培养基进行培养萌发，即可实现植株的再生和培育成苗。
权利要求
1.一种杉木体细胞胚胎发生方法，其特征在于，包括以下步骤: (1)胚性胚柄细胞团的起始诱导 采集的未成熟杉木优树球果于4°c保存一周后，经表面灭菌后接种到添加了 PSK的诱导培养基中，23°C、暗培养20-25天；其中，诱导培养基的配方为:DCR，2 6mg/L 2，4_D，0.5^1.0mg/L 6-BA,0.5mg/L ΚΤ，10mg/L Vc, 0.5g/L 水解酪蛋白，15g/L 麦芽糖，2.5g/LAc, 2.3g/L水晶洋菜； (2)EMS的维持与增殖 将诱导后的球果转移至添加了 PSK的增殖培养基上，23 °C、暗培养15-25天；其中，增殖培养基的配方为:DCR, 0.5 2mg/L 2，4-D，0.2 0.5mg/L 6-BA，I Omg/L 维生素 C，0.5g/L水解酪蛋白，30g/L麦芽糖； (3)体胚发育与成熟 采用间接体胚发生方式或直接体胚发生方式；其中，间接体胚发生方式如下: a.液体悬浮系的建立 先将维持与增殖后的EMS转入液体增殖培养基，建立液体悬浮细胞系，进行加速增殖，培养细胞的初始V/V密度为1.20%,摇床转速为85 90r.p.m，23°C、暗培养7天，然后转入预处理培养基，摇床转速仍然控制在85r.p.m左右，23 °C、暗培养7天；其中，液体增殖培养基为:DCR，0.5 2mg/L 2，4_D，0.2mg/L 6-BA, 0.5g/L 水解酪蛋白，2g/L 肌醇，30g/L 麦芽糖，0.0Tlmg/L PSK ;预处理培养基:DCR，5 I Omg/L ΑΒΑ, 0.1 1.0mg/L GA, I Omg/L 维生素 C，0.5g/L 水解酪蛋白，30g/L 麦芽糖，0.0flmg/L PSK ；` b.体胚的成熟培养 预处理后的悬浮细胞系转移到成熟培养基，23°C，暗培养60-80天，其中，成熟培养基的配方为:DCR,3 8mg/L ΑΒΑ, I 5mg/L GA, 10mg/L 维生素 C, 100 200g/L 聚乙二醇，0.5g/L水解酪蛋白，30g/L麦芽糖，2g/L活性炭，2.8g/L水晶洋菜； 直接体胚发生方式如下: 将继代2(Γ25天的增殖培养基上的EMS团直接平铺到体胚成熟培养基上进行萌发，直至体胚成熟；成熟培养基的配方为:DCR, 3 8mg/L ΑΒΑ, I 5mg/L GA, 10mg/L维生素C,100 200g/L聚乙二醇，0.5g/L水解酪蛋白，30g/L麦芽糖，2g/L活性炭，2.8g/L水晶洋菜； (4)体胚萌发成苗 将发育成熟的体胚转移到DCR基本培养基进行培养萌发，即可实现植株的再生和培育成苗。
2.根据权利要求1所述的杉木体细胞胚胎发生方法，其特征在于:步骤(I)中，PSK的添加量为0.01 lmg/L。
3.根据权利要求1所述的杉木体细胞胚胎发生方法，其特征在于:步骤(2)中，PSK的添加量为0.01 lmg/L。
4.根据权利要求1所述的杉木体细胞胚胎发生方法，其特征在于:步骤(3)中，体胚发育与成熟采用直接体胚发生方式进行。
全文摘要
本发明公开了一种杉木体细胞胚胎发生方法，包括胚性胚柄细胞团的起始诱导，EMS的维持与增殖和体胚发育与成熟；其中，体胚发育与成熟可采用间接体胚发生方式或直接体胚发生方式该杉木体细胞胚胎发生方法，能有效改善常规液体悬浮系建立过程中的褐化现象，启动低密度条件下的细胞分裂，维持胚柄细胞的稳定性，从而建立稳定增殖的液体悬浮细胞系；通过直接和间接的体胚发生方式，可以将杉木体胚发生的频率最多提高20倍左右，很好地解决了因杉木体胚发生体系不完善而引起的体胚发生频率低的问题，节约了成本，为实现杉木工厂化生产准备了条件，加速其实现产业化生产的步伐。
文档编号A01H4/00GK103070074SQ201310035599
公开日2013年5月1日 申请日期2013年1月30日 优先权日2013年1月30日
发明者施季森, 周小红, 陈金慧, 赵芳芳 申请人:南京林业大学