专利名称：云南大百合原生质体超低温保存方法及活性鉴定方法
技术领域：
本发明涉及云南大百合原生质体超低温保存方法及活性鉴定方法，属于植物种质资源的细胞保存技术领域。
背景技术：
市场上常见的观赏百合为百合科百合属植物，而在百合科植物的大家族中，还有一类鲜为人知的大百合属珍稀花卉，该属植物因植株的巨大性而显著区别于百合属植物而得此名。大百合属植物全球仅有3种，我国产2种，它们是荞麦叶大百合(C CaiAajazwffl )及大百合(C而大百合还有一个变种，即云南大百合(Cardiocrinum giganteum var.yunnanense) 云南大百合原产于云南省哀牢山、高黎贡山等地，可作为切花材料又可作为盆栽摆设。此外，其鳞茎富含淀粉和多种营养成分，可供食用，果实具有药用价值，民间常用其作为中药马兜铃的代用品，治咳喘病。但是，云南大百合繁殖常采用分株法和播种法，种子的萌发需要经历长时间的变温阶段，而且播种苗(实生苗)需8年才能开花，传统的分株繁殖不仅繁殖系数低，而且易造成植株长势和观赏性状的退变。由于其观赏性、食用性及药用性导致民间大量采集其野生植株的鳞茎和果实，加之其生存环境的破坏，其野生居群已处于绝境。尽管云南大百合的试管繁殖已获得成功，但繁殖系数低，野生资源仍面临着绝迹的危险。云南大百合是不可再生的自然资源，一旦丢失，任何方法都难以再造。因此，云南大百合种质资源的保存工作极为重要和迫切。传统的观赏植物种质保存方法主要有原地保存与异地保存两种。但这些方法往往存在占地面积大，成本高，易受外界环境影响等弊端，不能长期稳定保存种质资源。近年来发展起来的超低温保存技术能够有效克服这种不足。超低温条件能够最大限度的抑制材料的生理代谢强度，降低劣变发生的频率`，从而达到长期保存种质的目的。超低温保存的长期稳定性对一些稀有、珍贵及濒危观赏植物种质资源来说意义重大。众多试验结果证明，超低温(一般指液氮，_196°C)保存是植物种质保存技术中较为理想的方法，但是所需条件常因不同材料或组织而异，应针对其相应特性找出各自最适保存方法，才能保证最高存活率。原生质体的超低温保存有很大的优越性，植物原生质体无细胞壁，在超低温保存中更能承受冷冻、化冻和保护剂的伤害，因而，与其它器官相比，保存后的成活率更高，而且能保证种质遗传性稳定，有效防止遗传基因变异或丢失，同时可以筛选出抗逆性强、生长处于优势的优良细胞系。原生质体的低温保存可随时提供遗传操作研究的材料，并可用于研究细胞低温生物学领域的低温伤害和细胞内结冰等问题，具有重要的意义。但原生质体的超低温保存要求较高，大部分成功保存的都是一些农作物，花卉原生质体的超低温保存报道较少。云南大百合原生质体的超低温保存，尚未见研究报导。
发明内容
本发明的目的是提供一种云南大百合原生质体玻璃化超低温保存方法，该方法不但能保证云南大百合野生种质遗传稳定性，而且可以筛选出抗逆性强、生长处于优势的优良细胞系，同时在云南大百合野生种质资源保存上能节省大量的人力和物力。本发明的云南大百合原生质体超低温保存方法为:
1)愈伤组织诱导:用云南大百合种子萌发出的幼胚为外植体，用水冲洗外植体后，用75%的酒精浸泡30 s,再用0.1%的升萊消毒5 min,无菌水冲洗3 4次,将消毒后的外植体接种在愈伤组织诱导固体培养基:MS+2 3 mg/L ΚΤ+l 2 mg/L 2, 4-D +3%蔗糖+0.7%琼脂粉，温度为23 27°C黑暗培养，40天后诱导出愈伤组织；
2)云南大百合原生质体分离:取上述愈伤组织I 2g，切成约0.2 0.3cm2小块，置于IOmL离心管中，按材料与酶液1:10 15比例加入酶液，25 28°C黑暗中酶解8 12个小时，其中酶解液为:1.5 3%纤维素酶+0.5 2%离析酶+ 0.5 0.7mol / L甘露醇+3 8mmol/L CaCl2.2H20+0.5 0.7mmol/L KH2PO4, pH 6.8 7.0,并经过装有两层微孔滤膜的塑料器过滤灭菌；
3)云南大百合原生质体纯化:上述酶解后，用孔径为300目的细胞筛将原生质体酶解液过滤至无菌的离心管中，除去较大组织和大量细胞团，将离心管置于IOOOrpm下离心6min ;离心结束后去除上清液留沉淀,用5 8ml CPW13将沉淀悬浮，IOOOrpm下离心5min,离心结束后去除上清液留沉淀，在离心管中加入3 5ml CPff 21，然后再在其上面缓慢的加入I 2 ml CPff 13,900rpm下离心7min,原生质体在两液面间形成一条带,其它杂质及少量原生质体沉于管底，将界面处原生质体吸出，用3 5ml 1/2MS+1.2mol/L蔗糖液体培养基洗漆I 2次，IOOOrpm下离心5min弃去上清液,获得纯净原生质体备用；
4)冻存:取0.1 0.2g上述原生质体，放入2ml冻存管中，在室温下加入I 1.5ml预处理液，预处理液为:25%PVS2+75%MS放置30 40min，800rpm下离心3min，收集原生质体，用I 1.5ml的60%PVS2+40%MS于(TC下处理5 IOmin, 800rpm下离心3min，收集原生质体，马上加入0°C下预冷的新鲜的玻璃化试剂100%PVS2 I 1.5ml,脱水3 5 min,快速投入液氣中保存；
5)解冻:将冻存管置于35 45°C水浴中解冻，800rpm下离心5min,收集原生质体,用3 5ml 1/2MS+1.2mol/L蔗糖液体培养基洗涤，800rpm下离心5min，去上清，重复洗涤I次，再用MS+2 3 mg/L ΚΤ+l 2 mg/L 2, 4-D +3%蔗糖液体培养基悬浮原生质体，得到保存后的原生质体。。以上步骤1)、3)中的培养基、CPW13、CPW21经121°C高压灭菌20分钟；步骤4)中PVS2和MS经121 °C高压灭菌20分钟。云南大百合原生质体超低温保存后的活性鉴定方法为:
O活性鉴定:用0.01%荧光素双醋酸酯(FDA)测定原生质体存活率，每个样品重复3次，每重复统计5个视野，取平均值，原生质体活力=(发绿色荧光的原生质体数+原生质体总数)X 100%，检测冻存后原生质体存活率可达55% ；
2)原生质体固体看护培养:
(1)取上述冻存后有活力的悬浮原生质体，再加入等量融化并预冷至40°C的MS+2 3 mg/L ΚΤ+l 2 mg/L 2, 4-D +0.7%琼脂糖+3%蔗糖培养基，混匀后倒入培养皿中，待凝固后，将包埋原生质体后的固体培养基用刀或镊子分成6 8份，获得包埋原生质体；
(2)在一个培养瓶中加入20 30ml的固体培养基:MS+2 3mg/L ΚΤ+l 2 mg/L2，4-D +0.6%琼脂粉+3%蔗糖，将活跃生长的愈伤组织接种到培养基上，再在愈伤组织上放一片Icm2大小并灭菌的滤纸，培养基和滤纸均灭菌；
(3)将切下的包埋原生质体后的固体培养基放到上述滤纸上，25°C下暗培养；
(4)在显微镜下观察原生质体的分裂，培养2 3天可见原生质体再生细胞壁，4 6天后可见第一次分裂的细胞，30 45天可见原生质体再生细胞团。以上活性鉴定步骤2)中的培养基经121°C高压灭菌20分钟，滤纸在121°C高压灭菌20分钟。本发明用酶解法分离云南大百合愈伤组织的原生质体，建立了适合云南大百合原生质体保存的玻璃化超低温保存技术体系，经过超低温保存的原生质体不仅保持了生活力，而且保持了长壁和分裂的能力。本发明的优点实现了云南大百合单细胞水平上的种质保存，能长久保证种质遗传稳定性和存活率，可随时提供在单个细胞水平上进行精密的遗传修饰和遗传重组，体细胞杂交、品种改良等遗传操作的理想材料，为研究云南大百合细胞膜的抗性机理提供最合适的系统。本发明为云南大百合这一珍稀濒危、集观赏、食用及药用为一体的种质长期保存提供了新的科学途径。
图1为用本发明的方法保存后的云南大百合原生质体图。图2为用本发明的方法保存后的云南大百合FDA染色的原生质体图。图3为用本发明的方法保存后的云南大百合长细胞壁的原生质体图。图4为用本发明的方法保存后的确良云南大百合原生质体第一次分裂图。图5为用本发明的方法保存后的云南大百合原生质体形成的细胞团图。
具体实施例方式实施例1:
云南大百合原生质体超低温保存方法:
1.愈伤组织诱导:用采自云南省哀牢山的云南大百合种子萌发出的幼胚为外植体，用水冲洗外植体后，用75%的酒精浸泡30 S,再用0.1%的升萊消毒5 min,无菌水冲洗3次，将消毒后的外植体接种在愈伤组织诱导固体培养基:MS+2mg/L KT+lmg/L 2, 4-D +3%蔗糖+0.7%琼脂粉，温度为23°C黑暗培养；40天后诱导出愈伤组织。培养基经121°C高压灭菌20分钟；
2.云南大百合原生质体分离:在超净工作台上取上述愈伤组织lg，切成约0.2 0.3cm2小块，置于IOmL离心管中，按材料与酶液1:10比例加入酶液，25 °C黑暗中酶解8个小时，在处理过程中偶尔轻轻摇晃几下。其中酶解液:1.5%纤维素酶+0.5%离析酶+0.5mol / L 甘露醇+3mmol/L CaCl2.2H20+0.5mmol/L KH2PO4, pH 6.8，并经过装有两层微孔滤膜的塑料器过滤灭菌。3.云南大百合原生质体纯化:上述酶解后，用孔径为300目的细胞筛将原生质体酶解液过滤至无菌的离心管中，除去较大组织和大量细胞团。将离心管置于IOOOrpm下离心6min ;离心结束后去除上清液留沉淀。用5ml CPff13将沉淀悬浮，IOOOrpm下离心5min,离心结束后去除上清液留沉淀。在离心管中加入3ml CPff 21，然后再在其上面缓慢的加入Iml CPff 13,900rpm下离心7min,原生质体在两液面间形成一条带，其它杂质及少量原生质体沉于管底。将界面处原生质体吸出，用3ml 1/2MS+1.2mol/L蔗糖液体培养基洗涤I次，IOOOrpm下离心5min弃去上清液，获得纯净原生质体备用。其中培养基经121°C高压灭菌20分钟；
4.冻存:取0.1g上述原生质体，放入2ml冻存管中，在室温下加入Iml预处理液，预处理液为:25%PVS2+75%MS放置30min，800rpm下离心3min，收集原生质体，用Iml的60%PVS2+40%MS于(TC下处理5min, 800rpm下离心3min，收集原生质体，马上加入(TC下预冷的新鲜的玻璃化试剂100%PVS2 lml,脱水3min，快速投入液氮中保存。其中PVS2和MS经121°C高压灭菌20分钟；
5.解冻:将冻存管置于35°C水浴中解冻，800rpm下离心5min,收集原生质体,用3mll/2MS+1.2mol/L蔗糖液体培养基洗涤，800rpm下离心5min，去上清，重复洗涤I次，再用MS+2 mg/L KT+lmg/L 2，4_D +3%蔗糖液体培养基悬浮原生质体，得到保存后的原生质体。云南大百合原生质体超低温保存后的活性鉴定方法:1.活性鉴定:用0.01%荧光素双醋酸酯(FDA)测定原生质体存活率，每个样品重复3次，每重复统计5个视野，取平均值。原生质体活力=(发绿色荧光的原生质体数+原生质体总数)X 100%。检测冻存后原生质体存活率可达55%。2.原生质体固体看护培养:
(I)取上述冻存后有活力的悬浮原生质体，再加入等量融化并预冷至40°C的MS+2mg/L KT+lmg/L 2，4_D +0.7%琼脂糖+3%蔗糖培养基，混匀后倒入培养皿中，待凝固后，将包埋原生质体后的固体培养基用刀或镊子分成6份，获得包埋原生质体。上述培养基经121°C高压灭菌20分钟。(2)在一个培养瓶中加入20ml的固体培养基:MS+2mg/L KT+lmg/L 2，4_D +0.6%琼脂粉+3%蔗糖，将活跃生 长的愈伤组织接种到培养基上，再在愈伤组织上放一片Icm2大小并灭菌的滤纸。培养基和滤纸均在121°C高压灭菌20分钟。 (3)将切下的包埋原生质体后的固体培养基放到上述滤纸上。25°C下暗培养。 (4)在显微镜下观察原生质体的分裂，培养2 3天可见原生质体再生细胞壁，4 6天后可见第一次分裂的细胞，30 45天可见原生质体再生细胞团。实施例2:
1.愈伤组织诱导:用采自云南省哀牢山的云南大百合种子萌发出的幼胚为外植体，用水冲洗外植体后，用75%的酒精浸泡30 s,再用0.1%的升萊消毒5 min,无菌水冲洗4次，将消毒后的外植体接种在愈伤组织诱导固体培养基:MS+3 mg/L KT+2 mg/L 2，4_D +3%蔗糖+0.7%琼脂粉，温度为27°C黑暗培养；40天后诱导出愈伤组织。培养基经121°C高压灭菌20分钟；
2.云南大百合原生质体分离:在超净工作台上取上述愈伤组织2g，切成约0.3cm2小块，置于IOmL离心管中，按材料与酶液1:15比例加入酶液，28°C黑暗中解离12个小时，在处理过程中偶尔轻轻摇晃几下。其中酶解液:3%纤维素酶+2%离析酶+ 0.7mol / L甘露醇+8mmol/L CaCl2.2H20+0.7mmol/L KH2PO4, pH 7.0，并经过装有两层微孔滤膜的塑料器过滤灭菌。3.云南大百合原生质体纯化:上述酶解后，用孔径为300目的细胞筛将原生质体酶解液过滤至无菌的离心管中，除去较大组织和大量细胞团。将离心管置于IOOOrpm下离心6min ;离心结束后去除上清液留沉淀。用8ml CPff13将沉淀悬浮，IOOOrpm下离心5min,离心结束后去除上清液留沉淀。在离心管中加入5ml CPff 21，然后再在其上面缓慢的加入
2ml CPff 13,900rpm下离心7min,原生质体在两液面间形成一条带，其它杂质及少量原生质体沉于管底。将界面处原生质体吸出，用5ml 1/2MS+1.2mol/L蔗糖液体培养基洗涤2次，IOOOrpm下离心5min弃去上清液，获得纯净原生质体备用。其中培养基经121°C高压灭菌20分钟；
4.冻存:取0.2g上述原生质体，放入2ml冻存管中，在室温下加入1.5ml预处理液，预处理液为:25%PVS2+75%MS放置40min，800rpm下离心3min，收集原生质体，用1.5ml60%PVS2+40%MS于(TC下处理IOmin, 800rpm下离心3min，收集原生质体，马上加入(TC下预冷的新鲜的玻璃化试剂100%PVS21.5ml,脱水5 min,快速投入液氮中保存。其中PVS2和MS经121°C高压灭菌20分钟；
5.解冻:将冻存管置于45°C水浴中解冻，800rpm下离心5min,收集原生质体,用5mll/2MS+1.2mol/L蔗糖液体培养基洗涤，800rpm下离心5min，去上清，重复洗涤I次，再用MS+3 mg/L KT+2 mg/L 2，4_D +3%蔗糖液体培养基悬浮原生质体，得到保存后的原生质体。大百合原生质体超低温保存后的活性鉴定方法:1.活性鉴定:用0.01%荧光素双醋酸酯(FDA)测定原生质体存活率，每个样品重复3次，每重复统计5个视野，取平均值。原生质体活力=(发绿色荧光的原生质体数+原生质体总数)X 100%。检测冻存后原生质体存活率可达55%。2.原生质体固体看护培养
(I)取上述冻存 后有活力的悬浮原生质体，再加入等量融化并预冷至40°C的MS+3mg/L KT+2 mg/L 2，4_D +0.7%琼脂糖+3%蔗糖培养基，混匀后倒入培养皿中，待凝固后，将包埋原生质体后的固体培养基用刀或镊子分成8份，获得包埋原生质体。上述培养基经121°C高压灭菌20分钟。(2)在一个培养瓶中加入30ml的固体培养基:MS+3 mg/L KT+2 mg/L 2，4_D +0.6%琼脂粉+3%蔗糖，将活跃生长的愈伤组织接种到培养基上，再在愈伤组织上放一片Icm2大小并灭菌的滤纸。培养基和滤纸均在121°C高压灭菌20分钟。 (3)将切下的包埋原生质体后的固体培养基放到上述滤纸上，25°C下暗培养。(4)在显微镜下观察原生质体的分裂，培养2 3天可见原生质体再生细胞壁，4 6天后可见第一次分裂的细胞，30 45天可见原生质体再生细胞团。实施例3:
1.愈伤组织诱导:用采自云南省哀牢山的云南大百合种子萌发出的幼胚为外植体，用水冲洗外植体后，用75%的酒精浸泡30 s,再用0.1%的升萊消毒5 min,无菌水冲洗3次，将消毒后的外植体接种在愈伤组织诱导固体培养基:MS+2 mg/L KT+2 mg/L 2，4_D +3%蔗糖+0.7%琼脂粉，温度为25°C黑暗培养；40天后诱导出愈伤组织。培养基经121°C高压灭菌20分钟；
2.云南大百合原生质体分离:在超净工作台上取上述愈伤组织1.5g，切成约0.2cm2小块，置于IOmL离心管中，按材料与酶液1:10比例加入酶液，28°C黑暗中酶解9个小时，在处理过程中偶尔轻轻摇晃几下。其中酶解液:2%纤维素酶+0.5%离析酶+ 0.6mol / L甘露醇+6mmol/L CaCl2.2H20+0.7mmol/L KH2PO4, pH 6.8，并经过装有两层微孔滤膜的塑料器过滤灭菌。3.云南大百合原生质体纯化:上述酶解后，用孔径为300目的细胞筛将原生质体酶解液过滤至无菌的离心管中，除去较大组织和大量细胞团。将离心管置于IOOOrpm下离心6min ;离心结束后去除上清液留沉淀。用6ml CPff13将沉淀悬浮，IOOOrpm下离心5min,离心结束后去除上清液留沉淀。在离心管中加入4ml CPff 21，然后再在其上面缓慢的加入2ml CPff 13,900rpm下离心7min,原生质体在两液面间形成一条带，其它杂质及少量原生质体沉于管底。将界面处原生质体吸出，用4ml 1/2MS+1.2mol/L蔗糖液体培养基洗涤2次，IOOOrpm下离心5min弃去上清液，获得纯净原生质体备用。其中培养基经121°C高压灭菌20分钟；
4.冻存:取0.15g上述原生质体，放入2ml冻存管中，在室温下加入1.5ml预处理液，预处理液为:25%PVS2+75%MS放置35min，800rpm下离心3min，收集原生质体，用1.5ml的60%PVS2+40%MS于(TC下处理7min, 800rpm下离心3min，收集原生质体，马上加入(TC下预冷的新鲜的玻璃化试剂100%PVS21.5ml,脱水4 min,快速投入液氮中保存。其中PVS2和MS经121°C高压灭菌20分钟；
5.解冻:将冻存管置于40°C水浴中解冻，800rpm下离心5min，收集原生质体，用4mll/2MS+1.2mol/L蔗糖液体培养基洗涤，800rpm下离心5min，去上清，重复洗涤I次，再用MS+2mg/L KT+2mg/L 2，4_D +3%蔗糖液体培养基悬浮原生质体，得到保存后的原生质体。云南大百合原生质体超低温保存后的活性鉴定方法:1.活性鉴定:用0.01%荧光素双醋酸酯(FDA)测定原生质体存活率，每个样品重复3次，每重复统计5个视野，取平均值。原生质体活力=(发绿色荧光的原生质体数+原生质体总数)X 100%。检测冻存后原生质体存活率可达55%。2.原生质体固体看护培养` (I)取上述冻存后有活力的悬浮原生质体，再加入等量融化并预冷至40°C的MS+2mg/L KT+2 mg/L 2,4-D +0.7%琼脂糖+3%蔗糖培养基，混匀后倒入培养皿中，待凝固后，将包埋原生质体后的固体培养基用刀或镊子分成7份。上述培养基经121 °C高压灭菌20分钟。(2)在一个培养瓶中加入25ml的固体培养基:MS+2mg/L KT+2 mg/L 2，4_D +0.6%琼脂粉+3%蔗糖，将活跃生长的愈伤组织接种到培养基上，再在愈伤组织上放一片Icm2大小并灭菌的滤纸。培养基和滤纸均在121°C高压灭菌20分钟。 (3)将切下的包埋原生质体后的固体培养基放到上述滤纸上。25°C下暗培养。(4)在显微镜下观察原生质体的分裂，培养2 3天可见原生质体再生细胞壁，4 6天后可见第一次分裂的细胞，30 45天可见原生质体再生细胞团。
权利要求
1.一种 云南大百合原生质体超低温保存方法，其特征在于按以下步骤进行: 1)愈伤组织诱导:用云南大百合种子萌发出的幼胚为外植体，用水冲洗外植体后，用75%的酒精浸泡30 s,再用0.1%的升萊消毒5 min,无菌水冲洗3 4次,将消毒后的外植体接种在愈伤组织诱导固体培养基:MS+2 3 mg/L KT+1 2 mg/L 2，4-D +3%蔗糖+0.7%琼脂粉，温度为23 27°C黑暗培养，40天后诱导出愈伤组织； 2)云南大百合原生质体分离:取上述愈伤组织I 2g，切成约0.2 0.3cm2小块，置于IOmL离心管中，按材料与酶液1:10 15比例加入酶液，25 28°C黑暗中酶解8 12个小时，其中酶解液为:1.5 3%纤维素酶+0.5 2%离析酶+ 0.5 0.7mol / L甘露醇+3 8mmol/L CaCl2.2H20+0.5 0.7mmol/L KH2PO4, pH 6.8 7.0,并经过滤灭菌； 3)云南大百合原生质体纯化:上述酶解后，用孔径为300目的细胞筛将原生质体酶解液过滤至无菌的离心管中，除去较大组织和大量细胞团，将离心管置于IOOOrpm下离心6min ;离心结束后去除上清液留沉淀,用5 8ml CPff13将沉淀悬浮，IOOOrpm下离心5min,离心结束后去除上清液留沉淀，在离心管中加入3 5ml CPff 21，然后再在其上面缓慢的加入1 2 ml CPff 13,900rpm下离心7min,原生质体在两液面间形成一条带,其它杂质及少量原生质体沉于管底，将界面处原生质体吸出，用3 5ml 1/2MS+1.2mol/L蔗糖液体培养基洗漆I 2次，IOOOrpm下离心5min弃去上清液,获得纯净原生质体备用； 4)冻存:取0.1 0.2g上述原生质体，放入2ml冻存管中，在室温下加入I 1.5ml预处理液，预处理液为:25%PVS2+75%MS放置30 40min，800rpm下离心3min，收集原生质体，用I 1.5ml的60%PVS2+40%MS于(TC下处理5 IOmin, 800rpm下离心3min，收集原生质体，马上加入0°C下预冷的新鲜的玻璃化试剂100%PVS2 I 1.5ml,脱水3 5 min,快速投入液氣中保存； 5)解冻:将冻存管置于35 45°C水浴中解冻，800rpm下离心5min,收集原生质体,用3 5ml 1/2MS+1.2mol/L蔗糖液体培养基洗涤，800rpm下离心5min，去上清，重复洗涤I次，再用MS+2 3 mg/L KT+1 2 mg/L 2，4-D +3%蔗糖液体培养基悬浮原生质体，得到保存后的原生质体。
2.根据权利要求1所述的大百合原生质体超低温保存方法，其特征在于以上步骤I)、3)中的培养基经121°C高压灭菌20分钟。
3.根据权利要求1所述的大百合原生质体超低温保存方法，其特征在于以上步骤4)中PVS2和MS经121 °C高压灭菌20分钟。
4.权利要求1所述的大百合原生质体超低温保存后的活性鉴定方法，其特征在于按以下步骤进行: O活性鉴定:用0.01%荧光素双醋酸酯测定原生质体存活率，每个样品重复3次，每重复统计5个视野，取平均值，原生质体活力=(发绿色荧光的原生质体数+原生质体总数)X 100%，检测冻存后原生质体存活率可达55% ； 2)原生质体固体看护培养: (1)取上述冻存后有活力的悬浮原生质体，再加入等量融化并预冷至40°C的MS+2 .3 mg/L KT+1 2 mg/L 2, 4-D +0.7%琼脂糖+3%蔗糖培养基，混匀后倒入培养皿中，待凝固后，将包埋原生质体后的固体培养基用刀或镊子分成6 8份，获得包埋原生质体； (2)在一个培养瓶中加入20 30ml的固体培养基:MS+2 3mg/L KT+1 2 mg/L·2，4-D +0.6%琼脂粉+3%蔗糖，将活跃生长的愈伤组织接种到培养基上，再在愈伤组织上放一片滤纸，培养基和滤纸均灭菌； (3)将切下的包埋原生质体后的固体培养基放到上述滤纸上，25°C下暗培养； (4)在显微镜下观察原生质体的分裂，培养2 3天可见原生质体再生细胞壁，4 6天后可见第一次分裂的细胞，30 45天可见原生质体再生细胞团。
5.根据权利要求4所述的大百合原生质体超低温保存后的活性鉴定方法，其特征在于所述步骤2)中的培养基和滤纸均经121°C高压灭菌20分钟。
全文摘要
本发明是一种云南大百合原生质体超低温保存方法及活性鉴定方法。通过1)愈伤组织诱导，2)云南大百合原生质体分离，3)云南大百合原生质体纯化，4)冻存及解冻等步骤得到保存后的原生质体。通过活性鉴定、原生质体固体看护培养，在显微镜下观察原生质体的分裂，培养2～3天可见原生质体再生细胞壁，4～6天后可见第一次分裂的细胞，30～45天可见原生质体再生细胞团。本发明为云南大百合这一珍稀濒危、集观赏、食用及药用为一体的种质长期保存提供了新的科学途径。
文档编号A01N3/00GK103070163SQ201310035300
公开日2013年5月1日 申请日期2013年1月30日 优先权日2013年1月30日
发明者和凤美, 朱永平, 秦晓杰 申请人:云南农业大学