专利名称：一种小鼠异基因骨髓移植后cGVHD模型的建立方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种小鼠异基因骨髓移植后cGVHD模型的建立方法。建立具有模拟临床异基因造血干细胞移植后慢性移植物抗宿主病特点的疾病模型，可为慢性移植物抗宿主病的发生机制和诊治方法提供研究平台。
背景技术：
慢性移植物抗宿主病是异基因造血干细胞移植后的主要并发症和死亡原因，成为影响患者生活质量和长期生存的关键因素。进一步明确cGVHD发生机制，研究积极有效的治疗方法，降低或减轻其发生及病程，具有重要的实际意义。因此，cGVHD动物模型的建立，是转化医学研究的重要基础。目前大部分cGVHD动物模型建立在H-2抗原半相合或微小不合的小鼠间移植，主要表现为狼疮样(SLE-cGVHD)，受累靶器官主要为皮肤、肾脏、肝脏和小肠；及硬皮样(Scl-cGVHD)，受累靶器官主要为皮肤。肺部cGVHD的模型曾有个别报道，因需要在预处理过程中使用环磷酰胺，考虑到药物本身对肺部的损害作用，该模型还有待进一步优化。本研究使用H-2抗原半相合小鼠，供鼠、受鼠均来源于国内常用的小鼠品系，方法简便；并且本研究中供受鼠配对模式与国内外相似研究报道不同，输注脾细胞数量较少，成模时间及症状符合临床异基因造血干细胞移植后慢性移植物抗宿主病的发生发展特点，肺部及皮肤cGVHD的表现非常典型，肝脏亦有部分cGVHD的表现。本方法提供了研究cGVHD的新模型，为国内大多数研究中心能够开展cGVHD发病机制、药物试验、细胞免疫治疗等相关研究奠定基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种小鼠异基因骨髓移植后cGVHD模型的建立方法，通过以下步骤实现:
(I)以 C57BL/6 雌鼠(H_2b)与 BALB/c 雄鼠(H_2d)杂交出的 CB6F1 (H_2bxd)代雄性小鼠作为供鼠；(2)以BALB/c (H_2d)雌性小鼠作为受鼠；(3 )受鼠接受全身照射预处理后，将获自供鼠的骨髓细胞BMC悬液及脾细胞SpC悬液注射至受鼠。优选地，所述供鼠及受鼠均采用8周龄小鼠。具体地来说，所述步骤(3)中，供鼠骨髓细胞BMC悬液的制备如下:以颈椎脱臼法处死供鼠后，放入75%乙醇中浸泡3 5min，无菌剥离股骨和胫骨，用RPMI1640培养液冲洗骨髓腔，收集含有骨髓的冲洗液制成单细胞悬液，过滤后用红细胞裂解液破除红细胞，RPMI1640洗涤若干次，计数并用RPMI1640重悬细胞，调整至5X 10~7/mL细胞浓度备用。具体地来说，所述步骤(3)中，供鼠脾细胞SpC悬液的制备如下:以颈椎脱臼法处死供鼠后，放入75%乙醇中浸泡3飞min，无菌取出脾脏，去除脾脏周围系膜组织，移入平皿内用RPMI1640培养液洗涤若干次，碾磨，收集细胞冲洗液制成单细胞悬液，过滤后用红细胞裂解液破除红细胞，用RPMI1640洗涤若干次，计数并用RPMI1640重悬细胞，调整至
2.5X10~7/mL细胞浓度备用。具体地来说，所述步骤(3)中，移植当日受鼠接受直线加速器700cGy单次全身照射预处理，照射后立即补充饮水，休息4飞小时后经尾静脉注射终体积为0.4mL的骨髓细胞BMC悬液及脾细胞SpC悬液。优选地，所述步骤(3)中，注射给受鼠的骨髓细胞BMC悬液的用量为1X10~7BMC，脾细胞SpC悬液的用量为5X10~6。本发明通过应用H-2抗原半相合子代小鼠的骨髓及脾细胞，移植给致死剂量辐照后的父代但不同性别的小鼠，建立一种异基因骨髓移植后cGVHD模型。其具有如下特点:(O该模型具有模拟临床上异基因造血干细胞移植后慢性移植物抗宿主病的特点；(2)建模型效率高，重复性好；(3)造模所需小鼠容易获得，过程简单易行；(4)肺部、皮肤、肝脏等多器官同时发生典型病理改变；(5)移植后的小鼠存活时间长，更接近人类cGVHD的病征表现，为在活体动物内进行防治人类cGVHD的研究提供新的实验平台。
图1是cGVHD实验组小鼠的临床评分示意图(图例中每个时间点的评分以均数土标准差表示，η = 5)图2是cGVHD实验组小鼠临床表现；图3是空白对照组和cGVHD实验组小鼠移植后+135d染色体图；图4是移植对照组和cGVHD实验组小鼠135d处死后分离的肺、皮肤和肝脏的病理活检HE染色图。
具体实施例方式本发明结合附图和实施例作进一步的说明。本实验所用小鼠均购自广州市中山大学实验动物中心。实施例一本例为本发明的小鼠异基因骨髓移植后慢性移植物抗宿主病模型的建立例，按以下步骤操作:一、供鼠准备1、无特定病原体(Specefic pathogen Free, SPF)级 C57BL/6 雌性小鼠(H_2b)8 —10周龄与SPF级BALB/c雄性小鼠(H_2d) 8—10周龄，2:1比例交配。2、选择杂合子Fl代，雄性，饲养至8周龄，作为供鼠备用。二、受鼠准备SPF级BALB/c小鼠(H_2d),雌性,8周龄,作为受鼠。将受鼠随机分为4组,每组5只;其中，A、正常对照组:同步饲养，无干预；B、放射对照组:TB I+RPMI1640，即对组内小鼠进行全身照射(TBI)处理，经尾静脉注射PRMI1640培养液；C、移植对照组:TBI+1X 10~7BMC，即对组内小鼠进行全身照射(TBI)处理，经尾静脉注射经PRMI1640培养液处理的骨髓细胞BMC悬液；D、cGVHD组:TBI+1 X 10~7BMC + 5X 10~6SpC，即对组内小鼠进行全身照射(TBI)处理，经尾静脉注射经PRMI1640培养液处理的骨髓细胞BMC悬液及脾细胞SpC悬液。三、根据以上分组，采用下述步骤进行移植实验操作:1、异基因骨髓移植前一周对各组受鼠在层流动物房内接受添加抗生素(红霉素250mg/L，庆大霉素32万U/L)的灭菌饮水进行肠道准备，并维持至移植后3周。2、移植当日(0d)，对B、C、D组受鼠接受直线加速器700cGy单次全身照射(TBI)预处理。照射后立即补充饮水，休息4飞小时后经尾静脉注射终体积为0.4mL的移植细胞悬液。对照组B组小鼠中每只从尾静脉输注RPMI1640培养液0.4mL ；对照组C组小鼠中每只从尾静脉输注RPMI1640细胞悬液0.4mL,包括1X10~7BMC ；D组小鼠中每只从尾静脉输注RPMI1640细胞悬液0.4mL，包括I X 10~7BMC和5X10~6SpC。其中，骨髓细胞(BMC)悬液制备操作如下:采用颈椎脱臼法处死供鼠，立即放入75%乙醇中浸泡3 5min ;超净工作台中无菌剥离股骨和胫骨，用RPMI1640培养液冲洗骨髓腔，收集含有骨髓的冲洗液通过4号针头制成单细胞悬液，过滤，用红细胞裂解液破除红细胞，RPMI1640洗涤3次，计数并用RPMI1640重悬细胞，调整至5X 10~7/mL细胞浓度备用。脾细胞(SpC)悬液制备操作如下:无菌取出脾脏，小心去除脾脏周围系膜组织，移入平皿内用RPM I1640培养液洗涤3遍，然后置于200目不锈钢筛网中用2mL注射器内芯轻轻碾磨，收集细胞冲洗液通过4号针头制成单细胞悬液，过滤，用红细胞裂解液破除红细胞，用RPMI1640洗涤3次，计数并用RPMI1640重悬细胞，调整至2.5 X 10~7/mL细胞浓度备用。移植后每天观察小鼠一般状态，包括体重、皮疹、脱毛、结痂、弓背、腹泻等，移植14天后每3天进行一次临床评分，标准参见表I ;濒死小鼠处死取材，其存活时间记至处死次日；实验终点为移植后+135d。外周血白细胞计数:每组小鼠于+7d、+10d和+14d计数WBC监测造血重建情况。计数方法:断尾取血10 μ L，加入190 μ L白细胞稀释液中混匀，然后滴加到细胞计数板上，水平静置Imin后计数4个大方格中细胞数(N)，WBC= (Ν+20)Χ10~9/L0移植观察记录表明:Α组小鼠正常存活至实验终点；Β组小鼠中位存活12.5天，14天内全部死亡；C、D组小鼠存活至实验终点。以上记录表明C、D组均移植成功，且存活时间达到100天以上，比现有的类似疾病动物模型建立的存活时间长。实施例2本例为小鼠异基因骨髓植入检测例。取移植后+135d的受鼠进行检测，按以下步骤进行:1、秋水仙素处理:在做实验前3 4小时，向小鼠腹腔注射0.1 %的秋水仙素(2-4yg/g)。2、取股骨:实验时，用颈椎脱臼法迅速将小鼠处死，立即用剪刀剪去后肢的皮肤和肌肉，连同关节一起取下两侧股骨，剔净其上肌肉。3、取骨髓细胞:用注射器吸取6ml生理盐水，将注射器针头插入骨髓腔的一端，用生理盐水冲出骨髓细胞至离心管，反复冲洗直至骨腔变白。将收集到的骨髓细胞溶液平衡后放入离心机，以1000r/min离心IOmin,吸去上清液。4、低渗:根据细胞量多少，加入0.075mol/L KCl低渗液5_6ml，用吸管轻轻吹打混匀，在37 °C恒温水浴箱内低渗20-30分钟。5、预固定:低渗完毕,立即加l_2ml新配制的Carnoy固定液,轻轻吹打之后，以2000r/min离心IOmin,小心吸管吸去上清液。6、固定:沿离心管壁缓慢加入固定液7ml，用吸管吹打成细胞悬液。2000rpm的速度离心10分钟,倾去上清。7、再固定:重复步骤6的操作至上清基本无色清晰。8、制备细胞悬液:沉淀物中加入适量固定液，用吸管轻轻吹打成细胞悬液。9、滴冰片:从冰箱里取出预冷的载玻片，手持吸管在载玻片上方约IOcm处向下滴片，2-3滴，使悬液均匀扩散与玻片之上,多余的液体可小心倾去。10、干燥、火焰 固定:玻片于酒精灯外焰迅速来回几下。11、玻片老化:置于37° C温箱1-2天后，于65° C烤箱中24h。12、染色:低浓度胰酶消化,清水洗净,Giemsa染液室温下染色10分钟左右。清水冲洗，在室温下自然干燥。13、镜检:先用低倍镜找到一好的分裂相区域，然后转用高倍镜观察。如图3所示，为来自于A组(空白对照组)和D组(cGVHD组)小鼠的染色体图，箭头所示为Y染色体。图中染色体的改变也进一步表明D组小鼠移植成功。实施例3本例为cGVHD组小鼠的临床及病理检测例。一、对D组小鼠进行慢性GVHD的临床评分，其评分标准如表I所示:表I慢性GVHD的临床评分标准
权利要求
1.一种小鼠异基因骨髓移植后CGVHD模型的建立方法，通过以下步骤实现: (1)以C57BL/6小鼠(H-2b)与BALB/c小鼠(H_2d)杂交出的Fl代雄性小鼠作为供鼠； (2)以BALB/c(H-2d)雌性小鼠作为受鼠； (3)受鼠接受全身照射(TBI)预处理后，将获自供鼠的骨髓细胞BMC悬液及脾细胞SpC悬液注射至受鼠。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述供鼠及受鼠均采用8周龄小鼠。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤(3)中，供鼠骨髓细胞BMC悬液的制备如下:以颈椎脱臼法处死供鼠后，放入75%乙醇中浸泡3 5min，无菌剥离股骨和胫骨，用RPMI1640培养液冲洗骨髓腔，收集含有骨髓的冲洗液制成单细胞悬液，过滤后用红细胞裂解液破除红细胞，RPMI1640洗涤若干次，计数并用RPMI1640重悬细胞，调整至5X10~7/mL细胞浓度备用。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤(3)中，供鼠脾细胞SpC悬液的制备如下:以颈椎脱臼法处死供鼠后，放入75%乙醇中浸泡:T5min，无菌取出脾脏，去除脾脏周围系膜组织，移入平皿内用RPMI1640培养液洗涤若干次，碾磨，收集细胞冲洗液制成单细胞悬液，过滤后用红细胞裂解液破除红细胞，用RPMI1640洗涤若干次，计数并用RPMI1640重悬细胞，调整至2.5X10~7/mL细胞浓度备用。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤(3)中，移植当日受鼠接受直线加速器700cGy单次全身照射预处理，照射后立即补充饮水，休息4飞小时后经尾静脉注射终体积为0.4mL的骨髓细胞BMC悬液及脾细胞SpC悬液。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:所述步骤(3)中，注射给受鼠的骨髓细胞BMC悬液的用量为1X10~7BM C，脾细胞SpC悬液的用量为5X10~6。
全文摘要
本发明提供一种小鼠异基因骨髓移植后慢性移植物抗宿主病(cGVHD)模型的建立方法，通过制备异基因CB6F1(H-2bxd)雄性供鼠的骨髓和脾细胞，尾静脉输注给BALB/c(H-2d)雌性受鼠造模而实现。该模型造模方法具有模拟临床上异基因造血干细胞移植后慢性移植物抗宿主病的发生发展特点；过程简单易行，建模效率高，重复性好，国内外尚无相同报道；特别是肺部、皮肤的典型病理改变，为在活体动物内进行防治人类cGVHD的研究提供实验平台。
文档编号A01K67/027GK103114074SQ20131005522
公开日2013年5月22日 申请日期2013年2月21日 优先权日2013年2月21日
发明者杜欣, 翁建宇, 黄欣, 吴萍, 耿素霞, 赖沛龙 申请人:广东省人民医院