专利名称：慢性髓系白血病耐IFN-α标志物基因的诊断用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及干扰素耐药性领域，具体涉及慢性髓系白血病耐IFN-a标志 物基因的诊断用途。
背景技术：
慢性髓系白血病(chronic myelogeneous leukemia, CML)又称慢性粒细胞性 白血病，是起源于骨髓多能干细胞的一种较为常见的恶性骨髓增生性疾病， CML临床上以乏力、消痩、发热、脾肿大及白细胞异常增高为主要表现。CML 在世界不同地区的发病率不一致。我国的CML发病率呈上升趋势，男性发病 率高于女性。
CML的治疗己从传统的抗增殖化疗发展到生物学治疗，包括异基因骨髓 移植(ALLO-BMT)、异基因造血干细胞移植(ALLO-HSCT)、干扰素 (interferon, IFN)治疗。基于BMT受供体来源、患者年龄等因素的限制，实 际能接受BMT的患者为数不多，而大部分患者需接受IFN治疗，IFN是具有广 泛抗病毒和免疫调节作用的可溶性糖蛋白，研究表明，IFN-a具有多方面抗肿 瘤的作用抑制肿瘤细胞增殖、诱导凋亡以及调节免疫系统。接受IFN-a治疗 的CML患者中部分可获得血液学缓解，其中仅少数患者获得细胞遗传学缓解； 部分患者则呈现对IFN-a治疗的耐受，可分为原发性耐药和继发性耐药两类， 其耐药性形成的分子机制尚在研究中。
谷胱甘肽-S-转移酶(Glutathione S-transferases， GSTs)同工酶家族成员 GSTpi与肿瘤细胞的耐药性形成有关；GSTpi是GSTPl基因的表达产物，是重 要的II相生物转化酶之一，广泛分布于人体各组织，主要参与药物代谢。研 究发现，多株对化疗耐药的细胞的GSTP1 mRNA水平升高；多种耐化疗药物 的人类肿瘤，尤其是具有多药耐药基因(MDR)表型的肿瘤细胞都高表达GSTP1;癌组织中高表达GSTP1的非小细胞性肺癌患者对化疗药物的耐受性 显著高于GSTPl低表达患者；高表达GSTPl的转移癌组织的GSTpi酶活性明显 升高。GST pi既可通过代谢外源性物质而介导肿瘤耐药，又可通过调节细胞 凋亡通路中的部分酶活性而抑制药物诱导的细胞凋亡。
迄今为止，尚未有具有干扰素抗性的肿瘤细胞高表达GSTP1基因的相关 报道。
发明内容
本发明的目的在于克服常规白血病诊断技术不能检测其干扰素耐受的缺 点，首次在mRNA水平和蛋白质水平鉴定了 GSTP1基因表达与慢性髓系白血 病的干扰素耐受的相关性，提供一种慢性髓系白血病耐IFN-a标志物基因的 诊断用途。
本发明目的通过以下技术方案实现
运用RT-PCR分析发现GSTP1基因在呈现IFN-a抗性的慢性髓系白血病 细胞株KT-1/A3R细胞中高表达，而在对IFN~a敏感的姊妹株KT-1/A3细胞 中的表达水平甚低；运用Western blotting分析发现IFN-a耐药株KT-1/A3R 细胞高表达GSTpi蛋白质，而IFN-a敏感株KT-1/A3细胞仅微量表达该蛋白 质。以上结果表明，GSTP1基因在KT-l/A3R细胞对IFN-a的耐受机制中发 挥着重要的作用，可以作为慢性髓系白血病耐受IFN-a的标志物基因用于诊 断并指导治疗。
本发明的技术方案能产生以下技术效果
IFN-a耐药株KT-1/A3R细胞与IFN-a敏感株KT-1/A3细胞中GSTP1基
因表达量相差近十倍，可以作为慢性髓系白血病耐IFN-a的标志物基因用于 慢性髓系白血病的IFN~a耐药诊断，以尽早明确慢性髓系白血病患者对IFN-a 治疗的敏感性，从而指导其临床治疗。
图1 GSTP1基因的RT-PCR凝胶电泳图谱
M: marker; 1: KT-1/A3R组；2: KT-1/A3R组；
3: KT-1/A3组； 4: KT誦1/A3组 图2 GSTPl基因表达水平的统计学分析(n:3)
1: KT-1/A3R组；2: KT-1/A3R组；
3: KT-1/A3组； 4: KT-1/A3组 图3 GST pi蛋白质的Western blotting分析图谱
1: KT-1/A3组； 2: KT-1/A3组；
3: KT-1/A3R组；4: KT-1/A3R组 图4 GSTpi蛋白质表达的统计学分析(11 = 3)
1: KT-1/A3组； 2: KT-1/A3组；
3: KT-1/A3R组；4: KT-1/A3R组
具体实施例方式
实施例1:用RT-PCR验证GSTP1基因在KT-1/A3和KT-1/A3R细胞中的表 达差异
人慢性髓系白血病细胞株KT-1/A3和KT-1/A3R由日本爱媛大学Ikuya Sakai教授惠赠。 1、引物设计
在GeneBank中査到了 GSTP1基因(登陆号NMJ)00852)及内参P-actin 基因(登陆号NMJ)01101)的cDNA序列，用Primer 5软件设计扩增引物，序 列如下
GSTP1-F: 5' GCCCTACACCGTGGTCTATT 3' GSTP1-R: 5' GACGCAGGATGGTATTGGA 3' P國actin-F: 5' GTGGACATCCGCAAAGAC 3'
卩-actin-R: 5' AAAGGGTGTAACGCAACTAA 3' 引物由上海生工公司合成，扩增产物大小分别是302 bp(p-actin)和209 bp(GSTPl)，产物均跨基因组DNA序列中一个以上内含子。
2、 细胞培养及总RNA提取
将密度为2xl05 cells/ml的KT-1/A3、 KT-1/A3R细胞各2瓶置37°C、 5% C02培养箱中培养48 hr。然后用TRIzol抽提上述细胞的总RNA。
(1) 培养的细胞于2000 g室温离心5min,弃上清，每管细胞数约为l 5xl06。
(2) 向每管细胞中加入lmlTRIzol，用移液管反复吹打使之充分裂解。
(3) 15。C 30。C孵育5 min，每管加0.2 ml三氯甲烷，盖紧管盖，用力摇 晃离心管15sec，于15。C 30。C孵育2min， 4°C、 12000 g离心15 min， RNA 在水相层(上层)中。
(4) 将水相层转移到另一个离心管中，每管加0.5ml异丙醇，15。C 3(TC 孵育10min， 4°C、 12000 g离心10 min。
(5) 移去上层悬液，加lml75X乙醇，颠倒混合样品，在4。C、 7500 g离 心5 min。
(6) 移去上层悬液，空气干燥10min 15min，取25 nl无RNA酶的去离 子蒸馏水溶解RNA，室温孵育10min。
(7) 取少量已溶解的RNA用于电泳和浓度测定，余下的置一7(TC保存。 RNA经1.0%琼脂糖凝胶电泳，EB染色后以凝胶成像系统观察结果。
A26o/A28o值在1.8 2.0之间，浓度约为lpg/nl，结果表明RNA样品无降解， 可以用于RT-PCR分析。
3、 逆转录(RT)生成cDNA第一条链，反应体系为 MgCl2(25mM) 2pl 1 OxRT Buffer (1 OOmM Tris画HCl，500mM KC1) 1 nl dNTP Mixture( 1 OmM each) 1 pl RNase Inhibitor(40U尔l)0.25 pl
AMV Reverse Transcriptase (5U/jal) Oligo dT-Adaptor Primer (2.5pmol/|il) RNA
RNase Free dH20
0.5jil 至10^1
反应条件为30。C、 lOmin; 42°C、 60min; 99。C、 5min; 5°C、 5min。 4、 PCR扩增GSTP1和卩-actin基因cDNA，反应体系为
将此反应液加入到逆转录结束后的PCR反应管中，轻轻混匀。PCR反应 程序为94。C预变性5min， 94。C变性30s、 55。C退火30s、 72。C延伸30s，扩 增30循环后于72X:延伸5min。
RT-PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，采用凝胶成像系统分析EB染色 后的电泳图谱。结果显示，GSTP1基因在KT-1/A3R细胞中高表达，而在 KT-1/A3细胞中表达甚微(见图1)，统计学分析表明两株细胞中表达量相差 近10倍(见图2)。
实施例2:用Western blotting验证GST pi蛋白质在KT-1/A3与KT-1/A3R
细胞中表达的差异
1、 细胞的准备将密度为2xl05 cells/ml的KT-1/A3、 KT-1/A3R细胞各2瓶 置37'C， 5% C02培养箱中培养48hr。
2、 蛋白质样品的制备
1) 将培养液倒入15 ml离心管中，于2500 g离心5 min。
2) 弃上清，加入5 ml PBS，轻摇后于2500 g离心5 min，弃上清后用PBS 重复洗涤离心一次。
5 xPCR Buffer (含dNTP) Taq Polymerase (5U/pl) PCR Primer (F)(10mM) PCR Primer (R) (10mM) dH20
3) 力B 400 pl RIPA裂解液(50 mM Tris腸HCl， pH 7.4; 150 mM NaCl; 1 mM EDTA; 1% Triton X-100; 1%脱氧胆酸钠；0.1% SDS)悬浮细胞沉淀并转移 到1.5 ml离心管中，加入蛋白酶抑制剂PMSF(用异戊醇配制成100 mM的储 存液，一20'C保存)至终浓度为1 mM，冰浴裂解30min。
4) 于4。C， 12000g离心10min，取上清分装于0.5 ml离心管中。
3、 蛋白质样品的定量
采用BCA法进行蛋白质样品的定量，蛋白质浓度为2mg/ml 5 mg/ml， 可用于Western blotting分析。
4、 SDS-PAGE胶的制备及蛋白质电泳
制备12%的分离胶和5%的浓縮胶，分别取来源于KT-1/A3、 KT-1/A3R 细胞的蛋白质样品，热变性后于每孔上样50pg蛋白质，以80V恒压电泳至 上样缓冲液中的溴酚蓝区带达凝胶底部。
5、 转膜
电泳完毕后取出凝胶，置入转膜缓冲液(48mMTris,pH9.2; 39 mM甘氨 酸；20%甲醇)中轻轻摇动20 min，以去除胶上吸附的盐及去污剂；用100% 甲醇浸泡PVDF膜15 s，转移到转膜缓冲液中浸泡20 s;在半干型电泳转移槽 的正极板上依次铺两层浸有正极缓冲液I (300 mM Tris; 10%甲醇；pH 10.4) 的湿滤纸、 一层浸有正极缓冲液n(25mMTris; 10%甲醇；pH 10.4)的湿滤纸、 膜、凝胶、三层浸有负极缓冲液(25mMTris; 192mM甘氨酸；pH9.4)的湿滤 纸，标记膜，去除各层间的气泡，盖上负极板，接通电源。转膜lhr;转膜完 毕后将膜上转有蛋白质Marker的泳道剪下进行考马斯亮蓝染色。
6、 封闭
将载有待分析蛋白质的PVDF膜用TBS浸湿后，移至含有封闭液的平皿 中，以脱色摇床低速振摇lh。
7、 抗体孵育
用适量TBST (Tris-Buffered Saline Tween-20)稀释一抗，从封闭液中取
出PVDF膜，用滤纸吸去残留液后放入杂交袋中，加入一抗工作液，室温孵 育l h。用TBST溶液振摇洗膜3次，每次IO min。以TBST稀释二抗6000 倍，将膜和二抗工作液加到杂交袋中，室温孵育1 h。用TBST振摇洗膜4次， 每次10min。 8、化学发光及显影定影
将免疫印迹化学发光试剂盒(ECL试剂盒)中的A和B两种试剂在保鲜 膜上等体积混合，lmin后将经抗体孵育后的PVDF膜盖于A、 B试剂混合液 使之与其充分接触，静置lmin，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，并以保 鲜膜包裹，将PVDF膜载有蛋白质的一面朝上，放入X光片曝光暗夹中。在 暗室中将适当大小(长和宽均超过膜约1厘米)的X光片放于暗夹中的PVDF 膜上，关上暗夹，曝光30s;打开暗夹，取出X光片迅速浸入显影液中显影， 待出现明显条带后即刻终止显影；取出X光片用清水冲洗后浸入定影液中， 至X光片背景透明为止。根据显色条带的深浅适当调整曝光时间和显影时间 使条带更清晰并尽量降低背景。最后用自来水反复冲洗X光片以去除残留的 定影液，室温晾干。
结果显示，KT-1/A3R细胞高表达GST pi蛋白质，而KT-1/A3细胞仅微 量表达该蛋白质(见图3)，统计学分析表明两株细胞中GSTpi蛋白质的表达 量相差近10倍(见图4)。
权利要求
1、慢性髓系白血病耐IFN-α标志物基因的诊断用途，其特征在于将谷胱甘肽S-转移酶GSTP1基因作为慢性髓系白血病耐IFN-α治疗的标志物基因，用于慢性髓系白血病的耐IFN-α诊断，从而明确诊断并指导治疗。
2、 根据权利要求1所述的慢性髓系白血病耐IFN-a标志物基因的诊断用 途，其特征在于运用RT-PCR分析发现GSTPl基因在IFN-a抗性株KT-1/A3R 细胞中高表达，而在IFN~a敏感株KT-1/A3细胞中的表达水平甚低；运用 Western blotting分析发现IFN-a耐药株KT-1/A3R细胞高表达GST pi蛋白质， 而IFN~a敏感株KT-1/A3细胞仅微量表达该蛋白质。
全文摘要
本发明涉及慢性髓系白血病耐IFN-α标志物基因的诊断用途，运用RT-PCR分析发现GSTP1基因在IFN-α抗性株KT-1/A3R细胞中高表达，而在IFN-α敏感株KT-1/A3细胞中的表达水平甚低；运用Western blotting分析发现IFN-α耐药株KT-1/A3R细胞高表达GST pi蛋白质，而IFN-α敏感株KT-1/A3细胞仅微量表达该蛋白质，提示GSTP1基因可以作为耐IFN-α标志物基因用于慢性髓系白血病的耐药诊断，从而明确诊断并指导治疗。
文档编号C12Q1/68GK101100692SQ200710035410
公开日2008年1月9日 申请日期2007年7月23日 优先权日2007年7月23日
发明者胡维新, 陈汉春 申请人:中南大学