专利名称：：东方田鼠日本血吸虫抗性基因及其编码的多肽的制作方法
技术领域：
：本发明涉及基因工程领域，尤其涉及从东方田鼠骨髓细胞中分离得到的抗日本血吸虫相关基因及该基因编码的多肽。
背景技术：
：日本血吸虫病是一种严重危害人类健康的人兽共患性寄生虫病，可以感染包括人类在内的40多种哺乳动物。我国洞庭湖血吸虫病疫区栖居的野生动物东方田鼠对日本血吸虫具有天然抗性，日本血吸虫在其体内不能发育成熟和产卵，是目前所知的疫区唯一对日本血吸虫感染具有这种特殊抗性的啮齿类动物，而且这种特性能稳定地进行遗传。东方田鼠分布的范围很广，有证据表明，洞庭湖区与黄河以北(宁夏)的东方田鼠均对日本血吸虫感染具有抗性。实验室的研究证明，经人工感染血吸虫尾蚴于东方田鼠后，尽管虫体在感染后l沃内能正常发育，但从第12天开始，虫体生长发育停滞，第2028天虫体在体内全部消亡。现已证明，东方田鼠血清和淋巴细胞在体外对血吸虫童虫白质在抗日本血吸虫的过程中发挥了重要作用。实验室驯化饲养的东方田鼠与野生东方田鼠均具有相同的特性。东方田鼠是目前所知的疫区唯一对日本血吸虫感染具有这种特殊抗性的啮齿类动物，而且这种特性能稳定地进行遗传。从东方田鼠体内寻找抗日本血吸虫的特异基因，并且用于血吸虫病的预防和治疗，这成为了研究者们积极探索的领域，如何获得抗血吸虫感染的疫苗来有效防治血吸虫，成为了人们渴望解决的问题。
发明内容本发明的目的在于从东方田鼠体内分离得到抗日本血吸虫的特异基因。本发明的另一目的在于提供由东方田鼠抗日本血吸虫的特异基因表达产生的抗性蛋白质。为了达到上述发明目的，本发明利用表达克隆技术，从东方田鼠骨髓cDNA文库中分离到一个抗日本血吸虫的抗性相关基因E77.43,该基因的核苷酸序列如SEQIDNO:l所述。根据SEQIDNO:l的第532到867位核苷酸序列，编码得到产物为111个氨基酸残基的多肽，其氨基酸序列如SEQIDNO:2所述。将本发明的基因E77.43插入真核表达载体中，得到基因E77.43的重组表达载体；用重组表达载体转染宿主细胞，包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞等等，使基因E77.43在宿主细胞中表达和生产抗性蛋白。本发明从东方田鼠骨髓细胞中分离得到的日本血吸虫抗性相关基因E77.43及该基因的重组载体和表达产物，能用于预防人、畜对日本血吸虫的感染或治疗血吸虫病。研究表明将本发明的东方田鼠抗日本血吸虫抗性相关基因E77.43在真核表达系统中表达，其表达产物在体外对血吸虫童虫具有明显的杀伤作用。利用原核表达系统，在大肠杆菌中表达东方田鼠抗性蛋白，纯化后的蛋白有明显的杀灭血吸虫童虫的效果。图1:东方田鼠抗日本血吸虫抗性相关基因E77.43童虫杀伤死亡率；图2:A是日本血吸虫童虫经东方田鼠抗日本血吸虫抗性相关基因E77.43表达产物作用的结果(百倍显微镜下)；B是对照组(百倍显微镜下)。具体实施方式实施例l无菌取东方田鼠股骨，分离肌肉及筋膜，剪去股骨两端，用6号注射器针头吸取RPMI-1640培养液冲洗骨髓腔，反复冲洗红骨髓，进行细胞计数，收集骨髓细胞。根据S有的方法(参见生物化学与生物物理学报，2003,35(2):143—148;生命科学研究，2003,7(1):41—47)提取mRNA、合成并构建东方田鼠骨髓细胞的cDNA文库。将cDNA文库中的cDNA片段用五"RI限制性内切酶切下，与真核表达载体pcDNAl.l连接，转化大肠杆菌TGl,制备质粒DNA并转染HEK293细胞，东方田鼠的基因在载体中巨细胞病毒启动子的驱动下得到高水平表达。这种含有各种不同cDNA片段的重组pcDNAl.l质粒，称为基因池。将构建好的东方田鼠骨髓cDNA文库均分为8个基因池(A-H),在LB培养基培养过夜，用质粒提取试剂盒提取、纯化质粒DNA，测定浓度，pcDNAl.l质粒为对照，同时转染HEK293细胞，48小时后收集转染上清，即为条件培养基。将条件培养基加入到体外培养的血吸虫童虫中，37'C、5%<:02培养，在96小时内连续观察，计算童虫死亡率，筛选得到杀伤活性最高的基因池。用上述同样方法，经三轮筛选分别获得有体外杀伤活性的亚基因池E和次级亚基因池E77。选择杀伤活性最髙的次级亚基因池E77铺板，挑取单个克隆，选取含不同插入长度的cDNA分别按上述筛选方法进行杀伤血吸虫童虫实验，克隆出东方田鼠抗日本血吸虫抗性相关基因E77.43,其抗日本血吸虫活性明显高于阴性对照组(如附图1)。对东方田鼠抗日本血吸虫抗性相关基因E77.43进行cDNA序列测定，得到该基因的核苷酸序列(如SEQIDNO:l所示)。利用基于NCBI的ORFFinder(OpenReadingFrameFinder)生物信息学技术对核酸序列进行可读框架分析，推导出532到867位核苷酸的编码产物为111个氨基酸残基的多肽链(如SEQIDNO:2所示)。其中，将东方田鼠骨髓cDNA转染到HEK293细胞及"条件培养基"的具体制备过程为将HEK293细胞(密度为每毫升lxl05个)按每孔0.5毫升接种于24孔培养板。第二天，制备脂质体-DNA混合物，将24孔板从培养箱中取出，放置超净工作台上，将DNA-脂质体复合物逐滴加到培养孔中，来回轻轻晃动培养板，以便让DNA-脂质体复合物均匀分散，将细胞置37'C、5%<:02培养，24小时后，用无血清的DMEM培养基淋洗细胞两遍，加入0.5毫升不含血清的DMEM培养基，继续培养48小时。收集细胞培养液，此细胞培养上清液称为"条件培养基"。其中，日本血吸虫童虫制备及体外杀伤试验具体过程为将阳性钉螺放入盛有去氯水的小烧杯中，置光照孵化箱中，调整温度为25'C左右，待尾呦逸出高峰时，收集尾蚴，将尾蚴移入未加血清的DMEM培养基中，1500转/min,离心5分钟，反复洗涤5次，将洗涤后的尾蚴移入含25%新鲜兔血清的DMEM培养液中，调整尾蚴密度为每毫升200条，按每孔1毫升加到24孔培养板中，置37'C、5。/。C02培养2448小时，让尾蚴自然脱尾，转变成童虫。吸去50%体积童虫培养液，加入等体积的条件培养基，于37'C、5^C02培养，在96小时内作连续观察，每24小时计数一次，计算童虫死亡率，对童虫杀伤率最高的条件培养基对应的基因池分为亚基因池、次级亚基因池及挑选单个克隆。实施例2:将东方田鼠抗日本血吸虫抗性相关基因E77.43插入到经限制性内切酶消化后的真核表达载体，转化大肠杆菌，从培养的大肠杆菌中提取重组真核表达载体。用重组真核表达载体转染真核细胞(包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞)，利用真核表达系统，在真核细胞中表达和生产抗性蛋白，收集含抗性蛋白的细胞培养液，离心去细胞碎片，将培养上清与体外制备的脱尾的日本血吸虫童虫共培养，在光学显微镜下连续计数96小时，以空载体表达产物作为阴性对照，观察日本血吸虫童虫活力。结果显示东方田鼠抗日本血吸虫抗性相关基因E77.43的真核表达产物在体外对血吸虫童虫具有明显的杀伤作用(如附图2)。实施例3:将东方田鼠抗日本血吸虫抗性相关基因E77.43插入到经限制性内切酶消化后的真核表达载体pcDNAl,构建重组载体，经静脉注射将重组载体注入模型小鼠，使机体细胞摄入抗性相关基因并实现该基因在小鼠体内的高效表达，再感染日本血吸虫尾呦，40尾/鼠，待41天即感染小鼠体内的尾蚴发育成熟为成虫，剖杀小鼠，计数小鼠体内回收虫数、每克肝组织的虫卵数，计算减虫率、减卵率。实施例4:将东方田鼠抗日本血吸虫抗性相关基因E77.43的编码序列插入到经限制性内切酶消化后的pQE30原核表达载体，转化大肠杆菌，利用原核表达系统，在大肠杆菌中表达东方田鼠抗性蛋白，纯化抗性蛋白。将纯化后的蛋白与血吸虫童虫一起体外培养，光镜下观察蛋白质杀灭血吸虫童虫效果(如表l所示)。表1东方田鼠E77.43基因原核表达产物的体外杀伤日本血吸虫童虫效果组别72h杀伤率(％)DMEM26.4空载体原核表达产物(100ng/ml)29.8E77.43原核表达产物(20ng/ml)29.6E77.43原核表达产物(100pg/ml)52.3E77.43原核表达产物(150ng/ml)57.1东方田鼠血清(培养基中血清浓度20%)77.2实施例4以逆转录病毒载体作为基因导入靶细胞的工具，将东方田鼠抗日本血吸虫抗性相关基因E77.43的cDNA序列插入到逆转录病毒载体pLXSN,构建重组逆转录病毒载体pLXSN/E77.43。利用基因转染技术将重组载体转染入病毒包装细胞PA317细胞，加入G418药物进行两轮筛选后，获得具有分泌病毒颗粒的阳性细胞克隆。收集阳性克隆细胞分泌上清，浓縮病毒，取病毒悬液置电镜扫描观察病毒颗粒，结果表明已获得足够量逆转录病毒，将病毒悬液无菌滤器过滤后，深低温保存备用。将小鼠先感染日本血吸虫尾蚴，再把制备的重组病毒经静脉或腹腔注射到小鼠体内，以空载体作阴性对照。待感染小鼠体内的尾蚴发育成为成虫，并产成熟虫卵41天时，剖杀小鼠，计数小鼠体内血吸虫回收虫数、每克肝组织的虫卵数，计算减虫率、减卵率。与对照组比较，PLXSN/E77.43组的减卵率显著提高(如表2)，因此说，E77.43基因的重组载体抗日本血吸虫的效果十分明显。表2pLXSN/E77.43重组逆转录病毒小鼠体内抗日本血吸虫的实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>注结果以均数士标准差表示上述东方田鼠抗日本血吸虫抗性相关基因E77.43的DNA序列插入各种真核表达载体，包括逆转录病毒载体、腺相关病毒载体、腺病毒载体等病毒载体，通过基因导入技术，建立转基因动物(包括水牛和其它家畜)，使这些动物对血吸虫产生永久抗性，用于阻断血吸虫病的传播和蔓延。序列提交SEQIDNO:l是东方田鼠抗日本血吸虫抗性相关基因E77.43的核苷酸序列；SEQIDNO:2是东方田鼠抗日本血吸虫抗性相关基因E77.43编码的多肽序列。序列表〈110〉中南大学〈120〉东方田鼠日本血吸虫抗性基因及其编码的多肽和用途〈160〉2〈210〉1<211>1994〈212>DNA〈213>东方田鼠种(奶'cr"ws/brf/s)〈400>1gtgtcttgagatgtcctggtcactcagattccatccctttggtaggatgaaaagatccag60acccgagaagggaaacctgctgttgatgcccgctatgaagctgcatgcaacaggctggcc120aacaaggcagtgC3gCggggctcggcagacaacgtgacggtgatggtggtgaggatagga腦cactgagggccagcacatgcactcttgacttgcaggttcattttgtttgtgcacagtgtg240tgtactcctgtgggacttctatggttgtaaataaaggtttctttttttcctagtcatttg300agttcctttaatttgctttg3gtg3Ctggtcctgggttaactgttgactttagaatatgc360tctgggtctgtccttgtcagaaccatcccggccatcttggacaggcccatgatgactgtc420atgtaggtcacatgctctcaccctcattagaactgcgttggggagtagtgggaccttgca480gtgggatgatgggtggceigtcaggctttgttcggttttctgtacagaacacatgttgagt540agttccagcaggaacccaggtgcggctggaaaggagcccat鄉taaaggtacctca/tgg600agtgccagtcccattggcctcctaaacagctacattcagctcactctcattcccttaaag660gactgttctggctttcacccagaagtcaccaccc3cc3tsgcattagactcactgttagt720ctcaggacttatattgggggcctagtaaggtactgctgcataaaacaaggtgcaaggaac780aagacttctggcctccacattcacatgctcacacatgaatgtatgcctgcacatactacg840tacaaaaaggaattatttttaaaataaccgaatgtgggaccagtgcactggctcagctgg900taaagatgcttcctgccaagcttgggaacctei8iattc犯tctccacaaagtggaagg卿960gacccactgtcgt鄉ctgtctcatctgacctccatctccacaccatggtatgcatattt1020caacctcccaaateiaatgcgiattcaagaaaaatgtaacttaaagagcatcagtgctaccc1080cttctccggggaatgagac3gcaatcctgctcggagactaggaccaggacagcctggcat1140acggaacagaacgccacctcatcagaaagcagaacacttttaattcagtaaactctgtag1200<formula>formulaseeoriginaldocumentpage9</formula>权利要求1.一种从东方田鼠骨髓细胞分离的DNA序列，其特征在于它具有如序列表中SEQIDNO1所述碱基序列。2.—种从东方田鼠骨髓细胞分离的DNA序列，其特征在于所述DNA的碱基序列至少表现出如SEQIDNO:l至少85%以上的序列一致性。3.如权利要求1或2所述DNA序列所编码的多肽，其特征在于它具有如序列表中SEQIDNO:2所述的氨基酸序列。4.一种表达载体，其特征在于含有如权利要求1或2所述的DNA序列。5.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于所述载体为真核表达载体。6.如权利要求5所述的表达载体，其特征在于所述载体为逆转录病毒载体、腺相关病毒载体或腺病毒载体之一。7.如权利要求4所述的表达载体，其特征在于所述载体为原核表达载体。8.如权利要求1或2所述的DNA序列在制备预防和治疗人、畜血吸虫感染和血吸虫病药物中的用途。9.如权利要求3所述的多肽在制备预防和治疗人、畜血吸虫感染和血吸虫病药物中的用途。10.如权利要求4~7所述之一的表达载体在制备预防和治疗人、畜血吸虫感染和血吸虫病的药物中的用途。全文摘要本发明公开了东方田鼠日本血吸虫抗性基因及其编码的多肽，本发明利用表达克隆技术，从东方田鼠骨髓cDNA文库中分离到一个抗日本血吸虫的抗性相关基因E77.43，根据该基因的第532到867位核苷酸序列，编码得到产物为111个氨基酸残基的多肽。本发明从得到的日本血吸虫抗性相关基因E77.43及该基因的重组载体和表达产物，能用于预防人、兽对日本血吸虫的感染或治疗血吸虫病。文档编号C12N15/12GK101338313SQ20071003528公开日2009年1月7日申请日期2007年7月5日优先权日2007年7月5日发明者熊德慧,秦志强,胡维新申请人:中南大学