专利名称：一种用于分析酸性环境中微生物群落结构的基因组芯片的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因芯片，尤其涉及用于分析酸性环境中微生物群落结构的基因组芯片。
背景技术：
传统的微生物群落研究方法是以分离培养为依据，包括对微生物细胞形态、生长适温、pH值、GC含量、微生物总量、生物量、呼吸效率、酶活性等性质的测定和分析。尽管这些传统的方法仍然是微生物群落研究的基础，但是由于不同种类微生物对培养要求的差异，以分离培养为基础的微生物群落分析不能提供足够准确而丰富的信息。特别是在在酸性环境中存在的微生物大多数是属于化能自养的嗜酸性细菌，这些细菌在人工条件下很难进行分离培养，特别是在固体培养基上。虽然荧光显微镜法、扫描电镜法和透射电镜法等方法能观察微生物个体丰度和形态，但仍不能提供微生物群落结构多样性的足够信息。20世纪80年代末90年代初发展了以核酸(基因)为基础的分子生物学技术，该方法大大地减轻对微生物培养的依赖性，并迅速地广泛应用于微生物群落结构分析。但是，目前在微生物群落分析中所用的核酸限制性片段长度多态性分析(RFLP/Restriction Fragment Length Polymorphism)和变性梯度凝胶电泳(DGGE/denatured gradient gel electrophoresis)等方法灵敏度低、特异性不高，而基因克隆与序列分析则工作量大。FISH检测技术尽管灵敏度高、特异性强，但存在荧光染料种类的限制，每次检测的微生物种类有限。因此，这些方法都难以同时、快速、准确、灵敏地进行微生物群落结构的分析。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种分析酸性环境中微生物群落结构的群落基因组芯片。利用该芯片，可以实现快速、准确、灵敏地对酸性环境中微生物群落结构进行分析和研究。
本发明的基因组芯片由基片及固定于基片之上的细菌DNA探针组成，这些探针包括至少10株氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、至少2株嗜酸氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans菌)、至少1株喜温嗜酸硫杆菌(Acidithiobacillus caldus菌)、至少1株Acidithiobacillus albertensis菌、至少6株氧化亚铁微螺菌(Leptospirillum sp.菌)、至少8株异养嗜酸菌(Acidiphiliums sp.)、至少1株金属硫叶菌(Sulfolobus Metallicus)、至少1株嗜酸两面菌(Acidianus sp)、至少1株勤奋金属球菌(Metallosphaera sedula)和至少2株嗜热硫化杆菌(Sulfobacillus)的全基因组DNA。
这些探针最好包括16株氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、3株嗜酸氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans菌)、3株喜温嗜酸硫杆菌(Acidithiobacillus caldus菌)、2株Acidithiobacillus albertensis菌、10株氧化亚铁微螺菌(Leptospirillum sp.菌)、14株异养嗜酸菌(Acidiphiliums sp.)、1株金属硫叶菌(Sulfolobus Metallicus)、1株嗜酸两面菌(Acidianus sp)、1株勤奋金属球菌(Metallosphaera sedula)和3株嗜热硫化杆菌(Sulfobacillus)的全基因组DNA。
与现有的微生物群落分析方法相比，利用本发明的基因组芯片对微生物进行群落分析，克服了过程复杂、耗时长、劳动强度大、嗜酸性细菌很难进行分离培养的缺点。利用这种芯片，能够检测环境中丰度较低的微生物，适用于分析酸性环境中微生物群落。具有高通量、同时、快速、准确、灵敏地分析酸性环境中微生物群落组成的优点。
图1使用Acidithiobacillus ferrooxidans菌的全基因组DNA与本发明的基因组芯片杂交后进行特异性评估的杂交结果图；图2使用Acidithiobacillus ferrooxidans菌的全基因组DNA与本发明的基因组芯片杂交后进行灵敏度评估杂交图；图3使用Acidithiobacillus ferrooxidans菌的全基因组DNA与本发明的基因组芯片杂交后进行定量性能评估线性图。
具体实施例方式
实施例1本发明基因组芯片的制备将至少10株氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)、至少2株嗜酸氧化硫硫杆菌(Acidithiobacillus thiooxidans菌)、至少1株喜温嗜酸硫杆菌(Acidithiobacillus caldus菌)、至少1株Acidithiobacillus albertensis菌、至少6株氧化亚铁微螺菌(Leptospirillum sp.菌)、至少8株异养嗜酸菌(Acidiphiliums sp.)、至少1株金属硫叶菌(Sulfolobus Metallicus)、至少1株嗜酸两面菌(Acidianus sp.)、至少1株勤奋金属球菌(Metallosphaera sedula)和至少2株嗜热硫化杆菌(Sulfobacillus)的全基因组用DNA抽提试剂盒进行抽提。以抽提的全基因组DNA作探针，将其用50％的DMSO溶解，到终浓度为50pmol/μl，然后在相对湿度为55～58％的环境条件下使用OmniGridAccent Arraying System(Genomic Solutions，美国)将探针点样在经氨基化表面处理的硅化玻片上。每一玻片上有8个探针阵列重复。点好的芯片处于室温下干燥过夜，最后在600mJ的辐射剂量下对芯片进行紫外线交联。
实施例2芯片杂交特异性评估选取氧化亚铁硫杆菌(Acidithiobacillus ferrooxidans)，简称A.f菌，来检测芯片探针的杂交特异性。将A.f菌全基因组DAN用cy3荧光染料标记后与寡核苷酸芯片在50℃杂交，结果显示芯片上与A.f菌对应的探针位置点上都产生了很强的荧光信号(如附图1所示)，并且在芯片上没有发现与非靶标基因间的非特异性交互杂交现象。说明特异性的寡核苷酸探针与其对应的目标基因之间具有很强的特异性。
实施例3芯片杂交灵敏度检测使用Acidithiobacillus ferrooxidans 23270的纯基因组DNA来检测本发明芯片的灵敏度。将纯基因组DNA按照一定的浓度梯度稀释(浓度分别为0.11，1.15，11.5，115ng/ul)，并使用cy3进行标记后与芯片杂交。从芯片杂交分析结果(见附图2)发现，该芯片对纯培养微生物基因组DNA的检测极限为0.11ng/ul。
实施例4芯片的定量性能测定通过测定目标DNA浓度与芯片杂交信号之间的关系评估了芯片的用于核酸定量的能力。将纯的Acidithiobacillus ferrooxidans 23270基因组DNA按照梯度稀释后使用cy3进行标记并与芯片进行杂交，每一浓度的DNA制备三个平行杂交，每一探针对应的信号取其均值，以DNA浓度的对数值和对应的荧光信号强度对数值为座标点作图(见附图3)，并对DNA浓度与荧光信号强度作线性回归分析。结果显示DNA浓度在1到500ng之间时，DNA浓度与信号强度之间存在很强的线性相关性，r2＝0.982，同样的线性相关性也存于16s rRNA基因探针的数量与信号强度之间。此外，当DNA浓度范围在0.11到115ng/ul之间时，DNA浓度与芯片的总信号强度之间也存在很强的线性关系，r2＝0.91，p＜0.05。这一结果表明芯片杂交对于特定浓度范围内的DNA具有定量作用，因此也说明了本发明构建的芯片可以作为一种定量工具使用。
权利要求
1.一种用于分析酸性环境中微生物群落结构的基因组芯片，包括基片及固定于基片之上的细菌DNA探针，其特征在于所述探针包括至少10株氧化亚铁硫杆菌、至少2株嗜酸氧化硫硫杆菌、至少1株喜温嗜酸硫杆菌、至少1株Acidithiobacillus albertensis菌、至少6株氧化亚铁微螺菌、至少8株异养嗜酸菌、至少1株金属硫叶菌、至少1株嗜酸两面菌、至少1株勤奋金属球菌和至少2株嗜热硫化杆菌的全基因组DNA。
2.如权利要求1所述的基因组芯片，其特征在于所述探针包括16株氧化亚铁硫杆菌、3株嗜酸氧化硫硫杆菌、3株喜温嗜酸硫杆菌、2株Acidithiobacillus albertensis菌、10株氧化亚铁微螺菌、14株异养嗜酸菌、1株金属硫叶菌、1株嗜酸两面菌、1株勤奋金属球菌和3株嗜热硫化杆菌的全基因组DNA。
3.如权利要求1或2所述的基因组芯片，其特征在于每个探针设8个重复。
全文摘要
本发明公开了一种用于分析酸性环境中微生物群落结构的基因组芯片。该芯片的探针包括至少10株氧化亚铁硫杆菌、至少2株嗜酸氧化硫硫杆菌、至少1株喜温嗜酸硫杆菌、至少1株Acidithiobacillus albertensis菌、至少6株氧化亚铁微螺菌、至少8株异养嗜酸菌、至少1株金属硫叶菌、至少1株嗜酸两面菌、至少1株勤奋金属球菌和至少2株嗜热硫化杆菌的全基因组DNA。这种芯片，能够检测酸性环境中丰度较低的微生物，具有高通量、同时、快速、准确、灵敏地分析酸性环境中微生物群落组成的优点。
文档编号C12Q1/68GK101033490SQ20071003475
公开日2007年9月12日 申请日期2007年4月17日 优先权日2007年4月17日
发明者邱冠周, 刘学端, 覃文庆, 刘新星, 申丽, 王军 申请人:中南大学