专利名称：一种用于检测急性髓系白血病化疗疗效相关的基因组合、引物、探针和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种基因组合、引物、探针和用途，尤其是一种用于检测急性髓系白血 病化疗疗效相关的基因组合、引物、探针和用途。
背景技术：
急性髓系白血病(AML)是造血干细胞正常分化受阻，恶性肿瘤细胞克隆性增生取 代正常造血，从而造成贫血、出血，感染及脏器浸润等一系列症状的疾病，是一种异质性疾 病。如果不予治疗，患者将于数周或数月内由于出血或感染而死亡。我国白血病的发病率 约为3 4/10万。在恶性肿瘤所致的死亡率中，白血病在儿童及35岁以下成人中居第一 位，是威胁儿童及中青年身体健康的杀手。近年来急性髓系白血病的发病率逐年上升。目 前，化学药物治疗仍然是治疗急性髓系白血病的主要手段。除急性早幼粒细胞白血病经全 反式维甲酸(ATRA)或亚砷酸(三氧化二砷、AT0)治疗，CR率可>90%外，其他急性髓系白 血病的标准诱导化疗的缓解率约为50% -85%。目前尚有50% -15%患者未能达到完全缓 解。缓解率受到多种危险因素的影响。其中，个体的遗传差异在化疗药物的敏感性中起着 重要的作用。个体基因的多样性导致药物在吸收，分布，生物转化，代谢，转运及清除，以及药物 作用靶点方面都存在差异性，从而导致每个个体对不同化疗药物的敏感性及毒副作用不 同。随着药物基因组学的发展，个体化治疗逐渐成为新的治疗趋势。药物进入人体后，绝大部分依靠转运蛋白的协助，广泛分布于人体的组织。有研究 指出MMDR1 G2677T/A基因多态性可以作为AML患者第一疗程是否CR的预测因素，为个体 化给药提供理论基础。近来还有研究指出MDR1 G1199A可介导对紫杉醇，长春碱类，依托泊 苷等多种药物的耐药。药物代谢酶分为I相反应和II相反应酶。细胞色素P450单氧化酶(CYPs)是催 化药物进行氧化、还原等I相反应的特异性酶。有研究表明在AML难治组中CYP3A5*3 (A/G) 基因的AA型比例明显高于持续缓解组，可能与AA基因型代谢酶活性升高，导致化疗药物有 效性及毒性降低有关。药物II相反应为结合反应，催化该类反应的酶主要有N_乙酰转移酶 2(NAT2)、谷氨酰转移酶(GST)、UDP_葡萄糖苷酸转移酶(UGT)、巯基嘌呤甲基转移酶(TPMT) 等。该类酶多态性位点的改变将会导致药物毒性反应产生差异。有的实验研究表明GSTT1 和GSTM1的NULL基因变异型不但和急性白血病的发病有关，而且还影响化疗及放疗的治疗 效果。为此，通过相关基因型检测，分析急性髓系白血病药物治疗效果，可以指导临床医 生用药减少患者用药的毒副作用增加疗效。
发明内容
本发明是通过检测一组与急性髓系白血病化疗疗效相关的基因及位点，自行设计特异性寡核苷酸引物和探针，应用于单核苷酸延伸结合微阵列芯片技术；综合分析急性髓 系白血病化疗疗效相关基因多态性，从而能够通过有效的方法来选择化疗药物，调整化疗 剂量，提高化疗疗效及预后，同时减少药物毒副作用，以指导临床合理用药。为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是一种用于检测白血病化疗疗 效相关的基因组合药物代谢I相酶类基因CYP3A5，药物代谢II相酶类基因NAT2、GST02， 药物转运蛋白类基因0ATP1B1。包括下述SNP 位点CYP3A5 基因的 rs776746 位点、NAT2 的 rsl799931 位点、GST02 的 rsl56697 位点和 0ATP1B1 的 rs4149056 位点。用于检测白血病化疗疗效相关的基因组合中针对所述位点自行设计的特异性引 物。DNA通过多重PCR扩增，能够同时得到上述4个位点的基因片段。用于检测白血病化疗疗效相关的基因组合自行设计的特异性探针，应用此探针能 够同时对4个位点进行基因型检测。所述的引物和探针，应用单核苷酸延伸结合微阵列芯片技术能够特异性检出与急 性髓系白血病化疗疗效相关的基因多态性位点。本发明的有益效果是(1)分型结果准确性高达99%以上，重复性好。(2)同时检 测多个SNP位点，检测成本低；(3)高通量，可一次对384个样本进行检测；(4)操作简便； (5)灵敏度高，每次检测的DNA用量仅30ng。(6)通过单核苷酸延伸结合微阵列芯片技术， 利用特异性引物和探针对单核苷酸多态性(SNP)的基因分型及时、准确，为临床对急性髓 系白血病选择用药及剂量提供可靠依据。
具体实施例方式本发明用于检测急性髓系白血病化疗疗效相关的基因组合，它包括与白血病化疗 疗效关系密切的四个基因的组合药物代谢I相酶类基因CYP3A5，rs776746位点，药物代 谢II相酶类基因NAT2, rsl799931位点、GST02，rsl56697，药物转运蛋白类基因0ATP1B1, rs4149056位点。以及检测急性髓系白血病化疗疗效相关基因位点所设计的特异性引物和 探针。设计的特异性引物序列如下 设计的特异性探针序列如下 根据检测急性髓系白血病化疗疗效相关的基因组合自行设计的特异性引物和探 针，被检测的DNA通过多重PCR扩增，能够同时得到上述4个位点的目的基因片段.应用此 探针能够同时对4个位点进行基因型检测。特异性寡核苷酸引物及探针可用常规的合成技术进行合成，本领域的技术人员均 能够理解此技术。本发明不限于这8条特异性引物及其相应的4条特异性探针。本发明中所述探针特指单核苷酸延伸技术中的延伸引物，下面实施例中将叙述为 延伸引物。下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明1. DNA 的提取采取受检者骨髓或静脉血，加入同等体积的细胞裂解液，裂解两次，充分裂解白细 胞，离心弃上清后加入蛋白酶K缓冲液和蛋白酶K(50ug/ml)，65°C孵育10分钟，异丙醇沉淀、75%乙醇洗涤沉淀两次，晾干后溶于适量TB溶液中。2. PCR 扩增取受检者的基因组DNA提取液加入96孔板或0. 2mlPCR管中，进行多重PCR扩增每孔反应总体积5ul，其中 10mmol/L 4*dNTPs 0. 0375ul, 10XPCR Buffer 0. 5ul,25mmol/L MgCl2 lul,模板 DNA 30ng，4 重引物混合液 10uM/L each 0. 025ul, AmplitaqGold(5U/ul)0. lul，补足水到5ul。置于PCR仪上进行扩增。循环条件为预变性 94°C lmin ；94°C 30 sec，55°C 30 sec，72°C lmin，40 个循环；Hold 4°C。PCR扩增引物IF 5’ -TGGCATAGGAGAKACCCAC1R 5’ -TTCATATGATGAAGGGTAATGTG2F 5， -TTTAAGATTTCCTTGGGGAG2R 5’ -ACACAAGGGTTTATTTTGTTCCT3F 5’ -ACCTCTTCCAGGTTGCTGA3R 5’ -CAAGGAGTRCCTGGTAGCG4F 5’ -TCATTGGAAGCTGTCGCG4R 5’ -AACTCTCCAGATGTCTTCCAGTAA3.纯化在PCR扩增产物中加入2ul Exo I-SAP-IT纯化试剂(购自USB)。将96孔板放入 PCR 仪中进行纯化，纯化程序37°C 30min,96°C lOmin, Hold 4°C。4.引物延伸反应纯化后的PCR产物中加入延伸反应混合物extension Dilution Buffer 3. 76ul, 延伸引物混合液(10uM/L each) 0. 03ul, 20 X Extension Mix 0. 2ul，DNA 聚合酶 0. 02ul，补 足水到7ul。将装有延伸反应混合物的96孔板放入PCR仪中进行延伸反应，反应程序Hold 96°C 3min ；94°C 20sec，40°C llsec，46 个循环；Hold 4°C。延伸引物序列1-ATACCTACCACGCTACAGCCCTTTAAAGAGCTCTTTTGTCTTTCA2-AGACTTCTACGCAAGCACTGAATCTCGTGCCCAAACCTGGTGATG3-CACTAGTCATAACGCAGCCTTCCTGACGCAGGGCTGCCTTCAGAT4-TCCAGAATAGACAACAGACGCAGTAATGTCGAAGTTTTTATCCCA以上延伸探针的5’端具有与微阵列芯片Tag地址引物的互补序列。5.延伸反应结束后，加入杂交液与微阵列芯片进行杂交反应。杂交温度42 °C，孵育时间2小时。6.扫描检测荧光信号分析基因型结果。本发明采用单核苷酸延伸和微阵列芯片技术相结合，利用SNP Stream平台，针对 上述4个SNP位点，设计一套多重PCR引物，在一个扩增反应中同时扩增待测SNP位点的4 个目的基因片段。根据待测SNP位点上游5’端序列及微阵列芯片的Tag地址序列，设计 43-45bp的寡核苷酸探针，其3’末端仅结合一个标记不同颜色荧光的ddNTP，互补位点位于 SNP位点5’上游lbp处。探针的5’端与微阵列芯片特定区域的20bp的Tag地址序列互 补，其余23-25bp的序列与SNP位点上游5’端序列互补。杂交后，不同探针结合在芯片的不同区域，通过检测芯片上对应位置的荧光信号，进行基因型分析。此方法同时可以进行多 个SNP分型。由于本发明使用的检测方法可以高通量，自动化的检测SNP，大幅降低了检测成 本。本发明将与急性髓系白血病化疗疗效密切相关的四个基因位点进行组合。通 过大量的筛选数据表明所述4个基因及其位点CYP3A5基因的rs776746位点、NAT2的 rsl799931位点、GST02的rsl56697位点和0ATP1B1的rs4149056位点与急性髓性白血病 化疗疗效密切相关。提示这些遗传变异与药物有效性和安全性密切相关。通过检测分析受 检人与白血病化疗疗效相关的基因多态性，对临床合理的选择化疗药物，调整化疗剂量，提 高化疗疗效及预后，减少药物毒副作用具有重要指导意义同时节省患者开支。综上所述，本发明的内容并不局限在上述的实施例中，相同领域内的有识之士可 以在本发明的技术指导思想之内，轻易提出其他的实施例，但这种实施例都包括在本发明 的范围之内。序列表(SEQUENCELISTING)<110>协和干细胞基因工程有限公司，中国医学科学院血液病医院(血液学研究 所)<120>—种用于检测急性髓系白血病化疗疗效相关的基因组合、引物、探针和用途<130><160>12<170>PatentIn version 3. 5<210>1<211>19<212>DNA<213> 人类(Homo sapiens)<400>1tggcatagga gakacccac19<210>2<211>23<212>DNA<213> 人类(Homo sapiens)<400>2ttcatatgat gaagggtaat gtg23<210>3<211>45<212>DNA<213> 人类(Homo sapiens)<400>3agacttctac gcaagcactg aatctcgtgc ccaaacctgg tgatg45<210>4
<211>20<212>DNA<213> 人类(Homo sapiens)<400>4tttaagattt ccttggggag20<210>5<211>23<212>DNA<213> 人类(Homo sapiens)<400>5acacaagggt ttattttgtt cct23<210>6<211>45<212>DNA<213> 人类(Homo sapiens)<400>6agacttctac gcaagcactg aatctcgtgc ccaaacctgg tgatg 45<210>7<211>19<212>DNA<213> 人类(Homo sapiens)<400>7acctcttcca ggttgctga19<210>8<211>19<212>DNA<213> 人类(Homo sapiens)<400>8caaggagtrc ctggtagcg19<210>9<211>45<212>DNA<213> 人类(Homo sapiens)<400>9cactagtcat aacgcagcct tcctgacgca gggctgcctt cagat45<210>10<211>18<212>DNA<213> 人类(Homo sapiens)
<400>10tcattggaag ctgtcgcg18<210>11<211>24<212>DNA<213> 人类(Homo sapiens)<400>11aactctccag atgtcttcca gtaa24<210>12<211>45<212>DNA<213> 人类(Homo sapiens)<400>12tccagaatag acaacagacg cagtaatgtc gaagttttta tccca4权利要求
一种用于检测急性髓系白血病化疗疗效相关的基因组合，其特征在于，它包括与白血病化疗疗效密切相关的四个基因组合药物代谢I相酶类基因CYP3A5，药物代谢II相酶类基因NAT2、GSTO2，药物转运蛋白类基因OATP1B1。
2.根据权利要求1所述的用于检测急性髓系白血病化疗疗效相关的基因组合，其特征 在于，包括下述基因位点CYP3A5基因的rs776746位点、NAT2的rsl799931位点、GST02的 rsl56697 和 0ATP1B1 的 rs4149056 位点。
3.如权利要求2所述的用于检测急性髓系白血病化疗疗效相关的基因组合，用于针对 所述位点设计的特异性引物和探针。
4.如权利要求2所述的用于检测急性髓系白血病化疗疗效相关的基因组合设计的特 异性寡核苷酸引物，其特征在于，以下列出的特异性引物序列，用于对DNA进行多重PCR扩 增，能同时扩增出上述4个位点的特异性目的基因片段针对 rs776746 位点上游 5，-TGGCATAGGAGAKACCCAC下游 5’ -TTCATATGATGAAGGGTAATGTG 针对 rs 1799931 位点上游 5，-TTTAAGATTTCCTTGGGGAG下游 5，-ACACAAGGGTTTATTTTGTTCCT 针对 rs 156697 位点上游 5，-ACCTCTTCCAGGTTGCTGA下游 5’ -CAAGGAGTRCCTGGTAGCG 针对 rs4149056 位点上游 5，-TCATTGGAAGCTGTCGCG下游 5’ -AACTCTCCAGATGTCTTCCAGTAA。
5.如权利要求2所述的用于检测白血病化疗疗效相关的基因组合自行设计的特异性 寡核苷酸探针，其特征在于，所列出的特异性探针序列，能同时对4个位点进行基因型检 测针对 rs776746 位点ATACCTACCACGCTACAGCCCTTTAAAGAGCTCTTTTGTCTTTCA 针对 rs 1799931 位点AGACTTCTACGCAAGCACTGAATCTCGTGCCCAAACCTGGTGATG 针对 rsl56697 位点CACTAGTCATAACGCAGCCTTCCTGACGCAGGGCTGCCTTCAGAT 针对 rs4149056 位点TCCAGAATAGACAACAGACGCAGTAATGTCGAAGTTTTTATCCCA。
6.如权利要求4和5所述的引物及探针，用于单核苷酸延伸结合微阵列芯片技术特异 性检出急性髓系白血病化疗疗效相关的基因分型。
全文摘要
本发明公开了一种用于检测急性髓系白血病化疗疗效相关的基因组合、引物、探针和用途，它包括与急性髓系白血病药物治疗密切相关的四个基因组合药物代谢I相酶类基因CYP3A5，药物代谢II相酶类基因NAT2、GSTO2，药物转运蛋白类基因OATP1B1。包括下述SNP位点CYP3A5基因的rs776746位点、NAT2的rs1799931位点、GSTO2的rs156697和OATP1B1的rs4149056位点。其方法是应用特异性引物和经过不同颜色荧光标记的探针与PCR扩增后的核酸样品中目的基因片段进行杂交。通过单核苷酸延伸技术检测和分析白血病药物治疗效果，指导临床用药，减少患者用药的毒副作用，增加疗效。
文档编号C12Q1/68GK101851683SQ201010213640
公开日2010年10月6日 申请日期2010年6月30日 优先权日2010年6月30日
发明者刘志霈, 刘蓉华, 周毓玲, 杜宏伟, 王娜, 靳霞, 韩俊领, 韩明哲 申请人:协和干细胞基因工程有限公司;中国医学科学院血液病医院(血液学研究所)