一种植物耐逆性相关SbSNAC1蛋白及其编码基因和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种植物抗逆性相关SbSNAC1蛋白及其编码基因与应用。该蛋白SbSNAC1，是具有下述氨基酸残基序列之一的蛋白质：1)序列表中的SEQ?ID?№.2的氨基酸残基序列；2)将序列表中的SEQ?ID?№.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物抗逆性相关的由1)衍生的蛋白质。本发明的蛋白和其编码基因，为基因工程改良农作物抗逆性提供了重要的候选基因。
【专利说明】—种植物耐逆性相关SbSNACI蛋白及其编码基因和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，涉及一种植物耐逆性相关蛋白及其编码基因和应用。
【背景技术】
[0002]水资源严重短缺严重地影响了世界粮食生产，同时也制约着各国农业经济的快速发展。我国干旱、半干旱区域面积约占全国国土面积二分之一，且目前还在逐年扩张，当前人口众多、城市化和工业化进程的不断加剧、土地沙化和盐碱化程度加深、生态环境日益恶化的背景下对于水资源的保护与可持续利用面临着严峻挑战。每年因水资源短缺造成的粮食减产不计其数，所带来的直接经济损失难以估计，因此发展耐旱玉米品种成为解决我国当前农业水资源短缺情况下进行粮食生产，保证粮食安全和经济稳步发展的重要途径。植物抗逆是一个涉及多基因多信号途径的复杂过程，应用现代分子生物技术较传统育种能够更加有针对性的进行抗逆作物新品种的培育，很大程度上提高育种效率的同时也大大缩短育种进程，有效缓解水资源短缺的压力以稳定粮食生产，这对于我国实现农业安全、高效发展具有重要意义。
【发明内容】
[0003]本发明的一个目的是提供一种蛋白，名称为SbSNACl，来源于高粱[Sorghumbicolor (L.)Moench]
[0004]本发明所述蛋白是如下I)或2)的蛋白:
[0005]I)序列表中的SEQ ID Na.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0006] 2)将序列表中的SEQ ID Na.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关由I)衍生的蛋白质。
[0007]具体的，所述植物耐逆性指植物耐盐性、耐高渗性、耐ΑΒΑ、或耐旱性。
[0008]具体的，所述植物为C4植物；所述C4植物具体为拟南芥、高粱或玉米。
[0009]序列表中SEQ ID N0.2所示的氨基酸序列由321个氨基酸残基组成。
[0010]上述I)和2)中的SbSNACl蛋白可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述I)和2)中的SbSNACl蛋白的编码基因可通过将序列表中SEQ ID Na.1所示的核苷酸序列缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变后得到。
[0011]编码所述SbSNACl蛋白的核酸分子也属于本发明的保护范围。
[0012]所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA ;所述核酸分子也可以是 RNA.如 mRNA、hnRNA 或 tRNA 等。
[0013]本发明的又一个目的是提供所述蛋白的编码基因。
[0014]所述编码基因具有下述核苷酸序列之一:
[0015]I)序列表中SEQ ID Ns:1所述核苷酸序列；
[0016]2)编码序列表中SEQ ID Na:2蛋白质序列的多核苷酸序列；
[0017]3)在高严谨条件下可与序列表中SEQ ID Ns:1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列；
[0018]4)与I)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；具体的，所述同源性为95%以上；再具体的为96%以上；再具体的为97%以上；再具体的为98%以上；再具体的为99%以上。
[0019]上述高严谨条件可为用6X SSC, 0.5% SDS的溶液，在65°C下杂交，然后用2X SSC,
0.1 % SDS 和 I X SSC, 0.1 % SDS 各洗膜一次。
[0020]其中，序列表中的SEQ ID No:1由966个核苷酸组成，其开放阅读框架(ORF)为自5'末端第1-963位核苷酸，编码序列表中SEQ ID N2:2所示的蛋白质，即本发明所述的SbSNACl 蛋白。
[0021]含有上述核酸分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。
[0022]所述重组载体可为重组表达载体，也可为重组克隆载体。
[0023]所述重组表达载体可用现有的表达载体构建。所述表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入在植物中表达可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。
[0024]扩增本发明所述编码基因全长或其任意片段的引物对也属于本发明保护的范围。
[0025]本发明的另一个目的是提供本发明所述蛋白、编码基因和含有所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌在如下如下1)-4)至少一种中的应用:
[0026]I)降低植物的耐盐性；
[0027]2)降低植物的抗高渗性；
[0028]3)降低植物的ABA抗性；
[0029]4)增强植物的耐旱性。
[0030]具体的，所述植物为C4植物；所述C4植物具体为拟南芥、高粱或玉米。
[0031]本发明的还一个目的是提供本发明所述的蛋白、编码基因和含有所述编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌在培育在培育转基因植物中的应用。
[0032]具体的，所述转基因植物具有如下至少一种性状:1)耐盐性降低；2)抗高渗性降低；3) ABA抗性降低；4)耐旱性增强。
[0033]具体的所述植物为C4植物；所述C4植物具体为拟南芥、高粱或玉米。
[0034]本发明再一个目的是提供一种培育转基因植物的方法，是将本发明所述的编码基因导入目的植物，得到转基因植物。
[0035]所述转基因植物与所述目的植物相比，具有如下至少一种性状:1)耐盐性降低；2)抗高渗性降低；3) ABA抗性降低；4)耐旱性增强。。
[0036]具体的所述植物为C4植物；所述C4植物具体为拟南芥、高粱或玉米。
[0037]本发明为解析了典型耐旱的C4禾本科作物高粱NAC家族成员的遗传基础和NAC家族相关基因应用于玉米抗逆新品种培育增加了新的理论内容。同时也为提高植物的耐旱性提供了一条经济、快速、有效的途径。本发明在农业领域将具有广阔的应用和市场前景。为将来基因工程改良作物抗逆性提供了重要的候选基因。
【专利附图】
【附图说明】
[0038]图1为重组农杆菌的菌液PCR鉴定电泳图。-表示以H2O为模板的负对照；+表示35S:: SbSNACl重组质粒为正对照。
[0039]图2为RT-PCR鉴定SbSNACl基因的表达情况；WT表示哥伦比亚野生型拟南芥；OX-2、OX-3、OX-5、OX-7、0X-9分别代表T3代纯合的独立转基因拟南芥株系。
[0040]图3为萌发阶段野生型拟南芥WT与T3代转基因株系OX-2、0X-9在NaCl和甘露醇处理下的表型。
[0041]图4为萌发阶段野生型拟南芥WT与T3代转基因株系0X-2、0X_9在ABA处理下的表型。
[0042]图5为野生型拟南芥WT与T3代转基因株系0X-2、0X_9在自然干旱处理两周并复水一周后的表型鉴定。
[0043]图6为野生型拟南芥WT与T3代转基因株系0X-2、0X_9在自然干旱处理下存活率统计。
[0044]图7为野生型拟南芥WT与T3转基因株系0X-2、0X_9的叶片在自然干旱处理下的相对电导率检测结果。
【具体实施方式】
[0045]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0046]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0047]实施例1、高粱基因SbSNACl的制备
[0048]1、RNA 的提取
[0049]取新疆耐旱高粱品种XGL-1的叶片和根系部分进行混合(由新疆农业科学院粮食作物研究所提供)。提取上述材料的RNA。
[0050]2、cDNA 的制备
[0051 ]将步骤I制备得到的RNA反转录为cDNA。
[0052]3、基因的扩增
[0053]引物序列为:
[0054]正向引物:5’-TTTCCATGGGATTGCCGGTGAT-3’ ；
[0055]反向引物:5’ -TTTGGTGACCAGCCTCAGAATGGCCCCAAC-3 ’
[0056]以上述设计的引物和步骤2所制备得到的高粱XGL-1的cDNA为模板，进行PCR扩士豳
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[0057]将PCR扩增产物连入PMD18-T载体，得到重组克隆载体，转入感受态大肠杆菌，挑取单克隆，进行鉴定，提取质粒，进行测序。测序结果表明，上述PCR扩增得到具有序列表中SEQ ID Ns:1的核苷酸序列，共966bp，其中编码区长963bp，该编码区序列如序列表中SEQID Na:1中第1-963位核苷酸所示，编码序列表中SEQ ID Na:2所示的氨基酸序列，共321个氨基酸残基。将该具有序列表中SEQ ID Ns:1的核苷酸序列的片段命名为SbSNACl。
[0058]实施例2、高粱基因SbSNACl的功能验证
[0059](一)、表达载体的构建
[0060]1、用限制性内切酶NcoI和BstEII双酶切实施例1中的重组克隆载体，回收和纯化酶切产物。
[0061] 2、用限制性内切酶NcoI和BstEII双酶切质粒pCAMBIA3301，回收载体骨架(约9250bp)。
[0062]3、将步骤I的酶切回收产物和步骤2的载体酶切片段连接，得到重组质粒35S: =SbSNACl。根据测序结果，对重组质粒35S: =SbSNACl进行结构描述如下:骨架载体为质粒PCAMBIA3301，在骨架载体的NcoI和BstEII酶切位点之间插入了序列表中SEQ ID Na:I所示的核苷酸序列。
[0063](二)、转SbSNACl基因拟南芥的获得
[0064]I)将植物表达载体35S:: SbSNACl转化农杆菌GV3101，得到重组农杆菌。通过PCR扩增重组农杆菌菌液中是否含有目标基因片段(序列长度约966bp)，进行阳性重组菌的鉴定，PCR扩增引物为:
[0065]正向引物:5’-TTTCCATGGGATTGCCGGTGAT-3’ ；
[0066]反向引物:5’ -TTTGGTGACCAGCCTCAGAATGGCCCCAAC-3 ’。
[0067]菌液PCR鉴定结果见图1。选取PCR检测均为阳性的菌液进行接菌，28°C (200rmp)震荡至0D600值为1.2-1.4。收集菌体，用适量的渗透液(1/2MS ;5%蔗糖)充分悬浮菌体至菌液0D600值为0.8左右，向用渗透缓冲液悬浮后的菌液中的加入0.02% (终浓度)的吸附剂 Silwet L-77。
[0068]2)将准备好的哥伦比亚野生型拟南芥(Col-O)花苞完全浸泡于农杆菌菌液中侵染约lmin，轻轻摇动花序使得花序充分浸没于菌液中，16°C黑暗处理24h后将植株转移到正常生长条件下生长，重复转化1-2次，混收TO代拟南芥种子。
[0069]3)通过除草剂筛选法鉴定阳性纯合转基因拟南芥。Tl代转基因株系通过喷施除草剂的方法来筛选阳性转基因株系。经过Tl代鉴定为阳性的转基因株系单株收种，在含有PPT(7mg/L)的MS平板上鉴定并筛选T2、T3代纯合的转基因株系。
[0070]4)纯合的SbSNACl转基因株系的鉴定。
[0071]收获步骤3)筛选出的T3代5株阳性株系0X-2、0X-3、0X-5、0X-7、0X-9的种子和野生型拟南芥种子，同等条件下种植，4周后，进行RT-PCR检测。按照实施例1的方法分别提取转基因和野生型拟南芥叶片部分的总mRNA，并反转录为cDNA，以该cDNA为模板、以拟南芥基因Actin为内参，进行qRT-PCR检测，扩增SbSNACl基因和Actin内参基因使用的引物序列为:
[0072]SbSNACl 上游引物:5’ -CAAGGAGGAGGCGATGGAC-3’
[0073]下游引物:5，-CGAAGAGCGAGGAGAAGAAGT-3，
[0074]Actin 上游引物:5’ -AGGTATCGCTGACCGTATGAG-3’
[0075]下游引物:5 ’ -GCTGAGGGAAGCAAGAATG-3 ’
[0076]RT-PCR检测结果见图2，结果表明，SbSNACl基因在不同的转基因T3代植株中均有不同(高)水平的转录，但在野生型拟南芥中没有检测到SbSNACl基因的转录产物。RT-PCR检测结果进一步证明了 SbSNACl基因已整合到转基因T3代拟南芥的基因组中并且成功转录为mRNA。
[0077](四)、转SbSNACl基因拟南芥植株的萌发期胁迫实验
[0078]将筛选得到的纯合SbSNACl转基因拟南芥0X_2、0X_9的种子和野生型株系的种子进行消毒，分别将其点播在含有不同浓度NaCl、甘露醇和植物激素脱落酸(ABA)的MS培养基和对照MS培养基上对其进行处理，每个株系点50粒种子，设置5个重复，平板上的种子避光放置于4°C春化2-4天，经过春化的种子放到培养间正常生长条件下萌发(22°C，16h光照/18°C，8h黑暗，空气相对湿度40% -50% )，每天统计种子萌发率(统计萌发l-5d)。
[0079]盐和渗透胁迫实验结果见图3。图3结果显示，0X-2和0X_9两个的独立的转基因株系在分别含有150mM NaCl、175mM NaCl、350mM甘露醇、400mM甘露醇的MS平板上较野生型株系均表现出对盐和渗透胁迫的敏感性，而在MS培养基上，转基因株系和野生型株系间的萌发率无显示差异。在150mMNaCl存在条件下，约95%的野生型拟南芥种子萌发的同时，仅有55%-60%的转基因株系种子萌发；实验数据表明在350mM甘露醇存在条件下，77%的野生型种子萌发，而仅有10% -12%的转基因种子萌发。盐和渗透胁迫实验结果表明，种子萌发阶段，SbSNACl基因的过表达显著提高了转基因株系对盐和渗透胁迫的敏感性。
[0080]ABA胁迫实验结果见图4。图4结果显示，SbSNACl过表达转基因株系和野生型拟南芥在ABA胁迫下的萌发率在某种程度上均受到了抑制。在I μ M ABA存在的条件下，约有30 % -40 %的转基因株系萌发，但同时99 %的野生型株系的种子已经萌发；在1.5 μ MABA处理条件下， 结果与I μΜ ABA处理结果一致。ABA胁迫实验结果表明，转基因株系种子的萌发对ABA的敏感性较野生型株系显著提高。
[0081](五)、转SbSNACl基因拟南芥植株的的干旱胁迫实验
[0082]将在MS培养基上萌发生长I周的野生型和转基因型OX-2、0Χ-9幼苗移到含有蛭石:营养土 = I: I的培养钵中。其在正常生长条件下(16h光照/8h黑暗，22°C )连续浇水3周后停止浇水，干旱处理两周后进行复水，观察植株生长情况并统计转基因型和野生型株系的存活率，每个重复20个植株，共进行3次重复实验。
[0083]I)干旱胁迫处理后的野生型和转基因型拟南芥存活率的比较
[0084]干旱胁迫实验结果见图5和图6。统计存活植株的标准为:拟南芥仍然能够生长，且叶片和花序没有萎蔫死亡将其设定为存活的植株，而花序和叶片萎蔫或枯竭死亡的则被认定为死亡的植株。图6为干旱处理14天转基因型和野生型拟南芥的存活率，结果显示，转基因株系存活率约为60% -70%，而野生型拟南芥的存活率不到30%。干旱胁迫实验结果表明，经干旱胁迫处理后，转基因植株的存活率显著高于野生型株系。
[0085]2)干旱胁迫处理后的野生型和转基因型拟南芥叶片相对电导率的测定
[0086]干旱胁迫处理野生型和转基因型拟南芥OX-2、0X-9株系后，选取大小相等的叶片用去离子水振荡冲洗2-3次，再用洁净的滤纸上吸干叶片表面水分，尽量避开叶片主脉将其剪成适宜大小的叶块，快速称取叶片鲜重，分别置于加15mL去离子水的试管中，将试管放入真空干燥箱中用真空泵抽气20min至叶片透明且沉入水下，然后将试管室温下放置lh，期间多次震荡试管，Ih后测定其初始电导值SI并记录空白电导值，然后沸水浴15min，冷却至室温，摇匀后测定终电导值S2，计算相对电导率值，共进行三次重复实验，取平均值，计算标准差。
[0087]胁迫程度强弱与电解质渗漏的多少紧密相关。叶片相对电导率的检测结果见图7。图7结果表明，干旱胁迫条件下转基因型和野生型株系的相对电导率较正常生长条件下均显著降低，且干旱胁迫下转基因株的叶片相对电导率较对照株系显著降低。这可能是由于转基因株系细胞膜受逆境胁迫损伤程度较小所引起。
[0088]对干旱胁迫处理后的野生型和转基因型拟南芥存活率的统计和相对电导率的测定结果表明，在转基因株系中过表达SBSNAC1基因能够显著提高转基因株系的耐旱性。
【权利要求】
1.一种蛋白，是如下I)或2)的蛋白: 1)序列表中的SEQID Na.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； 2)将序列表中的SEQID N0.2的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐逆性相关的由I)衍生的蛋白质。
2.权利要求1所述蛋白的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于:所述编码基因具有下述核苷酸序列之一: 1)序列表中SEQID N2:1所述的核苷酸序列； 2)编码序列表中SEQID No:2蛋白质序列的多核苷酸序列； 3)在高严谨条件下可与序列表中SEQID No:1限定的DNA序列杂交的核苷酸序列； 4)与I)或2)或3)限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；具体的，所述同源性为95%以上；再具体的为96%以上；再具体的为97%以上；再具体的为98%以上；再具体的为99%以上。
4.含有权利要求2或3所述的编码基因的重组载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌；所述重组载体具体为重组表达载体或重组克隆载体。
5.扩增权利要求2或 3所述编码基因全长或其任意片段的引物对。
6.权利要求1所述的蛋白和权利要求2-3任一所述的编码基因和权利要求4所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌在增强植物的耐旱性中的应用。
7.权利要求1所述的蛋白和权利要求2-3任一所述的编码基因和权利要求4所述的重组载体、表达盒、转基因细胞系或宿主菌在培育转基因植物中的应用；具体的，所述转基因植物具有耐旱性增强的性状。
8.一种培育转基因植物的方法，是将权利要求2-3任一所述的编码基因导入目的植物，得到转基因植物；所述转基因植物与所述目的植物相比，具有耐旱性增强的性状。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于:所述植物为C4植物；所述C4植物具体为拟南芥、高粱或玉米。
【文档编号】A01H5/00GK104177482SQ201310198618
【公开日】2014年12月3日 申请日期:2013年5月24日 优先权日:2013年5月24日
【发明者】王天宇, 张登峰, 卢敏, 石云素, 宋燕春, 黎裕 申请人:中国农业科学院作物科学研究所