马尾松组培苗瓶外生根方法
【专利摘要】本发明马尾松组培苗瓶外生根方法，取带0.5cm长下胚轴的无菌苗顶芽为外植体在培养基Ⅰ中诱导丛芽；将诱导丛芽在培养基Ⅱ中伸长培养，单个切下顶芽接种到培养基Ⅲ中增殖获得继代芽Ⅰ；将继代芽Ⅰ重复伸长，单个切下继代芽Ⅰ并分成顶芽和芽段后在继代增殖培养基Ⅲ中继续增殖获得继代芽Ⅱ，将继代芽Ⅱ再重复伸长与增殖获得新的增殖继代芽；将单个切下高2.5-3.5cm的继代芽移植育苗杯中瓶外生根，然后移栽苗圃培育获得组培瓶外生根苗。本方法简化试管苗生产程序，降低生产成本，提高生产效率，生根处理25-30d，瓶外生根率达92-98%，且根系质量较高，移栽成活率达90-95%，具有较好的经济效益、社会效益和生态效益。
【专利说明】马尾松组培苗瓶外生根方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物繁殖【技术领域】，涉及组织培养育苗技术，尤其是涉及一种马尾松组培苗瓶外生根方法。
【背景技术】[0002]马尾松(/7Zzw1S原产我国，在我国分布范围极为广阔，是我国南方重要的荒山绿化、造纸原料林和采脂林、自然风景林的重要树种之一。作为一种综合利用价值高、推广潜力大的树种，马尾松不仅可用来生产三板、造纸及化纤，还可用来生产松香、松节油等工业原料。近年来，随着人们日益增长的生活需求与木材资源短缺和石油等不可再生资源逐渐枯竭等矛盾的激化，生态、经济和社会的可持续发展越来越受到社会关注。基于我国生态安生、资源安全与社会安全等问题，马尾松作为我国主要的工业用材树种和生物质能源树种之一，大力发展马尾松人工林很有必要。
[0003]我国自“六五”国家科技攻关以来，在马尾松良种选育和速生丰产栽培技术等方面取得了较大突破。目前，马尾松良种主要以种子园和母树林的有性繁殖为主。然而，有性繁殖存在着分化的问题，不能最大限度地提高遗传改良增益，而无性繁殖却能克服有性繁殖的上述不足。但是，马尾松的传统无性繁殖技术的扦插和嫁接目前仍难满足造林的需求，制约了马尾松良种繁育的进程。现代林业发展讲究速生丰产、优质高效，植物组培技术的使用，是实现马尾松优良无性系苗木快速繁育的有效途径。
[0004]传统马尾松组培苗生产程序为:无菌培养体系建立一继代增殖扩繁一瓶内生根一移栽温室一移栽苗圃。组培苗瓶外生根技术是近几年研究成功的一项先进的组培生根技术。该技术的关键是将组培苗生根阶段中的生根和驯化结合起来，省去了组培苗瓶内生根的传统程序。该技术的应用不仅减少了一次无菌操作步骤，节约了培养室空间，又简化了健康种苗生产程序，降低了生产成本，提高了生产效率。研究证实,组培苗生产的生产成本可降低35-75 %。随着组培工厂化育苗的发展，我们对马尾松组培苗瓶外生根技术进行了研究。
[0005]本发明的马尾松组培苗生产程序为:无菌培养体系建立一继代增殖扩繁一组培苗温室瓶外生根一移栽苗圃；本发明与传统的马尾松组培苗生产程序比较，省略了瓶内生根这一环节，直接将继代增殖扩繁培养的马尾松组培苗单株进行温室移植。省略室内无菌生根程序，从而减少了培养室的占用空间、配制生根培养基的原料投入、转管生根培养基的劳动力投入和能源投入和室内生根培养所需要的劳动力、能源和时间等资源投入；并避免了马尾松瓶内生根苗到移植温室所需的适应期，从而缩短育苗周期，达到简化生产程序和降低生产成本的目的。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是为了简化马尾松组培苗生产程序，提供一种适应于马尾松良种组培苗快速繁殖，并达到降低马尾松组培苗生产成本，提高生产效率的马尾松组培苗瓶外生根育苗方法。
[0007]本发明是这样实现的:
一种马尾松组培苗瓶外生根方法，包括无菌培养体系建立、继代增殖扩繁、组培苗瓶外生根、移栽苗圃培育，获得马尾松组培瓶外生根苗，其操作步骤如下:
(1)无菌培养体系建立:将马尾松种子消毒后，在无菌条件下进行种子萌发，然后截取带0.5 Cm长下胚轴的无菌苗顶芽为外植体，在培养基I中进行丛芽诱导获得马尾松丛生芽培养体系；
(2)继代增殖扩繁:将诱导出的丛生芽在培养基II中进行伸长培养后，单个切下伸长芽的顶芽接种到培养基III中进行增殖，获得继代芽I ;将继代芽I重复进行伸长，单个切下伸长的继代芽I并分成顶芽和芽段后在继代增殖培养基III中继续增殖获得继代芽II，将继代芽II再重复伸长与增殖过程，获得新的增殖继代芽；重复循环步骤继代芽伸长与增殖，直至获得大量足够生根培养继代芽；
(3)组培苗瓶外生根:将单个切下生长健壮、高2.5-3.5 cm的继代芽，用含有0.2-0.6mg/L ABT6的GD,或者是含有50-100 mg/L的吲哚丁酸IBA,25-50 mg/L的a -萘乙酸NAA的DCR或SH液体培养基的促根剂，进行30-60 min浸泡处理或加入滑石粉成糊状进行蘸根处理后，移植于装有瓶外生根基质的育苗杯中，种植后尽快用0.1 %多菌灵溶液淋定根水，并覆盖薄膜保湿；组培苗瓶外生根种植后10 d内，控制湿度90-100 % ;移植10-15 d，揭开塑料薄膜两端，控制湿度70-80 %左右；移植后15-20 d，揭开塑料薄膜，控制湿度55-65 %左右；移植后20-25 d，当苗木出现新的长势时，隔天以0.1 %的KH2PO4WA 0.05 %尿素浇施马尾松苗，3-5次隔天浇施以后，逐步将KH2PO4的浓度增加到0.5 % ；
(4)移栽苗圃:待苗木长势稳定时，移栽到苗圃，并按常规方法进行水肥及病虫害等育苗管理。
[0008]以上所述的培养基I其原料组分和质含量为:6-BA 2.5-4.0 mg.L' NAA0.05-0.1 mg.L-1、蔗糖30000 mg.L—1、酸水解酪蛋白500 mg.L-1和改良MS培养基。
[0009]以上所述的培养基II其原料组分和质含量为:NAA 0.25-0.4 mg.L-1或活性炭3000-5000 mg.L-1、蔗糖 30000 mg.L-1 和改良 MS 培养基。
[0010]以上所述的培养基III其原料组分和质含量为:6-BA 1.0-3.0 mg.L' KT 0-1.0mg.L \ NAA 0-0.3 mg.L \鹿糖 30000 mg.L 1 和改良 MS 培养基。
[0011]以上所述的改良MS培养基的基本组分和质含量为=KNO3 1650 mg。L-1 ；NH4NO3 600mg.L-1 ；CaCl2.2H20 260 mg.L-1 ；MgS04.7H20 370 mg.L-1 ；Ca (NO3)2.4H20 400 mg.L-1 ；KH2PO4 170 mg.L-1 ；MnS04.H2O 22.3 mg.L-1 ；ZnSO4.7H20 8.6 mg.L-1 ；CuSO4.5H20 0.025mg.L-1 ；H3BO3 6.2 mg.L-1 ；Na2MoO4.2H20 0.025 mg.L-1 ；KI 0.83 mg.L-1 ；CoCl2.6H20
0.025 mg.L-1 ;维生素 B1 1.0 mg.L-1 ;维生素 B6 0.5 mg.L-1 ;烟酸 0.5 mg.L-1 ;甘氨酸2.0 mg.L 1 ;月几酉享 200 mg.L、
[0012]以上所述的无菌培养体系建立、继代增殖扩繁及组培苗瓶外生根过程控制温度20-30 °C，光照 450-16000 lx，每日光照 10-16 h。
[0013]以上所述的瓶外生根基质其原料组分和体积配比为:泥炭土:蛭石:珍珠岩=1:1:1。
[0014]本发明相对于现有的技术具有以下两个方面优点:1、本发明的马尾松组培苗瓶外生根方法，在总结木本植物组培苗瓶外生根技术研究成功经验的基础上，根据马尾松组培苗的生理特征，设计马尾松组培苗瓶外生根技术研究方案，研究影响马尾松组培苗瓶外生根主要因素，开发应用于生产实践的马尾松组培苗瓶外生根技术，简化了试管苗生产程序，大大降低了生产成本，提高了生产效率。
[0015]2、采用本发明的生根方法，生根效率显著提高，生根处理25-30 d，马尾松组培苗瓶外生根率达92 %以上，最高生根率达98 %，且根系质量较高，移栽成活率达90 %以上，最高成活率达95 %，具有较好的经济效益、社会效益和生态效益。
【具体实施方式】
[0016]下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
[0017]实施例1
1、实验材料
以马尾松当年成熟球果种子萌发无菌苗顶芽为外植体，球果采自广西宁明桐棉种源营建马尾松母树林中高产脂优良马尾松家系宁明3号。
[0018]2、实验方法 (I)无菌培养体系建立
将无菌外 植体接种到改良MS培养基+6-BA 3.0 mg.Ι^+ΝΑΑ 0.1 mg.L—1+蔗糖30000mg.L—1+琼脂3500 mg.L—1的培养基上进行诱导培养。培养26 d后，平均丛芽诱导率达99.1 %。
[0019]所述的改良MS培养基的基本组成为=KNO3 1650 mg. 1 ；NH4NO3 600 mg. 1 ；CaCl2.2Η20 260 mg.L-1 ;MgS04.7Η20 370 mg.L-1 ；Ca (NO3)2.4H20 400 mg.L-1 ；KH2PO4 170mg.171 ；MnS04.H2O 22.3 mg.171 ；ZnSO4.7Η20 8.6 mg.171 ；CuSO4.5Η20 0.025 mg.171 ；H3BO36.2 mg.L-1 ；Na2MoO4.2H20 0.025 mg.L-1 ；KI 0.83 mg.L-1 ；CoCl2.6H20 0.025 mg.L-1 ；维生素 B1 1.0 mg.L—1 ;维生素 B6 0.5 mg.L—1 ;烟酸 0.5 mg.L—1 ;甘氨酸 2.0 mg.L—1 ;肌醇 200 mg.L 1。
[0020](2)继代增殖扩繁
将诱导出的丛生小芽转接到改良MS培养基+NAA 0.25 mg. 1+蔗糖30000 mg. 1+琼脂3500 mg 伸长培养基上，以促进培养物的伸长生长。伸长培养27 d，丛芽高3_5cm。将丛生芽中株高2-3 cm的单芽剪下，接种到改良MS培养基+6-BA 2.0 mg-L^+KT 1.0mg.r+NAA 0.2 mg. 1+ 蔗糖 30000 mg. 1+ 琼脂 3500 mg. 1 上进行继代芽增殖 23 d。
[0021]将继代增殖芽放到步骤(2)伸长培养基上，以促进继代增殖芽伸长。伸长培养28d，继代增殖芽高3-5 cm。将伸长继代芽分成2 cm长顶芽及I cm长带侧芽芽段后，重复步骤(2)继代增殖和丛芽伸长。继代培养6次，平均增殖系数6.4，获得大批可供生根继代芽。
[0022](3) 组培苗瓶外生根 单个切下生长健壮、高2.5-3.5 cm的继代芽，用含有0.6 mg/L ABT6的⑶液体培养基的促根剂进行60 min浸泡处理后，移植于装有泥炭土、蛭石和珍珠岩体积配比为1:1:1混合均匀的瓶外生根基质的育苗杯中，种植后尽快用0.1 %多菌灵溶液淋定根水，并覆盖薄膜保湿。移植生根处理第一个星期，湿度保持在90-100 %;移植后10 d，揭开塑料薄膜两端，湿度保持在70-80 %左右；移植后15 d，揭开塑料薄膜，湿度在55-65 % ;移植后20 d，当苗木出现新的长势时，隔天以0.1 %的KH2PO4WA 0.05 %尿素浇施马尾松苗，3-5次隔天浇施以后，逐步将KH2PO4的浓度增加到0.5 %。生根处理25 d后，组培苗瓶外生根率达94%。
[0023](4)移栽苗圃
将长势稳定组培生根苗移栽到苗圃，按照常规方法进行苗木水、肥、杂草及病虫害管理，一个月后苗木移栽成活率达92 %。
[0024]上述无菌培养体系建立、继代增殖扩繁及组培苗瓶外生根过程的控制温度20-30°C，光照 450-16000 lx，每日光照 10-16 h。
[0025]实施例2 1、实验材料
以马尾松当年成熟球果种子萌发无菌苗顶芽为外植体，球果采自广西宁明桐棉种源营建马尾松母树林中高产脂优良马尾松家系宁明4号。
[0026]2、实验方法
(1)无菌培养体系建立
将无菌外植体接种到改良MS+6-BA 4.0 mg.L:+NAA 0.1 mg *L:+鹿糖30000 mg *L:+琼脂3500 mg.L-1的培养基上进行诱导培养。培养26 d后，平均丛芽诱导率达98.4 %。
[0027]所述的改良MS培养基的基本组成同实施例1。
[0028](2)继代增殖扩繁
将诱导出的丛生小芽转接到改良MS+NAA 0.3 mg.L-1+蔗糖30000 mg.L-1+琼脂3500mg.171伸长培养基上， 以促进培养物的伸长生长。伸长培养28 d，丛芽高3-5 cm。将丛生芽中株高2-3 cm的单芽剪下，接种到改良MS培养基+6-BA 2.5 mg.L-1+ΚΤ 0.5 mg.L-1+蔗糖30000 mg.L-1+琼脂3500 mg.L-1上进行继代芽增殖26 d。
[0029]将继代增殖芽放到伸长培养基上，以促进继代增殖芽伸长。伸长培养25 d，继代增殖芽高3-5 cm。将伸长继代芽分成2 cm长顶芽及1 cm长带侧芽芽段后，重复步骤(2)继代增殖和丛芽伸长。继代培养5次，平均增殖系数6.0。
[0030](3)组培苗瓶外生根
单个切下生长健壮、高2.5-3.5 cm的继代芽，用含有50 mg/L IBA、25 mg/L NAA的DCR液体培养基的促根剂，进行30 min浸泡处理后，移植于装有泥炭土、蛭石和珍珠岩体积配比为1:1:1混合均匀的瓶外生根基质的育苗杯中，种植后尽快用0.1 %多菌灵溶液淋定根水，并覆盖薄膜保湿。生根处理前10 d，湿度保持在90-100 %;移植15 d后，揭开塑料薄膜两端，湿度保持在70-80 %左右；移植后20 d，揭开塑料薄膜，湿度在55-65 %左右；移植后25 d，当苗木出现新的长势时，隔天以0.1 %的KH2PO4加入0.05 %尿素浇施马尾松苗，3-5次隔天浇施以后，逐步将KH2PO4的浓度增加到0.5 %。生根处理30 d后，组培苗瓶外生根率达92%。
[0031](4)移栽苗圃
将长势稳定组培生根苗移栽到苗圃，按照常规方法进行苗木水、肥、杂草及病虫害管理，一个月后苗木移栽成活率达90 %。
[0032]上述无菌培养体系建立、继代增殖扩繁及组培苗瓶外生根过程的控制条件同实施例I。
[0033]实施例3
1、实验材料
以马尾松当年成熟球果种子萌发无菌苗顶芽为外植体，球果采自广西宁明桐棉种源营建马尾松母树林中高产脂优良马尾松家系宁明7号。
[0034]2、实验方法
(1)无菌培养体系建立
将无菌外植体接种到改良MS+6-BA 4.0 mg.L:+NAA 0.1 mg *L:+鹿糖30000 mg *L:+琼脂3500 mg.L-1的培养基上进行诱导培养。培养26 d后，平均丛芽诱导率达99.0 %。
[0035]所述的改良MS培养基的基本组成同实施例1。
[0036](2)继代增殖扩繁
将诱导出的丛生小芽转接到改良MS+AC 4000 mg.L—1+蔗糖30000 mg.L—1+琼脂3500mg吨―1伸长培养基上，以促进培养物的伸长生长。伸长培养28 d，丛芽高3-5 cm。将丛生芽中株高2-3 cm的单芽剪下，接种到改良MS培养基+6-BA 2.5 mg.L_1+KT 0.5 mg.L_1+NAA0.25 mg.L-1+ 蔗糖 30000 mg.L-1+ 琼脂 3500 mg.L-1 上进行继代芽增殖 26 d。
[0037]将继代增殖芽放到伸长培养基上，以促进继代增殖芽伸长。伸长培养25 d，继代增殖芽高3-5 cm。将伸长继代芽分成2 cm长顶芽及I cm长带侧芽芽段后，重复步骤(2)继代增殖和丛芽伸长。继代培养5次，平均增殖系数6.6。
[0038](3)组培苗瓶外生根
单个切下生长健壮、高2.5-3.5 cm的继代芽，用含有100 mg/L IBA,50 mg/L NAA的SH液体培养基的促根剂，在加入滑石粉后进行蘸根处理，移植于装有泥炭土、蛭石和珍珠岩体积配比为1:1:1混合均匀的瓶外生根基质的育苗杯中，种植后尽快用0.1 %多菌灵溶液淋定根水，并覆盖薄膜保湿。生根处理一星期，湿度保持在90-100 %;移植10 d后，揭开塑料薄膜两端，湿度保持在70-80 %左右；移植后15 d，揭开塑料薄膜，湿度在55-65 %左右；移植后20 d，当苗木出现新的长势时，隔天以0.1 %的KH2PO4加入0.05 %尿素浇施马尾松苗，3-5次隔天浇施以后，逐步将KH2PO4的浓度增加到0.5 %。生根处理25 d后，组培苗瓶外生根率达98 %。
[0039](4)移栽苗圃
将长势稳定组培生根苗移栽到苗圃，按照常规方法进行苗木水、肥、杂草及病虫害管理，一个月后苗木移栽成活率达95 %。
[0040]上述无菌培养体系建立、继代增殖扩繁及组培苗瓶外生根过程的控制条件同实施例I。
【权利要求】
1.一种马尾松组培苗瓶外生根方法，其特征在于:包括无菌培养体系建立、继代增殖扩繁、组培苗瓶外生根、移栽苗圃培育，获得马尾松组培瓶外生根苗，其操作步骤如下: (1)无菌培养体系建立:将马尾松种子消毒后，在无菌条件下进行种子萌发，然后截取带0.5cm长下胚轴的无菌苗顶芽为外植体，在培养基I中进行丛芽诱导获得马尾松丛生芽培养体系； (2)继代增殖扩繁:将诱导出的丛生芽在培养基II中进行伸长培养后，单个切下伸长芽的顶芽接种到培养基III中进行增殖，获得继代芽I ;将继代芽I重复进行伸长，单个切下伸长的继代芽I并分成顶芽和芽段后在继代增殖培养基III中继续增殖获得继代芽II，将继代芽II再重复伸长与增殖过程，获得新的增殖继代芽；重复循环步骤继代芽伸长与增殖，直至获得大量足够生根培养继代芽； (3)组培苗瓶外生根:将单个切下生长健壮、高2.5-3.5cm的继代芽，用含有0.2-0.6mg/L ABTJ^O)，或者是含有 50-100mg/L 的吲哚丁酸 IBA、25-50mg/L 的 a -萘乙酸NAA的DCR或SH液体培养基的促根剂，进行30_60min浸泡处理或加入滑石粉成糊状进行蘸根处理后，移植于装有瓶外生根基质的育苗杯中，种植后尽快用0.1 %多菌灵溶液淋定根水，并覆盖薄膜保湿；组培苗瓶外生根种植后IOd内，控制湿度90-100 % ;移植10-15 d，揭开塑料薄膜两端，控制湿度70-80 %左右；移植后15-20 d，揭开塑料薄膜，控制湿度55-65% ;移植后20-25 d，当苗木出现新的长势时，隔天以0.1 %的KH2PO4加入0.05 %尿素浇施马尾松苗，3-5次隔天浇施以后，逐步将KH2PO4的浓度增加到0.5 % ； (4)移栽苗圃:待苗木长势稳定时，移栽到苗圃，并按常规方法进行水肥及病虫害育苗管理。
2.根据权利要求1所述的一种马尾松组培苗瓶外生根方法，其特征在于:所述的培养基I其原料组分和质含量为:6-BA 2.5-4.0mg.L' NAA 0.05-0.1mg.L—1、蔗糖30000mg.L'酸水解酪蛋白500mg/l和改良MS培养基。
3.根据权利要求1所述的一种马尾松组培苗瓶外生根方法，其特征在于:所述的培养基II其原料组分和质含量为=NAA 0.25-0.4mg.L-1或活性炭3000_5000mg.L-1、蔗糖30000mg./L和改良MS培养基。
4.根据权利要求1所述的一种马尾松组培苗瓶外生根方法，其特征在于:所述的培养基III其原料组分和质含量为:6-BA 1.0-3.0mg.L'KT 0-1.0mg.L'NAA 0-0.3mg.L'蔗糖30000mg./L和改良MS培养基。
5.根据权利要求2-4所述的任一种马尾松组培苗瓶外生根方法，其特征在于:所述的改良MS培养基的基本组分和质含量为=KNO3 1650mg./L ；NH4NO3 600mg./L ；CaCl2.2H20260mg.I/1 ；MgS04.7H20 370mg.I/1 ；Ca (NO3)2.4H20 400mg.I/1 ；KH2PO4 170mg.I/1 ；MnSO4.H2O 22.3mg.I/1 ；ZnS04.7H20 8.6mg.I/1 ；CuS04.5H20 0.025mg.I/1 ；H3B036.2mg.L-1 ；Na2MoO4.2H20 0.025mg.L-1 ；KI 0.83mg.L-1 ；CoCl2.6H20 0.025mg.L-1 ；维生素 B1 1.0 mg.171;维生素 B6 0.5mg.I71 ;烟酸 0.5mg.L—1 ;甘氨酸 2.0mg.I71 ;肌酉享200mg.L 1O
6.根据权利要求1所述的一种马尾松组培苗瓶外生根方法，其特征在于:所述的无菌培养体系建立、继代增殖扩繁及组培苗瓶外生根过程控制温度20-30°C，光照450-16000Ix,每日光照10_16h。
7.根据权利要求1所述的一种马尾松组培苗瓶外生根方法，其特征在于:所述的瓶外生根基质其原料组分和体积配比为:泥炭土:蛭石:珍珠岩= 1:1:1。
【文档编号】A01H4/00GK103461121SQ201310396794
【公开日】2013年12月25日 申请日期:2013年9月4日 优先权日:2013年9月4日
【发明者】姚瑞玲, 袁铁象, 吴幼媚, 蔡玲 申请人:广西壮族自治区林业科学研究院