一种滇桂艾纳香药材的快速繁殖方法
【专利摘要】本发明公开了一种滇桂艾纳香药材的快速繁殖方法，包括：滇桂艾纳香药材外植体灭菌、愈伤组织诱导、愈伤组织分化、丛生芽增殖、丛生芽生根培养和组培苗移栽。本发明的滇桂艾纳香药材快速繁殖方法，适用于工厂化规模繁育、种植，具有投资少、育苗速度快，成活率高、周期短，幼苗长势一致等优点，外植体取材容易，数量大，范围广，组培成活率高达95%，且遗传特性稳定，生产出的药材质量稳定，同时保证滇桂艾纳香药材来源稳定，真正发挥滇桂艾纳香药材在中国西南地区生态效益与经济效益提供了一种快速有效的途径。
【专利说明】一种滇桂艾纳香药材的快速繁殖方法
【技术领域】
[0001]本发明属于植物组培快速繁殖【技术领域】，具体说是涉及一种专用于滇桂艾纳香药材快速繁殖及栽培的方法。
【背景技术】[0002]滇桂艾纳香Diaz职/广设HERBA BLUMEAE沿烈沿说'，为菊科艾纳香属植物，又名华艾纳香、管芽，是一种生长在中国西南少数民族地区的中草药，是广西桂西制药有限公司主打产品妇血康颗粒的主要原料，全草入药，产品具有活血化瘀、止血调经的作用，用于治疗瘀血阻滞，月经过多，经期过长，产后恶露不绝等妇科血症治疗总有效率达96%以上，是一种经济价值极高的植物。
[0003]滇桂艾纳香药材对生长环境要求苛刻，适于在冬季≥_2°C，夏季< 35°C，温暖，雨水充沛的亚热带区域生长，喜阴喜湿，忌过强光照，栽培相当困难。自滇桂艾纳香药用价值被发掘后，被制成药品，年需求量达2000吨以上。但滇桂艾纳香药材原料来源于野生的滇桂艾纳香资源，经过多年的采掘，野生滇桂艾纳香药材资源已逐步减少，而且药材的质量不稳定，不能满足已扩大的生产需求，需要进行大面积的人工栽培作为药材原料的来源。目前，野生滇桂艾纳香药材主要通过种子繁殖，由于该药材的种子胚组织发育不良，兼受季节、生长环境等因素的影响，种子的繁殖率低，发芽率低于5%，不能满足大面积人工栽培的需要；此外，由于是有性杂交繁殖，因而使后代产生遗传变异，造成质量不稳定，不利于药品生产过程的质量控制。通过种子繁殖法进行育种，繁殖速度慢，成活率低，难以满足大规模种植的要求，因此急需繁殖率高，速度快的繁殖方法进行大田生产。
[0004]迄今为止，国内外组培技术已经取得了很大的进展，但针对滇桂艾纳香药材的组培研究还是比较少，广西桂西制药有限公司一直致力于滇桂艾纳香药材快繁方法的研究，在前人的研究基础上，通过方法改进，省掉了滇桂艾纳香药材组培苗壮苗的步骤，但同样获得了比较高的成活率，而且缩短了繁殖周期。韦鹏宵、张明珍等人对滇桂艾纳香药材的灭菌和愈伤组织诱导和滇桂艾纳香药材组培体系进行了实验研究，该些内容仅为滇桂艾纳香药材快繁过程中基础理论的实验室研究工作，与工厂化大规模实际生产还有区别，虽对滇桂艾纳香药材育苗技术具有非常重要的参考价值，但没有解决滇桂艾纳香药材成活率低，成本高昂的问题，同时在滇桂艾纳香药材组织培养过程中外植体的消毒方法中研究不同灭菌剂和不同灭菌时间对不同外植体灭菌效果的影响，此方法经过实验室验证，对滇桂艾纳香药材外植体的消毒处理的确有效，但灭菌率和诱导率都不是很高，成活率较低，无法达到工厂化生产需求；在韦鹏宵、张明珍等人滇桂艾纳香药材组织培养的研究中还涉及到了不同植物激素对滇桂艾纳香药材愈伤组织诱导的影响，但对后期丛芽的增殖、生根、种苗移栽研究比较少，但是这个在工厂化种植中更为重要。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种滇桂艾纳香药材的快速繁殖方法，该方法培养的愈伤组织诱导率高，分化率高，稳定性好，能在较短的时间内获得大量生长健壮的试管苗，培养形成的种苗可直接用于大田种植，繁殖速度快，效果好，成活率高，而且该方法，操作简便、生产成本低，对环境影响小。
[0006]为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下:
一种滇桂艾纳香药材的快速繁殖方法，包括滇桂艾纳香药材外植体灭菌、愈伤组织诱导、愈伤组织分化、丛生芽增殖、丛生芽生根培养和组培苗移栽，具体步骤如下:
①滇桂艾纳香药材外植体灭菌:取的滇桂艾纳香药材外植体，放在消毒水中浸泡，并不断摇动2~3min，然后用无菌水冲洗2~3h，放在无菌滤纸上吸干表面水分，然后，用70%乙醇浸泡3(T40s，用无菌水冲洗5~8次，浸入0.1%~0.15% HgCl2溶液中处理3飞min，用无菌水冲洗5~8次，无菌滤纸吸干表面水分，再浸入89Tl5%NaC10溶液中处理3飞min，用无菌水冲洗5~8次，无菌滤纸吸干表面水分；
②愈伤组织诱导:将消毒后的滇桂艾纳香药材外植体转接于培养基混合物中，26±2°C，暗培养，诱导滇桂艾纳香药材丛生芽，诱导时间持续2(T30d ;其中，培养基混合物=MS基本培养基，BA浓度为3飞mg/L，NAA度为0.2~0.6mg/L,过磷酸钙0.5~1.5g mg/L,附加蔗糖20g~30g/L作为碳源，添加6 g/L琼脂作为凝固剂；用Imol/LNaOH和lmol/LHCl调节PH值为5~6 ；
③愈伤组织分化:将诱导出的愈伤组织转入分化培养基混合物中，26± 2 °C，湿度80%，光培养，光照1100 Lux，14~16 h/d，愈伤组织开始分化出滇桂艾纳香药材丛生芽，时间持续15~25d ;其中，培养基混合物:MS基本培养基，BA浓度为I~3mg/L，NAA度为0.2~0.4mg/L,KT浓度为0.5~2 mg/L，过磷酸钙0.5~1.5g mg/L,附加蔗糖20g~30g/L作为碳源，添加6.5g/L琼脂作为凝固剂；用lmol/L NaOH和lmol/L HCl调节pH值为5~6 ；
④丛生芽增殖:将诱导出的丛生芽的滇桂艾纳香药材试管苗转接到增殖培养基混合物上，25±1°C，湿度80%，光培养，光照1100 Lux, 15h/d，进行增殖培养，增殖培养时间持续2(T25d ;其中，增殖培养基混合物:MS基本培养基、BA浓度I~3mg/L、KT浓度为0.5~Img/L、过磷酸钙 0.5~1.5g mg/L、鹿糖 20g~30g/L 和琼脂 6.5 g/L,用 lmol/L NaOH 和 lmol/LHCl调节pH值为5~6 ；
⑤丛生芽生根培养:将增殖后的滇桂艾纳香药材丛生芽，经过分离后转接到生根培养基混合物上，26土 TC，湿度80%，光照1100 Lux, 15h/d，进行生根培养，生根培养时间持续35cT40d，从苗的基部长出根，成为完整植株；其中，生根培养基混合物:MS基本培养基、NAA浓度为I~2mg/L、IBA浓度为0.5~lmg/L、过磷酸钙0.5~1.5g mg/L，蔗糖20g~30g/L和琼脂 6.5 g/L, M lmol/L NaOH 和 lmol/L HCl 调节 pH 值为 5~6 ；
⑥组培苗移栽:将生根培养后的滇桂艾纳香药材组培苗进行炼苗5~7d，用自来水将根系残留的培养基冲洗干净，栽于盛有灭菌基质的营养钵内，温度26土 1°C,湿度80% ;其中，基质为体积比为1:1的草炭与珍珠岩的混合物。
[0007]步骤①中，选择生长健壮而无病虫害的植株的外植体，包括茎尖、嫩茎、种子和叶片等部位。
[0008]步骤①中，取的滇桂艾纳香药材外植体，放在消毒水中浸泡，并不断摇动3min，然后用无菌水冲洗2.5h,放在无菌滤纸上吸干表面水分,然后,用70%乙醇浸泡35s,用无菌水冲洗3次，浸入0.1% HgCl2溶液中处理4min，用无菌水冲洗6次，无菌滤纸吸干表面水分；再浸入10%NaC10溶液中处理4min，用无菌水冲洗6次，无菌滤纸吸干表面水分。
[0009]步骤①中，消毒水为洗洁精、洗衣粉和肥皂水中的一种或几种联合使用。
[0010]步骤②中，诱导培养基混合物中，BA浓度为3mg/L，NAA度为0.3mg/L,过磷酸钙
0.5g mg/L,附加鹿糖25g/L作为碳源，pH值为5.6。
[0011 ] 步骤③中，分化培养基混合物中，BA浓度为2.5mg/L, NAA度为0.2mg/L, KT浓度为lmg/L,过磷酸钙0.5g mg/L,附加鹿糖25g/L作为碳源，pH值为5.6。
[0012]步骤④中，增殖培养基混合物:BA浓度为1.5mg/L，KT浓度为lmg/L，过磷酸钙0.5gmg/L,附加鹿糖25g/L作为碳源，pH值为5.6。
[0013]步骤⑤中，生根培养基混合物中，NAA浓度为2mg/L、IBA浓度为lmg/L，过磷酸钙
0.5g mg/L,鹿糖 25g/L, pH 值为 5.6。
[0014]本发明具有如下优点:与现有技术相比，本发明的滇桂艾纳香药材快速繁殖方法，适用于工厂化规模繁育、种植，具有投资少、育苗速度快、成活率高、幼苗长势一致等优点；外植体取材容易，数量大，范围广，可利用滇桂艾纳香药材的茎尖、茎段、叶片、花苞、种子作为外植体进行组织培养 ，发芽率可达80%~85%，且遗传特性稳定，生产出的药材质量稳定；从外植体接种至完整植株形成仅需2~3个月，周期短；在增殖过程中能同步增殖和生根，试管苗移栽到珍珠岩与草炭等混合基质中，营养成分高，方法简单，繁殖系数能达到
4.0-6.0，移栽成活率达到了 95%以上；本发明操作方法简单，移栽的试管苗可直接用于大田生产，只需要简单的设施，成本低，不受季节限制，运输成本低廉，为各种滇桂艾纳香品种的大规模种植提供一种周期短、繁殖率高、成本低廉的育苗方法。
【具体实施方式】
[0015]下面结合实施例对本发明的技术方案作具体详细说明，下列实施例以本发明技术方案为前提，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0016]实施例1:滇桂艾纳香药材外植体的灭菌
从滇桂艾纳香药材外植体剪取茎尖约长2cm，取洗洁精2~3ml，溶于2~3L自来水中，将外植体放置于放在洗洁精水(浓度约为1%。)中浸泡2min，并不断摇动，然后用无菌水冲洗2~3h，用无菌滤纸吸干表面水分。预处理后，将外植体材料放置于超净工作台上，用70%乙醇和0.1% HgCl2溶液对外植体进行灭菌消毒处理试验，每次乙醇消毒处理后用无菌水冲洗5次，HgCl2处理后用无菌水冲洗5次。
[0017]本实验共设12个处理，每个处理重复3次。消毒方式70%乙醇消毒处理30s、35s、40s ;0.1% HgCl2 消毒处理 3min、4 min、5min、6min ;8%NaC10 溶液中处理 3min、4 min、5min、6min。消毒后的外植体放在已灭菌的培养皿中，接种到诱导培养基上(诱导培养基为MS+BA3.0 mg/L+NAA浓度为0.3mg/L+过磷酸钙0.5g mg/L+鹿糖25g/L),每个处理接种12个外植体，重复3次，15d后统计污染率,25 d后统计成活率。
[0018]实验结果如表1所示，从污染率来看，消毒剂处理时间越长，污染率越低，但是其成活率也最低，这就说明用消毒剂处理时间越长，虽然灭菌效果极好，但同时也对外植体造成了伤害，明显降低了外植体的诱导率，使用70%乙醇消毒40s比消毒30s处理后污染率虽有所降低，但是诱导率也显著降低，这是由于滇桂艾纳香茎尖外植体细小、幼嫩，而乙醇具有较强的穿透力和杀菌力，处理40s对滇桂艾纳香外植体存在一定的伤害，因而在乙醇消毒时间上选择35s。当HgCl2溶液和NaCIO溶液消毒时间分别为3min时，灭菌时间过短导致部分病菌没有被杀死，因而污染率较高，虽然诱导率能达到60%以上，但因其高污染率而不作为最佳处理。可见在降低污染率措施时，并不是消毒时间越长越好，消毒时间也不能过短，不宜采用延长消毒时间的办法。
[0019]表1不同灭菌处理方式对滇桂艾纳香药材外植体培养的影响。
【权利要求】
1.一种滇桂艾纳香药材的快速繁殖方法，其特征在于，包括滇桂艾纳香药材外植体灭菌、愈伤组织诱导、愈伤组织分化、丛生芽增殖、丛生芽生根培养和组培苗移栽，具体步骤如下: ①滇桂艾纳香药材外植体灭菌:取的滇桂艾纳香药材外植体，放在消毒水中浸泡，并不断摇动2~3min，然后用无菌水冲洗2~3h，放在无菌滤纸上吸干表面水分，然后，用70%乙醇浸泡3(T40s，用无菌水冲洗5~8次，浸入0.1%~0.15% HgCl2溶液中处理3飞min，用无菌水冲洗5~8次，无菌滤纸吸干表面水分，再浸入89Tl5%NaC10溶液中处理3飞min，用无菌水冲洗5~8次，无菌滤纸吸干表面水分； ②愈伤组织诱导:将消毒后的滇桂艾纳香药材外植体转接于培养基混合物中，26±2°C，暗培养，诱导滇桂艾纳香药材丛生芽，诱导时间持续2(T30d ;其中，培养基混合物=MS基本培养基，BA浓度为3飞mg/L，NAA度为0.2~0.6mg/L,过磷酸钙0.5~1.5g mg/L,附加蔗糖20g~30g/L作为碳源，添加6 g/L琼脂作为凝固剂；用Imol/LNaOH和lmol/LHCl调节PH值为5~6 ； ③愈伤组织分化:将诱导出的愈伤组织转入分化培养基混合物中，26± 2°C，湿度80%，光培养，光照1100 Lux，14~16 h/d，愈伤组织开始分化出滇桂艾纳香药材丛生芽，时间持续15~25d ;其中，培养基混合物:MS基本培养基，BA浓度为I~3mg/L，NAA度为0.2~0.4mg/L,KT浓度为0.5~2mg/L，过磷酸钙0.5~1.5g mg/L,附加蔗糖20g~30g/L作为碳源，添加6.5g/L琼脂作为凝固剂；用lmol/L NaOH和lmol/L HCl调节pH值为5~6 ； ④丛生芽增殖:将诱导出的丛生芽的滇桂艾纳香药材试管苗转接到增殖培养基混合物上，25±1°C，湿度80%，光培养，光照1100 Lux, 15h/d，进行增殖培养，增殖培养时间持续2(T25d ;其中，增殖培养基混合物:MS基本培养基、BA浓度I~3mg/L、KT浓度为0.5~Img/L、过磷酸钙 0.5~1.5g mg/L、鹿糖 20g~30g/L 和琼脂 6.5 g/L,用 lmol/L NaOH 和 lmol/LHCl调节pH值为5~6 ； ⑤丛生芽生根培养:将增殖后的滇桂艾纳香药材丛生芽，经过分离后转接到生根培养基混合物上，26 土 1°C，湿度80%，光照1100 Lux, 15h/d，进行生根培养，生根培养时间持续35cT40d，从苗的基部长出根，成为完整植株；其中，生根培养基混合物:MS基本培养基、NAA浓度为I~2mg/L、IBA浓度为0.5~lmg/L、过磷酸钙0.5~1.5g mg/L，蔗糖20g~30g/L和琼脂 6.5 g/L, M lmol/L NaOH 和 lmol/L HCl 调节 pH 值为 5~6 ； ⑥组培苗移栽:将生根培养后的滇桂艾纳香药材组培苗进行炼苗5~7d，用自来水将根系残留的培养基冲洗干净，栽于盛有灭菌基质的营养钵内，温度26土 1°C,湿度80% ;其中，基质为体积比为1:1的草炭与珍珠岩的混合物。
2.根据权利要求1所述的滇桂艾纳香药材快速繁殖方法，其特征在于，步骤①中，选择生长健壮而无病虫害的植株的外植体，包括茎尖、嫩茎、种子和叶片等部位。
3.根据权利要求1所述的滇桂艾纳香药材快速繁殖方法，其特征在于，步骤①中，取的滇桂艾纳香药材外植体，放在消毒水中浸泡，并不断摇动3min，然后用无菌水冲洗2.5h，放在无菌滤纸上吸干表面水分，然后，用70%乙醇浸泡35s,用无菌水冲洗3次,浸入0.1%HgCl2溶液中处理4min，用无菌水冲洗6次，无菌滤纸吸干表面水分；再浸入10%NaC10溶液中处理4min,用无菌水冲洗6次,无菌滤纸吸干表面水分。
4.根据权利要求1所述的滇桂艾纳香药材快速繁殖方法，其特征在于，步骤①中，消毒水为洗洁精、洗衣粉和肥皂水中的一种或几种联合使用。
5.根据权利要求1所述的滇桂艾纳香药材快速繁殖方法，其特征在于，步骤②中，诱导培养基混合物中，BA浓度为3mg/L,NAA度为0.3mg/L,过磷酸|丐0.5g mg/L,附加鹿糖25g/L作为碳源，pH值为5.6。
6.根据权利要求1所述的滇桂艾纳香药材快速繁殖方法，其特征在于，步骤③中，分化培养基混合物中，BA浓度为2.5mg/L, NAA度为0.2mg/L, KT浓度为lmg/L，过磷酸钙0.5gmg/L,附加鹿糖25g/L作为碳源，pH值为5.6。
7.根据权利要求1所述的滇桂艾纳香药材快速繁殖方法，其特征在于，步骤④中，增殖培养基混合物:BA浓度为1.5mg/L,KT浓度为lmg/L,过磷酸|丐0.5g mg/L,附加鹿糖25g/L作为碳源，pH值为5.6。
8.根据权利要求1所述的滇桂艾纳香药材快速繁殖方法，其特征在于，步骤⑤中，生根培养基混合物中，NAA浓度为2mg/L、IBA浓度为lmg/L,过磷酸|丐0.5g mg/L,鹿糖25g/L, pH 值为 5.6。
【文档编号】A01H4/00GK103688856SQ201310677394
【公开日】2014年4月2日 申请日期:2013年12月13日 优先权日:2013年12月13日
【发明者】包国庆, 黄河 申请人:广西桂西制药有限公司