一种筛选转基因植物种子的方法

一种筛选转基因植物种子的方法
【专利摘要】本发明提供一种筛选转基因种子的方法，该方法包括：（1）、对需要筛选的种子进行消毒处理；（2）、提供无菌培养皿，在无菌培养皿中放置一张或多张无菌滤纸，使抗生素溶液湿润每一张滤纸；（3）将经过步骤1消毒的种子播种在步骤2的培养皿中的滤纸表面上；其中，所述的种子为T0代烟草或拟南芥转基因种子。通过该方法，可以提高后期苗的成活率，大大降低筛选成本和提交生产效率,特别的,在配置抗生素的时候,采用未灭菌的蒸馏水替代灭菌的水作为溶剂。
【专利说明】一种筛选转基因植物种子的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于转基因技术，特别的，属于一种植物转基因种子筛选技术。
【背景技术】
[0002]随着基因工程技术的快速发展，植物转基因技术被广泛应用于现代生物技术研究及农业生产中。如何快速、便捷、高通量的筛选与种植转基因植物是其中的一个重要环节。
[0003]传统的方法是将L代种子播种于含相应抗生素的培养基中，生长一定时间后出现表型分离，一般，带有目标基因的阳性植株呈正常绿色，阴性植株则出现黄化。继续生长至适宜苗龄时，从瓶中移出阳性植株栽种。该法虽被广泛使用，但存在如下缺点:首先，要制备大量的培养基，这些培养基需要经过湿热灭菌后，再加抗生素，最后倒制平板，然后再把种子播种在还有抗生素的培养基上，同时，种子也必须经过严格的消毒。这样做不仅增加了试剂成本，且对无菌操作技术也提出了较高要求，整个过程都需要在无菌换进下进行操作，而且筛选的时间长。整个过程繁琐，耗时长；其次，将组培苗移至营养土中时，由于根系扎入培养基，在去除残留培养基时易损伤根系，及其显著降低组培苗成活率；第三，在培养基中生长的小苗如果移栽太早，苗小，长势弱，成活率非常低，需苗在组培瓶中生长至较大时再进行移栽，这样做虽增加了移栽的成活率，却延误了时间；第四，种子消毒必须彻底，与清水相t匕，在培养基的长时间培养更易导致污染。有鉴于此，需要开发快速、高效与简洁的播种及筛选转基因种子技 术。

【发明内容】

[0004]为了克服传统方法的缺陷，本发明提供一种新型的转基因种子播种及筛选技术，它有效地解决了传统方法存在的上述弊端。
[0005]一方面，该本发明提供一种转基因植物种子的筛选方法，该方法包括:对需要筛选的种子进行消毒处理；2、提供无菌培养皿，在无菌培养皿中放置一张或多张无菌滤纸，使抗生素溶液湿润每一张滤纸；3、将经过步骤1消毒的种子播种在步骤2的培养皿中的滤纸表面上；其中，所述的种子为T0代烟草或拟南芥转基因种子。
[0006]在一些优选的方式中，当种子为T0代烟草种子的时候，其中该转基因种子中部分种子含有抗潮霉素的基因，湿润所述滤纸的抗生素为40 mg/L的潮霉素溶液，让每克滤纸吸收7毫升的潮霉素溶液。
[0007]在一些优选的方式中，，当种子为T0代拟南芥种子的时候，其中该转基因种子中部分种子含有抗卡纳霉素的基因，湿润所述滤纸的抗生素为100 mg/L的卡纳霉素溶液，让每克滤纸吸收14毫升的卡纳霉素溶液。
[0008]在一些优选的方式中，消毒处理的步骤如下:先将适量待播的转基因种子倒入1.5mL无菌离心管中，加入75%乙醇处理30 s;弃去75%乙醇，加入20%次氯酸钠处理20 s ;弃去20%次氯酸钠，用无菌蒸馏水洗涤种子3-4次。
[0009]在另一些优选的方式中，先对种子进行黑暗培养，待种子萌发至刚露出胚根，且胚根的长度为1-3毫米时，进行光照培养，光照培养的条件为:温度24 土 1°C、光照强度2000 Lux，光周期为16 h，直至转基因幼苗长出两片绿色子叶且阴性对照出现黄化后，将叶片呈绿色的幼苗播于营养土中。优选的，培根的长度小于2毫米的时候进行光照培养。优选的，用封口膜密封无菌培养皿，并让密封的培养皿处于黑暗环境，温度24 土1°C，湿度为60%-75%下暗培养2-3天进行发芽。
[0010]在一些优选的方式中，种子是转基因烟草?；代种子。这里所所的?；代种子是目标基因被插入到组织或细胞基因组中获得的当代种子，例如，当通过组织培养的方法，对某个植物的愈伤组织进行农杆菌介导法把某个目的外源基因插入到该植物的组织细胞中的基因序列中的某一个位置，然后通过培养获得小苗，该小苗上的种子为I代。在?；的种子中，有些可能还有目的基因，有的可能不含有目的基因。另外，在进行目的基因转化中，可以把一些抗抗生素的基因与目的基因连接，如果转化的种子中含有抗生素基因，就表示目的基因也被包含在该转基因植物的种子中，当然，单独的抗潮霉素或卡纳霉素的基因也可以被转入到植物中。常用的抗生素为抗潮霉素或卡纳霉素的基因，这些基因的序列为现有公知的技术，转基因植物的获得方法也是本领域的公知技术。
[0011]在一些优选的方式中，消毒处理的步骤如下:先将适量待播的转基因种子倒入1.5mL无菌离心管中，加入75%乙醇处理30 s;弃去75%乙醇，加入20%次氯酸钠处理20 s ;弃去20%次氯酸钠，用无菌蒸馏水洗涤种子3-4次。
[0012]在一些优选的方式中，湿润滤纸的抗生素为40 mg/L,让每克滤纸吸收大约7毫升的抗生素溶液，也可以是让每克滤纸吸收大约6-9毫升的抗生素溶液。处理滤纸的抗生素溶液的量特别关键，我们发现，如果是烟草种子，且抗生素的浓度为40 mg/L的情况下，每克滤纸处理抗生素的量处于7毫升左右时筛选效果最好，有85-98%的正确率。相反，不在此筛选浓度左右下，筛选效果差，几乎不能满足筛选目的。含量太低，假阳性的种子特别多，绝大多数种子均发芽并正常生长，也不能满足要求；含量太高，几乎所有的种子(90%-95%)都不能萌发或正常的后期生长。
[0013]在优选的方式中，抗生素为潮霉素或卡纳霉素。在一些优选的方式中，种子为烟草或拟南芥T0代转基因种子。当转基因种子为T0代拟南芥种子的时候，且种子中含有抗卡纳霉素的基因的时候，让每克滤纸吸`收大约14毫升的100 mg/L含卡纳霉素的溶液。
[0014]在一些优选的方式中，用封口膜密封无菌培养皿，并让密封的培养皿处于黑暗环境，温度24 ±1°C，湿度为60%-75%下暗培养2-3天进行发芽。
[0015]在另一些优选的方式中，待种子萌发至刚露出胚根后，胚根的长度为1-3毫米下，进行光照培养，培养的条件为:温度24 土 1°C、光照强度2000 Lux，光周期为16 h，直至转基因幼苗长出两片绿色子叶且阴性对照出现黄化后，将叶片呈绿色的幼苗播于营养土中，盖保鲜膜以减少水分蒸发，继续光照培养，培养的条件为:培养温度24 土 1°C、光照强度2000 Lux，光周期为16 h0
[0016]有益效果
本发明通过滤纸上还有抗生素来筛选转基因种子，相对与传统的培养基筛选，更快速、更高效与简洁，而且成本低。特别适用筛选T0代烟草和拟南芥转基因种子。
【专利附图】

【附图说明】[0017]图1为实施例子2的实验结果图。A:阳性对照(培养皿内滤纸用不含相应浓度抗生素的蒸馏水浸润，种子为野生型本氏烟);B:阴性对照(培养皿内滤纸用含相应浓度抗生素的蒸馏水浸润，种子为野生型本氏烟);C 代转基因种子。
[0018]图2实施例子2的结果实验图。A:幼苗移栽时合适的根长(3毫米);B:幼苗移栽时不适宜的根长(实际为23毫米)。
[0019]图3为实施例子2中转基因苗生长的不同阶段的结果图。A 代转基因种子播种于含相应浓度抗生素蒸馏水的培养皿中:T0代转基因种子暗培养2-3 d后刚长出胚根；C:!；代转基因种子经光照培养后已长出两片绿色子叶，并产生3:1的分离比；D-E:移至营养土后的I代转基因幼苗。
[0020]图4为转基因与非转基因拟南芥不同生长阶段实验结果图；萌发A:6 d；B:移苗ID C:移苗5 D D:移苗15D。
【具体实施方式】
[0021]现以潮霉素抗性转基因烟草为例来说明本发明的一个具体方式，该方式并不是对本发明的限制。
[0022]实施1:滤纸中不同含暈的抗生素溶液对T0代烟草种子萌发率和筛选效果的影响。
[0023]1.实验材料
含无菌滤纸的无菌培养皿、1.0 mL无菌枪头(剪去枪头顶端)、1.5 mL无菌离心管、75%乙醇、20%次氯酸钠及无菌蒸馏水。
[0024]2.种子的消毒与播·种的步骤如下:
①240颗待播的转基因烟草T0代种子倒入1.5mL无菌离心管中，加入1 mL的75%乙醇处理30 s;
②弃去75%乙醇，加入1mL的20%次氯酸钠处理20 s ；
③弃去20%次氯酸钠，用无菌蒸馏水洗涤3-4次；
④弃去无菌蒸懼水；
⑤提供含无菌滤纸的无菌培养皿，提供用无菌蒸馏水作为溶剂配置的40mg/L含潮霉素的溶液，用以上含潮霉素的溶液将培养皿内的无菌滤纸打湿，其中，让培养皿里的无菌纸含有不同含量的抗生素，具体如下(毫升/克滤纸):0、2.2,4.4,7.0,14.0。在露出胚根的时候统计发芽率(培根的长度为2毫米)。待种子萌发至刚露出胚根(2毫米长)后，光照培养4d后，统计绿叶和黄化页数目，并计算比率。培养的条件为:温度24 土 1°C、光照强度2000Lux,光周期为16 h)。
[0025]⑥用无菌1.0 mL枪头将种子均匀播种于上述培养皿中的无菌纸表面上；
⑦在培养皿上封上封口膜，让培养皿暗培养2-3 d，待种子萌发。
[0026]结果如下:
表1:滤纸上不同含量抗生素对烟草T0代转基因种子发芽和筛选结果影响
【权利要求】
1.一种筛选转基因种子的方法，该方法包括:(1)、对需要筛选的种子进行消毒处理；(2)、提供无菌培养皿，在无菌培养皿中放置一张或多张无菌滤纸，使抗生素溶液湿润每一张滤纸；(3)将经过步骤1消毒的种子播种在步骤2的培养皿中的滤纸表面上；其中，所述的种子为TO代烟草或TO代拟南芥转基因种子。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当种子为TO代烟草种子的时候，其中该转基因种子中部分种子含有抗潮霉素的基因，湿润所述滤纸的抗生素为40 mg/L的潮霉素溶液，让每克滤纸吸收7毫升的潮霉素溶液，其中，配置抗生素的溶剂为未灭菌的蒸馏水。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，当种子为T0代拟南芥种子的时候，其中该转基因种子中部分种子含有抗卡纳霉素的基因，湿润所述滤纸的抗生素为100 mg/L的卡纳霉素溶液，让每克滤纸吸收14毫升的卡纳霉素溶液，其中，配置抗生素的溶剂为未灭菌的蒸馏水。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于，所述的消毒处理的步骤如下:先将适量待播的转基因种子倒入1.5 mL无菌离心管中，加入75%乙醇处理30 s;弃去75%乙醇，加入20%次氯酸钠处理20 s ;弃去20%次氯酸钠，用无菌蒸馏水洗涤种子3-4次。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，在步骤3后，用封口膜密封无菌培养皿，并让密封的培养皿处于黑暗环境，温度24 ±1°C，湿度为60%-75%下暗培养2-3天进行发芽。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，对种子进行黑暗培养后，待种子萌发至刚露出胚根，且胚根的长度为1-3毫米时，进行光照培养，光照培养的条件为:温度24 土1°C、光照强度2000 Lux，光周期为16 h，直至转基因幼苗长出两片绿色子叶且阴性对照出现黄化后，将叶片呈绿色的`幼苗播于营养土中。
【文档编号】A01G31/00GK103651078SQ201310677142
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月12日 优先权日:2013年12月12日
【发明者】王长春, 苗爽, 冯彩芬, 汤湖斌, 闵康康, 杨玲, 胡海涛, 张维林 申请人:浙江师范大学