花鲈精液的处理方法
【专利摘要】本发明提供一种花鲈精液的处理方法，该方法包括以下步骤：（1）将花鲈精液与抗冻液按体积比1：3比例稀释混匀；（2）预冷处理，将稀释后的混合液在4℃预冷3分钟；（3）预冷后以分段方式降温处理；（4）分装保存。本发明提供的花鲈精液的处理方法，解决了雄性花鲈亲鱼产精时间短、产精量少的困难，解决了花鲈雌雄个体性成熟不同步的问题，解决了花鲈精子无法长距离、长时间运输的困难；保存的花鲈精子，可以随时随地为异源雌核诱导育种提供材料，有利于花鲈的可持续养殖，有利于花鲈遗传多样性的保护，有利于花鲈品系的选育；在花鲈的繁殖、遗传育种以及种质资源保存中具有重要的意义。
【专利说明】花鲈精液的处理方法【技术领域】
[0001]本发明涉及鱼类遗传【技术领域】，尤其涉及一种花鲈精液的处理方法。
【背景技术】
[0002]花鲈属鲈形目，鯧科，花鲈属。俗称:鲈鱼、海鲈，又称日本真鲈。其个体大，肉质佳美，适应性强，生长快、食性广，蛋白质、韩、磷、铁、维生素、烟酸、微量维生素BI等营养物质含量丰富，是我国名贵的海水肉食性养殖鱼类，广泛分布于渤海、黄海、东海，日本及朝鲜半岛海域，为太平洋西北沿海特有物种。自20世纪90年代以来，经过近20多年的发展，我国花鲈养殖产量达到9万多吨，位列海水养殖鱼类之首。但是花鲈养殖业也面临着空前的挑战,主要问题有:种质退化、病害增多、养殖成本上升等。花鲈种质质量最好的野生花鲈种群数量锐减，亲鱼繁殖性能不断退化，花鲈遗传育种与繁殖等基础研究薄弱，关键技术未得到应有的重视，严重影响了花鲈养殖业可持续发展。
[0003]现阶段花 鲈的自然繁育由于雌雄个体产生配子时间短，雌雄亲鱼性成熟不同步，可能导致无法受精；人工繁育所需要的精液采用人工腹部挤压法取得，花鲈精液在离开精巢后，由于没有采取任何处理措施，使得花鲈精液的活力下降快，不能长时间保存，无法进行长距离运输，受时间和空间地域的限制，精子质量会随着累代积累下降，优良基因会因杂交而丧失。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于解决上述现有技术存在的缺陷，提供一种花鲈精液的处理方法。
[0005]一种花鲈精液的处理方法，包括以下步骤:
[0006]( I)将花鲈精液与抗冻液按体积比1:3比例稀释混匀；
[0007]( 2 )预冷处理，将稀释后的混合液在4°C预冷3分钟；
[0008](3)预冷后以分段方式降温处理；
[0009](4)分装保存；
[0010]其中，步骤I中所述抗冻液由稀释液、抗冻剂和添加剂组成；其中，稀释液为NaCl溶液:8.775g/L;抗冻保护剂的浓度为20%;添加剂为牛血清白蛋白:10g/L，葡萄糖:10g/L, 土霉素:lg/L ；
[0011]步骤3中，所述分段方式降温处理包括:首先将预冷处理后的混合液在液氮罐液面以上IOcm停留5分钟，然后在液氮罐液面以上4cm停留5分钟，最后在液氮罐液面以上Icm停留3分钟后直接陷入液氮中长期保存。
[0012]进一步地，如上所述的花鲈精液的处理方法，在步骤4之后，还包括解冻步骤5，即将经液氮处理分装保存的花鲈冻精直接放入37°C水浴解冻50-60秒，期间不断摇动花鲈冻精，然后置于室温至完全融化，而后于自然海水中激活。
[0013]进一步地，如上所述的花鲈精液的处理方法，所述激活包括将解冻后的冻精置入经煮沸消毒并加有5%牛血清白蛋白的自然海水中进行激活。
[0014]进一步地,如上所述所述的花自卢精液的处理方法,在步骤I之前，还包括花S卢精液的获取，包括以下步骤:
[0015](I)选取3-4龄，体重3_4kg的雄性花鲈亲鱼进行麻醉；
[0016](2)按1000U/kg的量肌肉注射HCG ；
[0017](3)三天后采用腹部挤压法获得精液，取活力95%以上的花鲈精液。
[0018]进一步地，如上所述所述的花鲈精液的处理方法，所述抗冻保护剂为二甲亚砜。
[0019]进一步地，如上所述所述的花鲈精液的处理方法，步骤I中将花鲈精液与抗冻液按体积比1:3比例稀释混匀后，封装于冻存管中，所述冻存管为2ml的冻存管。 [0020]进一步地，如上所述所述的花鲈精液的处理方法，所述分段方式降温处理包括采用程序降温仪程序降温。
[0021]本发明提供的花鲈精液的处理方法，通过在花鲈繁殖期将其精液冷冻保存起来，随时随地解冻复温获得活力较高的精液，解决了雄性花鲈亲鱼产精时间短、产精量少的困难，解决了花鲈雌雄个体性成熟不同步的问题，解决了花鲈精子无法长距离、长时间运输的困难；保存的花鲈精子，可以随时随地为异源雌核诱导育种提供材料，有利于花鲈的可持续养殖，有利于花鲈遗传多样性的保护，有利于花鲈品系的选育；在花鲈的繁殖、遗传育种以及种质资源保存中具有重要的 意义。
【具体实施方式】
[0022]为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0023]实施例:
[0024]本发明提供的花鲈精液的处理方法，包括以下步骤:
[0025](I)采集处于繁殖期的3-4龄，体重3_4kg、性腺发育良好的花鲈雄鱼，将雄鱼从养殖池中捞出后麻醉，按1000U/kg肌肉注射HCG，三天后用蒸馏水冲洗生殖孔、擦净，轻轻挤压腹部获得新鲜精液，而后将活力高于95%的精液与抗冻液按体积比1:3比例稀释混匀后加入到2ml的冻存管中；所述抗冻液由稀释液、抗冻剂和添加剂组成；其中，稀释液为NaCl溶液:8.775g/L ;抗冻保护剂(二甲基亚砜)为20% (抗冻保护剂的浓度，V/V) DMSO (二甲基亚讽)；添加剂为，牛血清白蛋白:10g/L,匍萄糖:10g/L, 土霉素:lg/L。
[0026](2)将冻存管置于4°C冰箱中预冷3分钟，而后放入小型金属罐中以分段降温方式处理，即首先在液氮罐液面以上IOcm停留5分钟，然后在液氮罐液面以上4cm停留5分钟，最后在液氮罐液面以上Icm停留3分钟后直接投入到液氮(_196°C)，分装保存；
[0027](3)将经液氮处理分装保存的花鲈冻精进行解冻，将其直接放入37°C水浴解冻50-60秒，期间不断摇动冻存管，然后置于室温至完全融化；
[0028](4)，将解冻后的冻精进行激活，所述激活方式为:先在载玻片上滴一滴经煮沸消毒并加有5%BSA自然海水，然后用移液枪加入1-2 μ L冻精，吸打3-5次使其充分混匀。
[0029]本实施例将激活后的冻精在载玻片上随即取3个视野，采用计算机辅助精子分析系统计算统计运动率，经检测解冻后精子运动率为90.87±2.25%，与鲜精差异不显著(P< 0.05)。
[0030]本发明的有益效果:
[0031]1.本发明采用20% (V/V) 二甲亚砜为抗冻保护剂，保持较好渗透性的同时又降低了毒性；
[0032]2.本发明抗冻液中加入了牛血清白蛋白，对精子的质膜起到很好的保护作用；
[0033]3.本发明抗冻液中加入了适量的葡萄糖，其非渗透性保护作用提高了花鲈精子的抗冻能力；
[0034]4.本发明降温前鲜精与抗冻液混匀，4°C冰箱中预冷3分钟后直接放入液氮罐中直接进行分段降温，节省了时间，操作简便易行；
[0035]5.本发明分段降温时，采用以液氮面以上IOcm预冷，使冷冻精子安全度过“危险温度区”，然后液氮面以上4cm的降温速率快速进入稳定状态，最后液氮面以上停留较短时间后直接浸入液氮中，整个降温过程时间短，实用性强；
[0036]6.本发明冷冻 精子从液氮中取出后，采用二步解冻法，37°C和20°C两步解冻，可使精子快速度过重结晶区，同时又避免了局部温度过高导致的损伤；
[0037]7.本发明降温设备仅需一个液氮罐，设备简单，易于操作，冻精解冻后复苏率高，激活后运动率高于90%，与鲜精活性基本相同。
[0038]8.本发明在抗冻液中加入了 lg/L的土霉素，对抗冻液中的有害微生物起到明显的抑制作用；
[0039]9.本发明降温前花鲈精液与抗冻液混匀，4°C平衡3分钟，既能保证抗冻保护剂充分渗入到花鲈精子内部，又不会因抗冻保护剂本身的毒性作用对胚胎造成过大的损害；
[0040]10.本发明采用添加5%BSA的消毒海水激活花鲈精液，有效的防止解冻后花鲈精子鞭毛相互黏连。
[0041]最后应说明的是:以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。
【权利要求】
1.一种花鲈精液的处理方法，其特征在于:包括以下步骤: (1)将花鲈精液与抗冻液按体积比1:3比例稀释混匀； (2)预冷处理，将稀释后的混合液在4°C预冷3分钟； (3)预冷后以分段方式降温处理； (4)分装保存； 其中，步骤I中所述抗冻液由稀释液、抗冻剂和添加剂组成；其中，稀释液为NaCl溶液:8.775g/L ;抗冻保护剂的浓度为20% ;添加剂为牛血清白蛋白:10g/L，葡萄糖:10g/L，土霉素:lg/L ； 步骤3中，所述分段方式降温处理包括:首先将预冷处理后的混合液在液氮罐液面以上IOcm停留5分钟，然后在液氮罐液面以上4cm停留5分钟，最后在液氮罐液面以上Icm停留3分钟后直接陷入液氮中长期保存。
2.根据权利要求1所述的花鲈精液的处理方法，其特征在于:在步骤4之后，还包括解冻步骤5，即将经液氮处理分装保存的花鲈冻精直接放入37°C水浴解冻50-60秒，期间不断摇动花鲈冻精，然后置于室温至完全融化，而后于自然海水中激活。
3.根据权利要求2所述的花鲈精液的处理方法，其特征在于:所述激活包括将解冻后的冻精置入经煮沸消毒并加有5%牛血清白蛋白的自然海水中进行激活。
4.根据权利要求1 所述的花鲈精液的处理方法，其特征在于:在步骤I之前，还包括花鲈精液的获取，包括以下步骤: (1)选取3-4龄，体重3-4kg的雄性花鲈亲鱼进行麻醉； (2)按1000U/kg的量肌肉注射HCG； (3)三天后采用腹部挤压法获得精液，取活力95%以上的花鲈精液。
5.根据权利要求1-5任一所述的花鲈精液的处理方法，其特征在于:所述抗冻保护剂为二甲亚砜。
6.根据权利要求1-5任一所述的花鲈精液的处理方法，其特征在于:步骤I中将花鲈精液与抗冻液按体积比1:3比例稀释混匀后，封装于冻存管中，所述冻存管为2ml的冻存管。
7.根据权利要求1-5任一所述的花鲈精液的处理方法，其特征在于:所述分段方式降温处理包括采用程序降温仪程序降温。
【文档编号】A01N1/02GK103891711SQ201410115175
【公开日】2014年7月2日 申请日期:2014年3月26日 优先权日:2014年3月26日
【发明者】温海深, 张美昭, 柴森浩, 韩龙江 申请人:中国海洋大学