甜樱桃品种晚红珠的离体再生方法
【专利摘要】本发明公开了一种甜樱桃品种晚红珠的离体再生方法，步骤为：1、外植体灭菌，取晚红珠品种甜樱桃树在生长季的嫩梢作为外植体；利用大蒜水溶液灭菌；2、初代培养，在初代培养基上培养，培养条件22～25℃，光照2500～3000LX，光周期12h/d；3、继代培养，培养至茎段增殖系数达5～8；4、生根培养，培养至生根条数为11～15条；5、驯化和移栽：移栽在适宜壤土中栽培。本发明建立的甜樱桃优质品种晚红珠离体再生体系稳定性好；组织培养繁殖系数较大，繁殖速度快；灭菌率高；灭菌成本低且环境友好。
【专利说明】甜樱桃品种晚红珠的离体再生方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及樱桃的栽培技术，更具体地说，涉及甜樱桃的离体再生方法。
【背景技术】
[0002]甜樱桃组织培养技术逐渐得到甜樱桃栽培领域专家学者以及广大甜樱桃栽植者的广泛重视和关注。甜樱桃组织培养技术的应用和发展现状有以下方面:
[0003]1.可用于甜樱桃苗木的快速繁殖。采用组织培养技术繁育甜樱桃苗木，年繁育苗木数可以用公式表示为:Y = mX xn。其中，Y为年繁殖数，m为无菌母株数，x为每个培养周期增殖的倍数，η为全年可增殖的周期次数。由此可以看出，苗木繁殖速度是以几何级数增殖的，因此采用组织培养技术能够实现甜樱桃苗木快速繁殖。
[0004]2.在甜樱桃离体再生体系建立的基础上，可进一步进行甜樱桃苗木脱毒，生产无病毒甜樱桃苗木。离体培养技术是关键，在此基础上，结合热处理即可培育出脱病毒的甜樱桃植株。
[0005]3.用于遗传育种，培育远缘杂种。将甜樱桃组织培养技术与常规远缘杂交技术相结合，对远缘杂交形成的幼胚进行离体组织培养，使之在离体的条件下形成完整的试管植株，就可能培育出优良的甜樱桃远缘杂交新品种。
[0006]4.缩短育种时间。通过组织培养技术，对甜樱桃的花粉、花药、未受精的子房以及胚珠进行培养，得到单倍体植株以后，再采用染色体人工加倍的方法使其恢复成为二倍体植株，从而培育成为新的甜樱桃品种。这种方法大大缩短了育种周期，简化了育种程序，提高了育种效率
[0007]5.种质资源保存。采用组织培养技术保存试管苗可以大大地节省空间，一个
0.28m3的普通电冰箱可存放2000只试管，试管中放入甜樱桃种质资源，多个普通冰箱的联合使用，在低温条件下就可实现种质资源的长期保存。
[0008]6.组织培养技术是甜樱桃基因工程的平台。转基因获得的甜樱桃外植体，必须在组织培养技术才能再生为甜樱桃完整的植株。
【发明内容】
[0009]本发明以现代植物组织培养技术为基础，建立一个具有体系稳定、繁殖速度快、成本低、环境友好等优点的甜樱桃优良品种晚红珠离体再生体系，为优良品种晚红珠乃至甜樱桃的快速繁殖、苗木脱毒、培育远缘杂种、缩短育种时间、培育体细胞杂种、种质资源保存、基因工程以及病理学、生理学及其它理论研究奠定基础。本发明以休眠季的叶芽和生长季的嫩梢为外植体，成功地建立起甜樱桃优良品种晚红珠离体再生技术体系。
[0010]为了达到上述目的，本发明一种甜樱桃品种晚红珠的离体再生方法，包括如下步骤:
[0011]S1、外植体灭菌:取晚红珠品种甜樱桃树在生长季的嫩梢作为外植体；所述嫩梢为2~3cm长顶端嫩梢，直接放入大蒜水溶液浸泡，取出后用无菌单蒸水冲洗3次，最后用无菌滤纸吸干水分；
[0012]S2、初代培养:将所述外植体接种到初代培养基上；所述初代培养基为:MS+6_苄基腺嘌呤0.2~0.5mg/L+ Π引哚丁酸0.01~0.05mg/L+琼脂5~7g/L+鹿糖20~30g/L,ρΗ5.6~5.8 ;培养室条件是22~25°C，光照强度2500~3000LX，光周期12h/d ；
[0013]S3、继代培养:所述外植体经初代培养后，剪成单芽茎段接种到继代培养基上；所述继代培养基为:MS+6-苄基腺嘌呤0.5~1.0mg/L+吲哚丁酸0.05~0.2mg/L,附加琼脂5~7g/L，蔗糖20~30g/L ;培养至茎段增殖系数可达5~8 ;
[0014]S4、生根培养:在生根培养基中培养，所述生根培养基为:MS+6_苄基腺嘌呤
0.05~0.2mg/L+吲哚丁酸0.1~0.5mg/L,附加琼脂5~7g/L，蔗糖20~30g/L ;培养至生根条数为11~15条；
[0015]S5、驯化和移栽:移栽在适宜基质土壤中栽培。
[0016]优选方式下，步骤S5所述基质土壤为珍珠岩或沙土或蛭石或腐殖土。此外，步骤SI中所述大蒜水溶液的制配方法为:去皮大蒜捣成浆加无菌单蒸水搅拌2min，其中，按重量/体积比大蒜:无菌单蒸水为1:1，然后室温下放置30min，备用。步骤S2中所述初代培养基为:MS+6-苄基腺嘌呤0.3mg/L+IBA0.04mg/L+琼脂7g/L+蔗糖30g/L，pH5.8 ;培养室条件是23°C，光照强度2500LX，光周期12h/d ;步骤S3中所述继代培养基为:MS+6_苄基腺嘌呤1.0mg/L+吲哚丁酸0.lmg/L,附加琼脂7g/L，蔗糖30g/L，茎段增殖系数为8 ;步骤S4中所述生根培养基为:MS+6-苄基腺嘌呤0.lmg/L+吲哚丁酸0.5mg/L,附加琼脂7g/L,蔗糖30g/L，生根条数为15条。 [0017]本发明优点:
[0018]1.所用甜樱桃品种晚红珠为大连市农业科学研究院培育的优质甜樱桃新品种，资源新颖，也可选用其他品种的晚红珠。
[0019]2.本发明建立的甜樱桃优质品种晚红珠离体再生体系稳定性好；
[0020]3.组织培养繁殖系数较大；
[0021]4.本发明采用大蒜水溶液作为外植体灭菌剂，灭菌率可达到100% ；
[0022]5.与传统的外植体灭菌方法相比无毒副作用，属于环境友好型灭菌剂；
[0023]6.叶芽灭菌时不用剥除鳞片，而将其直接放入到大蒜水溶液中，故操作更简便、节省时间。
[0024]本发明建立的甜樱桃优质品种晚红珠离体再生体系稳定性好；组织培养繁殖系数较大，繁殖速度快；灭菌率高；灭菌成本低且环境友好。
[0025]此外，嫩梢作为外植体，由于抗外界环境干扰的能力较差，因此，现有技术的灭菌溶液对其伤害较大，因此限制了嫩梢作为外植体使用的可能。为此，本发明利用大蒜配置的水溶液作为灭菌溶液，具体以去皮大蒜捣成泥，与无菌单蒸水按重量体积比配置成1:1的溶液。该灭菌溶液温和，适用于植物嫩梢作为外植体的灭菌，不伤害外植体。此处，所述嫩梢为植物生长季自植物茎顶偏下2~3cm(优选)长的一段新梢或枝条。
【具体实施方式】
[0026]本发明以甜樱桃优质品种晚红珠为对象，基于植物细胞全能性的基本原理，在适宜的培养条件下，再生成完整植株。具体工艺流程:[0027]1、外植体的灭菌:取休眠季的叶芽和生长季的嫩梢作为外植体,使用大蒜水溶液进行灭菌处理。
[0028]2、初代培养:将灭菌后的外植体进行初代培养，并进行培养基的筛选，确定最佳初
代培养基。
[0029]3、继代培养:在初代培养的基础上，进行继代培养，并进行培养基的筛选，确定最佳继代培养基。
[0030]4、生根培养:在继代培养的基础上，进行生根培养，并进行培养基的筛选，确定最佳生根培养基。
[0031]5、驯化与移栽:筛选适宜的驯化移栽基质及条件。
[0032]实施例1
[0033]1、外植体灭菌:一种外植体是休眠季的叶芽。具体做法:冬末时，取甜樱桃品种晚红珠一年生叶芽枝，在室内自来水冲洗lh，洗去表面浮尘。取叶芽枝剪成具有一个叶芽的茎段，然后在无菌操作条件下进行外植体灭菌，将具有一个叶芽的茎段放在500mL的烧杯内。用2:l(ff/V)大蒜水溶液(大蒜:无菌单蒸水为2:1，去皮大蒜捣成浆加无菌单蒸水搅拌2分钟，然后室温下放置30min后，备用)浸泡30min，取出后用无菌单蒸水冲洗3次，用解剖刀切下叶芽放在无菌滤纸上吸干水分，然后接种到初代培养基上。
[0034]另一种外植体是生长季的嫩梢。具体做法:取2~3cm长顶端嫩梢，直接放入到1:1 (W/ν)大蒜水溶液(大蒜:无菌单蒸水为1:1，去皮大蒜捣成浆加无菌单蒸水搅拌2min，然后室温下放置30min后,备用)浸泡30min,取出后用无菌单蒸水冲洗3次,最后用无菌滤纸吸干水分。
[0035]外植体的无菌率均为100%。
[0036]2.初代培养:
[0037]将上述灭菌后的外植体接种到初代培养基上。初代培养适宜的培养基为:
[0038]MS+6-苄基腺嘌呤 0.2 ~0.5mg/L+ 吲哚丁酸 0.01 ~0.05mg/L+ 琼脂 5 ~7g/L+鹿糖 20 ~30g/L, pH5.6 ~5.8。
[0039]初代培养的结果分两种情况，一种是外植体是休眠季的叶芽时，初代培养的萌芽率可达85~95%。另一种是外植体是生长季的嫩梢时,生长率可达90~98%。
[0040]培养室条件是22~25°C，光照强度2500~3000LX，光周期12h/d。
[0041]3.继代培养:
[0042]外植体经初代培养，剪成单芽茎段接种到继代培养基上。适宜的继代培养基为:MS+6-苄基腺嘌呤0.5~1.0mg/L+吲哚丁酸0.05~0.2mg/L,附加琼脂5~7g/L，蔗糖20~30g/L，茎段增殖系数可达5~8。
[0043]4.生根培养:
[0044]适宜的培养基为:MS+6-苄基腺嘌呤0.05~0.2mg/L+吲哚丁酸0.1~0.5mg/L,附加琼脂5~7g/L，蔗糖20~30g/L。生根率可达到90~100%，生根条数为11~15条。
[0045]5.驯化和移栽:在驯化过程中，珍珠岩或沙土或蛭石或腐殖土上的存活率均达到100% ;移栽在中性壤土中，成活率达90%~95%。
[0046]实施例2
[0047]1.外植体灭菌:一种外植体是休眠季的叶芽。具体做法:冬末时，取甜樱桃品种晚红珠一年生叶芽枝，在室内自来水冲洗lh，洗去表面浮尘。取叶芽枝剪成具有一个叶芽的茎段，然后在无菌操作条件下进行外植体灭菌，将具有一个叶芽的茎段放在500mL的烧杯内。用2:l(ff/V)大蒜水溶液(大蒜:无菌单蒸水为2:1，去皮大蒜捣成浆加无菌单蒸水搅拌2分钟，然后室温下放置30min后，备用)浸泡30min，取出后用无菌单蒸水冲洗3次，用解剖刀切下叶芽放在无菌滤纸上吸干水分，然后接种到初代培养基上。
[0048]另一种外植体是生长季的嫩梢。具体做法:取2~3cm长顶端嫩梢，直接放入到1:1 (W/ν)大蒜水溶液(大蒜:无菌单蒸水为1:1，去皮大蒜捣成浆加无菌单蒸水搅拌2min，然后室温下放置30min后,备用)浸泡30min,取出后用无菌单蒸水冲洗3次,最后用无菌滤纸吸干水分。
[0049]外植体的无菌率均为100%。
[0050]2.初代培养:
[0051 ] 初代培养的培养基为:MS+6-苄基腺嘌呤0.3mg/L+IBA0.04mg/L+琼脂7g/L+蔗糖30g/L, pH5.8。
[0052]初代培养的结果分两种情况，一种是外植体为休眠季的叶芽时，初代培养的萌芽率可达95 %。另一种是外植体为生长季的嫩梢时,生长率可达98 %。
[0053]培养室条件是23°C，光照强度2500LX，光周期12h/d。 [0054]3.继代培养:外植体经初代培养，剪成单芽茎段接种到继代培养基上。
[0055]继代培养的培养基为:MS+6-苄基腺嘌呤1.0mg/L+吲哚丁酸0.lmg/L,附加琼脂7g/L，蔗糖30g/L，茎段增殖系数为8。
[0056]4.生根培养:
[0057]生根培养的培养基为:MS+6_苄基腺嘌呤0.lmg/L+吲哚丁酸0.5mg/L,附加琼脂7g/L，蔗糖30g/L，生根率达到100%，生根条数为15条。
[0058]5.驯化和移栽:在驯化过程中，珍珠岩上的存活率达到100%。移栽在中性壤土上，成活率93%。
[0059]实施例3
[0060]1.外植体处理和初代培养:一种外植体是休眠季的叶芽。具体做法:冬末时，取甜樱桃品种晚红珠一年生叶芽枝，在室内自来水冲洗lh，洗去表面浮尘。取叶芽枝剪成具有一个叶芽的茎段，然后在无菌操作条件下进行外植体灭菌，将具有一个叶芽的茎段放在500mL的烧杯内。用2:l(ff/V)大蒜水溶液(大蒜:无菌单蒸水为2:1，去皮大蒜捣成浆加无菌单蒸水搅拌2分钟，然后室温下放置30分钟后，备用)浸泡30min，取出后用无菌单蒸水冲洗3次，用解剖刀切下叶芽放在无菌滤纸上吸干水分，然后接种到初代培养基上。
[0061]另一种外植体是生长季的嫩梢。具体做法:取2~3cm长顶端嫩梢，直接放入到1:1(W/ν)大蒜水溶液(大蒜:无菌单蒸水为1:1，去皮大蒜捣成浆加无菌单蒸水搅拌2min，然后室温下放置30min后,备用)浸泡30min,取出后用无菌单蒸水冲洗3次,最后用无菌滤纸吸干水分，接种到初代培养基上。
[0062]培养室条件是22°C，光照强度2500LX，光周期12h/d.。初代培养适宜的培养基为:MS+6-BA0.2mg/L+IBA0.05mg/L+ 琼脂 7g/L+ 蔗糖 30g/L，ρΗ5.8。
[0063]初代培养的结果分两种情况，一种是外植体是休眠季的叶芽时，外植体的无菌率为100%，初代培养的萌芽率可达90 %。另一种是外植体是生长季的嫩梢时，所接种的嫩梢无菌率为100%，生长率为95%。
[0064]2.继代培养:外植体经初代培养，剪成单芽茎段接种到继代培养基上，以MS基本培养基+6-苄基腺嘌呤0.5mg/L+吲哚丁酸0.lmg/L,附加琼脂7g/L,蔗糖30g/L，茎段增殖系数为最大，平均为5.6。
[0065]3.生根培养:以MS基本培养基+6-苄基腺嘌呤0.lmg/L+吲哚丁酸0.lmg/L,附加琼脂7g/L，蔗糖30g/L，生根最好，生根率达到100%，生根条数平均为12.5条。
[0066]4.驯化和移栽:在驯化过程中，珍珠岩和沙土上的存活率均达到100%。移栽在中性壤土中，成活率90.45%。
[0067] 以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本【技术领域】的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种甜樱桃品种晚红珠的离体再生方法，其特征在于，包括如下步骤: .51、外植体灭菌:取晚红珠品种甜樱桃树在生长季的嫩梢作为外植体；所述嫩梢为2~.3cm长顶端嫩梢，直接放入大蒜水溶液浸泡，取出后用无菌单蒸水冲洗3次，最后用无菌滤纸吸干水分； . 52、初代培养:将所述外植体接种到初代培养基上；所述初代培养基为:MS+6-苄基腺嘿呤0.2~0.5mg/L+ Π引噪丁酸0.01~0.05mg/L+琼月旨5~7g/L+鹿糖20~30g/L, pH5.6~.5.8 ;培养室条件是22~25°C，光照强度2500~3000LX，光周期12h/d ； 53、继代培养:所述外植体经初代培养后，剪成单芽茎段接种到继代培养基上；所述继代培养基为:MS+6-苄基腺嘌呤0.5~1.0mg/L+吲哚丁酸0.05~0.2mg/L,附加琼脂5~.7g/L，蔗糖20~30g/L ;培养至茎段增殖系数达5~8 ; .54、生根培养:在生根培养基中培养，所述生根培养基为:MS+6-苄基腺嘌呤0.05~.0.2mg/L+吲哚丁酸0.1~0.5mg/L,附加琼脂5~7g/L,鹿糖20~30g/L ;培养至生根条数为11~15条； .55、驯化和移栽:移栽在土壤中栽培。
2.根据权利要求1所述甜樱桃品种晚红珠的离体再生方法，其特征在于，步骤S5所述土壤为珍珠岩或沙土或蛭石或腐殖土。
3.根据权利要求1所述甜樱桃品种晚红珠的离体再生方法，其特征在于，SI中所述大蒜水溶液的制配方法为:去皮大蒜捣成浆加无菌单蒸水搅拌2min，其中，按重量/体积比大蒜:无菌单蒸水为1:1 ，，然后室温下放置30min，备用。
4.根据权利要求1所述甜樱桃品种晚红珠的离体再生方法，其特征在于， .52、所述初代培养基为:MS+6-苄基腺嘌呤0.3mg/L+IBA0.04mg/L+琼脂7g/L+蔗糖.30g/L，pH5.8 ;培养室条件是23°C，光照强度2500LX，光周期12h/d ； .53、所述继代培养基为:MS+6-苄基腺嘌呤1.0mg/L+吲哚丁酸0.lmg/L,附加琼脂7g/L，蔗糖30g/L，茎段增殖系数为8 ； . 54、所述生根培养基为:MS+6-苄基腺嘌呤0.lmg/L+吲哚丁酸0.5mg/L,附加琼脂7g/L,蔗糖30g/L，生根条数为15条。
【文档编号】A01H4/00GK104012406SQ201410137151
【公开日】2014年9月3日 申请日期:2014年4月4日 优先权日:2014年4月4日
【发明者】侯义龙, 于亚军, 张立娟, 倪天泽 申请人:大连大学