一种环境友好型外植体灭菌方法及灭菌溶液的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种环境友好型外植体灭菌溶液，即大蒜配置的水溶液，以去皮大蒜捣成泥，与无菌单蒸水按重量体积比配置成1～9:1的溶液。本发明还提供了基于上述灭菌溶液的环境友好型外植体灭菌方法，将植物外植体浸入基于大蒜配置的水溶液中灭菌。本发明所使用的外植体灭菌新方法——大蒜水溶液法，对所处理的植物表现温和，灭菌率高，可达100%，灭菌效果稳定，操作简单，成本低，对环境友好。
【专利说明】一种环境友好型外植体灭菌方法及灭菌溶液
【技术领域】
[0001]本发明涉及植物外植体的灭菌，更具体地说，涉及灭菌方法及灭菌溶液的改进。
【背景技术】
[0002]外植体灭菌是植物组织培养能够成功的一个重要环节。传统上，植物组织培养时，常用的外植体灭菌方法是:外植体在70%或75%乙醇中浸泡不超过30s，然后再用次氯酸钠(NaOCl)或次氯酸|丐[Ca(OCl)2]或升萊(氯化萊，HgCI2)进一步杀菌,才能收到较好的外植体灭菌效果。升汞的常用浓度0.1%，处理时间10~15min，杀菌效果好，但残毒高。消毒后需用无菌水冲洗3~5次；次氯酸钠和次氯酸钙常用浓度可为0.5%~10%，杀菌时间5~30min，杀菌效果比较好，对植物无害；但次氯酸钠和次氯酸钙或多或少具有一定的毒性。上述化学试剂成本较高。[0003]现有技术中，本领域技术人员大多选用休眠期的枝条作为外植体，而不选用生长季的新梢。因为现有技术的灭菌溶剂对植物嫩梢损害较大，嫩梢无法存活。因此本领域技术人员不会选用嫩梢做外植体。此处，所述嫩梢为植物生长季自植物茎顶偏下5~IOcm长的一段新梢或枝条，因此作为新梢前端的部分的嫩梢，如果需要用作外植体，需要选择温和的灭菌溶剂。
【发明内容】
[0004]本发明提供了一种成本低的外植体灭菌溶液——大蒜溶液,并提供了使用大蒜溶液杀菌的方法。应用大蒜的杀菌作用，使其成为植物组织培养时外植体灭菌的新的、有效的且稳定方法，不伤害外植体。以实现外植体灭菌试剂的无毒化，并达到了保护生态环境的效果，尤其适用于生长季的新梢作为外植体使用。
[0005]为了达到上述目的，本发明提供一种环境友好型外植体灭菌溶液，利用大蒜配置的水溶液。
[0006]配置方法多样，如大蒜烘干、粉碎、添水配置的方法,再比如大蒜切碎、水中浸泡的方法。本发明提供的一种优选方式为:以去皮大蒜捣成泥，与无菌单蒸水按重量体积比配置成I~9:1的溶液。
[0007]本发明还提供了基于上述灭菌溶液的环境友好型外植体灭菌方法，将植物外植体浸入基于大蒜配置的水溶液中。此外，优选方式下，外植体先在自来水下冲洗I小时。
[0008]本发明所使用的外植体灭菌新方法一大蒜水溶液法，对所处理的植物表现温和，灭菌率较高，可达100%，灭菌效果稳定，操作简单，成本低，对环境友好。具体说，本发明优点如下:
[0009]1.用大蒜水溶液取代传统的植物组织培养时外植体灭菌的试剂(如乙醇、次氯酸钠、次氯酸钙、氯化汞等)，实现了外植体灭菌的无毒性，是一种环境友好型的植物组织培养外植体灭菌剂。
[0010]2.该种外植体灭菌剂用于甜樱桃、桃、月季等的休眠季叶芽的灭菌时，无菌率达到100% O
[0011]3.该种外植体灭菌剂用于甜樱桃、桃、月季等的生长季的嫩梢的灭菌时，无菌率达到 100%O
[0012]4.与传统的外植体灭菌剂相比，灭菌成本降低.在生长季，大蒜水溶液的灭菌成本是传统灭菌剂(70%乙醇+次氯酸钠)的8.7% ;在休眠季，大蒜水溶液的灭菌成本是传统灭菌剂(70%乙醇+次氯酸钠)的17.4%。
[0013]5.操作更加简单。可以将准备灭菌的外植体用自来水冲洗Ih后，直接浸泡在大蒜水溶液中，而不需要其它前处理，如去鳞片等。
[0014]此外，嫩梢作为外植体，由于抗外界环境干扰的能力较差，因此，现有技术的灭菌溶液对其伤害较大，因此限制了嫩梢作为外植体使用的可能。为此，本发明提供了一种新型的灭菌溶液——利用大蒜配置的水溶液。具体以去皮大蒜捣成泥，与无菌单蒸水按重量体积比配置成I~9:1的溶液。该灭菌溶液温和，适用于植物嫩梢作为外植体的灭菌。此处，所述嫩梢为植物生长季自植物茎顶偏下5~IOcm长的一段新梢或枝条。
【具体实施方式】[0015]本发明基于大蒜中大蒜素和大蒜油的杀菌原理，以休眠季的叶芽以及生长季的嫩梢作为外植体进行大蒜水溶液灭菌效果的研究。分别在冬末时，取甜樱桃、桃、月季的叶芽作为外植体，进行大蒜水溶液灭菌处理，观察、统计叶芽的无菌率，以及在生长季，取甜樱桃、桃、月季的嫩梢作为外植体，进行大蒜水溶液灭菌处理，观察、统计嫩梢的无菌率。
[0016]具体工艺流程:
[0017]1、取不同时期的外植体；
[0018]2、浸泡在大蒜水溶液中；
[0019]3、接种在适宜的培养基上；
[0020]4、研究灭菌效果。
[0021]实施例1:大蒜:无菌单蒸水为2:1 (W/V),去皮大蒜捣成浆加无菌单蒸水搅拌2min,然后室温下放置30min后,过滤后备用。
[0022]实施例2:大蒜:无菌单蒸水为1:1 (W/V),去皮大蒜捣成浆加无菌单蒸水搅拌2min,然后室温下放置30min后,过滤后备用。
[0023]实施例3:大蒜:无菌单蒸水为1:3 (W/V),去皮大蒜捣成浆加无菌单蒸水搅拌2min,然后室温下放置30min后,过滤后备用。
[0024]上述大蒜溶液的使用方式为:
[0025]在冬末，取甜樱桃、桃、月季的叶芽作为外植体，将其带回室内，自来水冲洗lh。在无菌操作条件下进行外植体灭菌，将甜樱桃、桃、月季的叶芽分别放入到实施例1、实施例2的大蒜水溶液。中浸泡30min，取出后用无菌单蒸水冲洗3次，用无菌滤纸吸干水分，接种到初代培养基(培养基配方为:MS+6-BA0.2mg/L+IBA0.05mg/L+琼脂7g/L+蔗糖30g/L，pH5.8)上。
[0026]在生长季，取甜樱桃、桃、月季2~3cm长顶端嫩梢，分别直接放入到实施例1、实施例2的大蒜水溶液浸泡30min，取出后用无菌单蒸水冲洗3次，最后用无菌滤纸吸干水分，接种到初代培养基(培养基配方为:MS+6-BA0.2mg/L+IBA0.05mg/L+琼脂7g/L+蔗糖30g/L，ρΗ5.8)上。
[0027]3.观察并统计叶芽的萌芽率、嫩梢的平均无菌率(灭菌率可达100%)。
[0028]4.在初代培养的基础上，继续进行继代培养、生根培养以及驯化移栽等。
[0029]其中，对于不同浓度的大蒜溶液，根据具体植物的种类，适度调节浸泡时间，如实施例3的溶液，需适当延长浸泡时间。
[0030]通过上述实施例，分别以休眠季的叶芽和生长季的嫩梢为外植体，成功地建立起甜樱桃、桃、月季等植物组织培养接种前外植体灭菌技术体系，效果稳定。
[0031]此外，采用3:1大蒜水溶液对下列植物外植体进行灭菌处理，效果:污染体均为0，即灭菌效果为100%。这些植物外植体有:桃树、樱桃树、杏树、李树、月季、蓝莓、树莓、葡萄、毛白杨、意大利杨、国槐、龙爪槐、苹果、蝴蝶兰休眠期叶芽(灭菌30分钟)和生长期嫩梢(灭菌20分钟)。
[0032]针对不同的外植体，灭菌的时间是不同的，对于休眠期的叶芽，灭菌时间比生长季的嫩梢要稍长一些，因为不同的植物抗杀伤能力也不同，同一种植物休眠期的叶芽抗杀伤
能力更强一些。
[0033]以上所述，仅为本发明较佳的【具体实施方式】，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领 域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种环境友好型外植体灭菌溶液，其特征在于，利用大蒜配置的水溶液。
2.根据权利要求1所述环境友好型外植体灭菌溶液，其特征在于，以去皮大蒜捣成泥，与无菌单蒸水按重量体积比配置成I~9:1的溶液。
3.一种基于上述灭菌溶液的环境友好型外植体灭菌方法，其特征在于，将植物外植体浸入基于大蒜配置的水溶液中灭菌。
4.根据权利要求3所述基于上述灭菌溶液的环境友好型外植体灭菌方法，其特征在于，所述灭菌溶液为:去皮大蒜捣成泥，与无菌单蒸水按重量体积比配置成I~9:1的溶液。
【文档编号】A01P1/00GK103918553SQ201410137112
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年4月4日 优先权日:2014年4月4日
【发明者】侯义龙, 于亚军, 张立娟, 倪天泽 申请人:大连大学