利用单性游孢子进行裙带菜杂交育种的方法
【专利摘要】本发明涉及裙带菜杂交育种的方法，具体的说是一种利用单性游孢子进行裙带菜杂交育种的方法。将雌配子体进行孤雌生殖诱导产生孢子体，同时，将雌雄同体的配子体进行发育培养产生自交孢子体。当孢子体达到1mm以上时，转入充气培养条件下，培养至性成熟。将成熟的孢子叶置于海水中进行游孢子释放，待海水颜色变为黄褐色后，将游孢子附着在苗帘上，而后将苗帘置于新鲜海水中。孤雌生殖产生的孢子体释放的游孢子全部为雌性游孢子，而雌雄同体的配子体自交产生的孢子体释放的游孢子全部为雄性游孢子。本发明通过雌雄游孢子杂交技术改良雌雄配子体杂交技术，对于单克隆杂交育种大规模应用于生产实践具有重要意义。
【专利说明】利用单性游孢子进行裙带菜杂交育种的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及裙带菜杂交育种的方法，具体的说是一种利用单性游孢子进行裙带菜 杂交育种的方法。
【背景技术】
[0002] 裙带菜种苗培育有游孢子采苗和配子体采苗两种途径，目前大规模育苗生产中以 前者为主，后者只起辅助作用。配子体克隆杂交育种的优点在于能够产生性状高度一致的 孢子体后代，而传统的游孢子育种则会出现孢子体后代性状的分化。但是配子体采苗的主 要缺点是，配子体克隆接种到苗帘之后，只是靠藻体分泌的粘性物质附着在苗绳上，其牢固 度非常差。而且幼孢子体在假根形成之前，依赖雌配子体附着在苗绳上。因此，这种松散的 附着强度造成出苗以后在海上暂养时脱苗情况非常严重。相比之下，游孢子对基质的附着 强度要高得多。此外，采用配子体育苗，在数量上无法短时间满足生产需求，需要耗费大量 的时间、人力和财力进行配子体的培养扩增，而游孢子释放量大，不存在这一弊端。因此，采 用单一性状的雌性游孢子和雄性游孢子杂交既能得到性状一致的孢子体后代，又能解决配 子体克隆育苗成本高昂，附苗率低，脱苗严重的问题，将会对裙带菜大规模育苗生产产生积 极的推动作用。
【发明内容】
[0003] 本发明目的在于提供一种利用单性游孢子进行裙带菜杂交育种的方法。
[0004] 为实现上述目的本发明采用的技术方案为：
[0005] -种利用单性游孢子进行裙带菜杂交育种的方法，
[0006] 1)将雌性配子体进行诱导培养至幼孢子体达到1mm以上转入充气培养条件下，完 成孤雌生殖孢子体的生活史，形成孤雌生殖成熟的孢子体；
[0007] 2)将雌雄同体的配子体进行发育培养，产生自交孢子体，待孢子体长至1mm以上 时，转入充气培养条件下，完成自交孢子体的生活史，形成成熟的自交孢子体；
[0008] 3)将上述两种成熟的孢子体的孢子叶置于海水中释放得到两种单一性别的游孢 子，待释放得到游孢子的海水颜色为黄褐色后，将两种游孢子水混合附着在苗帘上，而后将 苗帘放入新鲜海水中；
[0009] 4)上述附着游孢子的苗帘在光强50-80 μ mol photons m^V1，水温18 - 22°C，光 周期12h白天：12h黑夜条件下培养13-15d，待萌发的游孢子全部发育成配子体并充分生长 后，降低光强至2-10 μ mol photons πΓ2^，延缓配子体的发育使其度过高水温的夏季；
[0010] 5)将附着在苗帘上的雌雄配子体在50-80 μ mol photons m^V1光强下完成发育 和受精过程；待幼孢子体达到200-500 μ m左右，转到海上栽培，实现裙带菜的培育。
[0011] 所述步骤1)和2)将雌性配子体和雌雄同体配子体分别在PES海水培养基中以温 度18-20°C，光照强度50 - 80μπι〇1 photons πΓΥ1，光周期12h白天：12h黑夜，分别静止 培养至幼孢子体达到1mm，并每3-5天更换一次培养基；
[0012] 分别培养至1mm的幼孢子体在充气培养条件下，以温度18-20°c，光照强度50 - 80 μ mol photons m^V1，光周期12h白天：12h黑夜，培养至幼孢子体长度达到lcm，并每2-3 天更换一次PES海水培养基；
[0013] 培养至1cm的幼孢子体在4-18°C，利用自然海水充入空气翻滚培养，形成性成熟 的孢子体，并每2-3天更新一次自然海水；其中，自然海水中添加终浓度为2. Smgr1的NaN03 和终浓度为〇· 2511^171的ΚΗ2Ρ04。
[0014] 所述PES培养基为每1L消毒海水中添加20mL制备液；制备液为每1L蒸馏水中加 入NaN0 33. 5g、KH2P040. 5g、铁金属液250mL和金属液250mL ;经溶解消毒，冷却待用；铁金属 液为，每1L蒸馈水中加入Fe (NH4)2 (S04)2 · 6H200. 702g和Na2EDTA0. 6g ;金属液为，每1L蒸 馏水中加入 Na2EDTAlg，Η3Β031· 14g，FeCl3 · 6H2049mg，MnS04 · H20164mg，ZnS04 · 7H2022mg 和 C〇S04 · 7Η204· 8mg。
[0015] 所述步骤3)将成熟的孢子体孢子叶割下消毒除杂藻后，阴干30 - 60min，将孢子 叶放入海水中放散得游孢子，待放散得游孢子的海水颜色变为黄褐色后，游孢子放入苗帘， 孢子附着密度控制在120倍放大倍数下60 - 100个附着的游孢子，而后将苗帘放入新鲜海 水中。
[0016] 本发明所具有的优点
[0017] 1.本发明选育的方法是通过孤雌生殖诱导雌性配子体克隆产生的孢子体成熟后， 释放的游孢子全部为雌性游孢子，萌发后形成的雌性配子体与最初的雌性配子体克隆在遗 传上是完全一致的。
[0018] 2.本发明选育方法采用雌雄同体的配子体自交产生的孢子体成熟后，释放的游孢 子全部为雄性游孢子，萌发后形成的雄性配子体与最初的雄性配子体克隆在遗传上是完全 一致的。
[0019] 3.孤雌生殖产生的孢子体和雌雄同体的配子体自交产生的孢子体成熟后，释放的 游孢子及其形成的配子体都可以牢固的附着在苗绳上，其牢固程度可以耐受高压水枪的冲 洗。
[0020] 4.本发明选育方法中游孢子附着到苗帘后，通过双高光技术控制配子体的生长、 度夏和发育过程。
[0021] 5.本发明中孤雌生殖孢子体成熟后释放的游孢子形成的雌性配子体与雌雄同体 配子体自交孢子体成熟后释放的游孢子形成的雄性配子体克隆杂交，产生的子一代孢子体 在遗传上也是高度一致的，类似于配子体克隆单一交配组合后代。
[0022] 6.本发明孤雌生殖产生的游孢子与亲本雌性配子体具有完全一致的遗传背景，因 此可以取代雌配子体进行良种选育和种苗培育。
[0023] 7.本发明雌雄同体配子体自交孢子体产生的游孢子与亲本雄性配子体具有完全 一致的遗传背景，因此可以取代雄配子体进行良种选育和种苗培育。
【具体实施方式】
[0024] 具体为，将雌配子体进行孤雌生殖诱导产生孢子体，同时，将雌雄同体的配子体进 行发育培养产生自交孢子体。当孢子体达到1mm以上时，转入充气培养条件下，培养至性成 熟。将成熟的孢子叶置于海水中进行游孢子释放，待海水颜色变为黄褐色后，将游孢子附着 在苗帘上，而后将苗帘置于新鲜海水中。孤雌生殖产生的孢子体释放的游孢子全部为雌性 游孢子，而雌雄同体的配子体自交产生的孢子体释放的游孢子全部为雄性游孢子。所得雌 性游孢子与雄性游孢子附着在同一苗绳上共同培养，完成发育和受精过程，相当于传统的 游孢子采苗技术。待幼孢子体达到200 μ m左右，转到海上栽培，完成裙带菜的培育。
[0025] 实施例1
[0026] 将雌性配子体和雌雄同体的配子体分别在PES海水培养基中以温度18°C，光照强 度60 μ mol photons m^V1，光周期12h白天：12h黑夜；并每3天更换一次培养基的条件下 静止培养20天后，孢子体达到1mm以上，转到2L烧杯中充入空气，以温度18°C，光照强度 60μηιο1 photons m^V1，光周期12h白天：12h黑夜；并每3天更换一次PES海水培养基的条 件下培养至幼孢子体长度达到lcm ;将长度达到lcm的幼孢子体分别转到80升PP水箱利用 自然海水充入空气翻滚培养（翻滚培养方式请参考Pang，S. J.，Liu，F.，Shan，T. F.，Gao, S. Q. and Zhang, Z. H. 2009. Cultivation of the brown alga Sargassum horneri: sexual reproduction and seedling production in tank culture under reduced solar irradiance in ambient temperature. J.Appl.Phycol. 21:413-22·)，培养幼抱子体的自然 海水中再添加 2. Smgr1的NaN03和0. 2511^171的KH2P04，并每2天更新一次添加添加 2. Smgr1 的NaN03和0. 2511^171的ΚΗ2Ρ04的自然海水，水温的季节变化范围为4-18°C，进而形成孤雌 生殖成熟的孢子体和雌雄同体自交成熟的孢子体。
[0027] 所述PES培养基为每1L消毒海水中添加20mL制备液；制备液为每1L蒸馏水中加 入NaN0 33. 5g、KH2P040. 5g、铁金属液250mL和金属液250mL ;经溶解消毒，冷却待用；铁金属 液为，每1L蒸馈水中加入Fe (NH4)2 (S04)2 · 6H200. 702g和Na2EDTA0. 6g ;金属液为，每1L蒸 馏水中加入 Na2EDTAlg，Η3Β031· 14g，FeCl3 · 6H2049mg，MnS04 · H20164mg，ZnS04 · 7H2022mg 和 C〇S04 · 7Η204· 8mg。
[0028] 待上述孢子体成熟，将孢子叶割下，用消毒纱布反复擦拭孢子叶表面，除去表面附 着的杂藻，阴干30 - 60min，将孢子叶放入海水中放散游孢子，待释放得到游孢子的海水颜 色变为黄褐色后，放入16m长的苗绳，孢子附着密度控制在120倍放大倍数下60 - 100个附 着的游孢子即可，之后将苗绳放入新鲜海水中。在光强50 μ mol photons πΓ2^，水温18 - 22°C，光周期12h白天：12h黑夜条件下培养15d，萌发的游孢子全部发育成配子体并充分生 长，之后降低光强至10 μ mol photons m^V1以下，延缓配子体的发育，使其度过高水温的夏 季。
[0029] 孢子体成熟后，释放的游孢子及其发育形成的配子体都可以牢固的附着在苗绳 上，其牢固程度可以耐受高压水枪的冲洗。
[0030] 游孢子附着到苗帘后，通过双高光技术控制配子体的生长、度夏和发育过程。具 体为，第一高光期光强控制在50μπι 〇1 photons nr2。1，使配子体充分生长，之后降低光强至 10 μ mol photons m^V1以下，延缓配子体的生长，度过夏季高水温。第二高光期光强提高 至50 μ mol photons nT2s4以上，使雌雄配子体同时发育，完成受精。
[0031] 受精形成的幼孢子体达到200 μ m左右，转到裙带菜主栽培区--大连旅顺黄金山 海区，海上暂养10天，然后夹苗，完成海上养成。
[0032] 实施例2
[0033] 若实现大规模生产培育，可将孤雌生殖产生的孢子体和雌雄同体自交产生的孢子
【权利要求】
1. 一种利用单性游孢子进行裙带菜杂交育种的方法，其特征在于： 1) 将雌性配子体进行诱导培养至幼孢子体达到1_以上转入充气培养条件下，完成孤 雌生殖孢子体的生活史，形成孤雌生殖成熟的孢子体； 2) 将雌雄同体的配子体进行发育培养，产生自交孢子体，待孢子体长至1_以上时，转 入充气培养条件下，完成自交孢子体的生活史，形成成熟的自交孢子体； 3) 将上述两种成熟的孢子体的孢子叶置于海水中释放得到两种单一性别的游孢子，待 释放得到游孢子的海水颜色为黄褐色后，将两种游孢子水混合附着在苗帘上，而后将苗帘 放入新鲜海水中； 4) 上述附着游孢子的苗帘在光强50-80 μ mol photons m^V1，水温18 - 22°C，光周期 12h白天：12h黑夜条件下培养13-15d，待萌发的游孢子全部发育成配子体并充分生长后， 降低光强至2-10 μ mol photons πΓ2^，延缓配子体的发育使其度过高水温的夏季； 5) 将附着在苗帘上的雌雄配子体在50-80 μ mol photons nT2s4光强下完成发育和受 精过程；待幼孢子体达到200-500 μ m左右，转到海上栽培，实现裙带菜的培育。
2. 按权利要求1所述的利用单性游孢子进行裙带菜杂交育种的方法，其特征在于： 所述步骤1)和2)将雌性配子体和雌雄同体配子体分别在PES海水培养基中以温度 18_20°C，光照强度50 - 80μηιο1 photons ηι?光周期12h白天：12h黑夜，分别静止培 养至幼孢子体达到1mm，并每3-5天更换一次培养基； 分别培养至1mm的幼孢子体在充气培养条件下，以温度18-20°C，光照强度50 - 80 μ mol photons m^V1，光周期12h白天：12h黑夜，培养至幼孢子体长度达到lcm，并每2-3 天更换一次PES海水培养基； 培养至lcm的幼孢子体在4-18°C，利用自然海水充入空气翻滚培养，形成性成熟的孢 子体，并每2-3天更新一次自然海水；其中，自然海水中添加终浓度为2. Smgr1的NaN03和 终浓度为 〇· 2511^171 的 ΚΗ2Ρ04。
3. 按权利要求1所述的利用单性游孢子进行裙带菜杂交育种的方法，其特征在于： 所述PES培养基为每1L消毒海水中添加20mL制备液；制备液为每1L蒸馏水中加入 NaN033. 5g、KH2P040. 5g、铁金属液250mL和金属液250mL ;经溶解消毒，冷却待用；铁金属液 为，每1L蒸馈水中加入Fe (NH4)2(S04)2 · 6H200. 702g和Na2EDTA0. 6g ;金属液为，每1L蒸馈 水中加入 Na2EDTAlg，Η3Β031· 14g，FeCl3 · 6H2049mg，MnS04 · H20164mg，ZnS04 · 7H2022mg 和 C〇S04 · 7Η204· 8mg。
4. 按权利要求1所述的利用单性游孢子进行裙带菜杂交育种的方法，其特征在于：所 述步骤3)将成熟的孢子体孢子叶割下消毒除杂藻后，阴干30 - 60min，将孢子叶放入海水 中放散得游孢子，待放散得游孢子的海水颜色变为黄褐色后，游孢子放入苗帘，孢子附着密 度控制在120倍放大倍数下60 - 100个附着的游孢子，而后将苗帘放入新鲜海水中。
【文档编号】A01G33/00GK104094832SQ201410305405
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年6月30日 优先权日:2014年6月30日
【发明者】逄少军, 李静, 单体锋 申请人:中国科学院海洋研究所