一种白及种子液体悬浮培养原球茎的方法
【专利摘要】本发明公开了一种白及种子液体悬浮培养原球茎的方法，该方法包括以下步骤：（1）白及种子消毒；（2）悬浮发芽培养：在无菌条件下，用剪刀剪开白及蒴果外壳，将种子抖落在液体发芽培养基中，进行震荡培养30天；（3）悬浮壮苗培养：将经步骤（2）悬浮发芽培养后得到的白及原球茎转接于液体壮苗培养基中，进行震荡培养30-45天。本发明利用液体悬浮培养，能有效获得白及原球茎，操作简单、成本低、且能有效缩短生产周期。
【专利说明】一种白及种子液体悬淳培养原球莲的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种白及种子育苗技术，具体涉及一种采用液体悬浮培养方法对白及 进行原球茎培养的方法。
【背景技术】
[0002] 白及siriaia (Thunb. ) Rchb. f.)为兰科白及属多年生宿根草本植 物，肉质肥厚的假鳞茎供药用；总状花序具数朵花，花紫色或淡红色，花型较大，直径约5厘 米，形态优美，具有很高的药用价值和观赏价值。
[0003] 白及在自然状态下主要靠分株繁殖，繁殖系数较低；虽然能产生大量的种子，但是 种子不易发芽。由于白及繁殖率低，无法适应规模化种植的需求。目前针对白及繁殖的研 究主要集中于种子无菌辅助育苗和组织培养，该技术可以在短时间内得到大量的实生苗， 是白及生产上快速有效的途径。
[0004] 现有对白及组培均选用固体培养基，接种时将白及种子轻轻抖落在培养基的表 面，但是由于白及种子呈粉末状，非常细小，操作时难以保证每个种子都能充分接触培养基 或者种胚基部接触到培养基，造成生长条件差异，导致出苗不整齐，且转接操作烦琐、工作 量巨大。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺陷，提供一种操作方便、成本低的 白及种子培养原球茎的方法。
[0006] 为了达到上述目的，本发明提供了一种白及种子液体悬浮培养原球茎的方法，该 方法包括以下步骤： (1) 白及种子消毒； (2) 悬浮发芽培养：在无菌条件下，用剪刀剪开白及蒴果外壳，将种子抖落在液体发芽 培养基中，进行震荡培养；液体发芽培养基采用1/2MS培养基(即采用MS培养基中物质的大 量元素浓度减半，其它试剂浓度同MS培养基）;液体发芽培养基中含有NAA 0. 5-1. 0mg*L' 蔗糖;培养条件为暗培养，培养温度24-26°C，培养时间为30天； (3) 悬浮壮苗培养：将经步骤（2)悬浮发芽培养后得到的白及原球茎转接于液体壮苗 培养基中，进行震荡培养；所述液体壮苗培养基采用1/2MS培养基；液体壮苗培养基中含有 NAA 1.0mg*L'6-BA l.Omg·!/1、鹿糖30g·]^;培养条件为光照培养，光照时间为16h/d，光 照强度为2000-25001x，培养温度为24-26°C，培养时间为30-45天。
[0007] 其中，步骤（2)中液体发芽培养基中NAA的优选浓度为0. Smg·!/1。步骤（3)中培 养时间优选30天。
[0008] 步骤（1)中对白及种子消毒采用以下方法：将白及蒴果表面清洗干净，用洗衣粉 洗涤5-10min，置流水冲洗干净，再用75%酒精表面消毒5min，无菌水冲洗干净，然后用10% 次氯酸钠溶液浸泡消毒白及蒴果，无菌水冲洗5-7遍。
[0009] 并可将步骤（3 )悬浮壮苗培养后得到的白及原球茎转入设施育苗设备中进行炼苗 或转接于固体培养基中进行生根培养。
[0010] 本发明白及种子液体悬浮培养原球茎的具体步骤如下： 1.白及种子消毒：将白及蒴果表面洗干净，用洗衣粉洗涤5~10min，置流水冲洗干净， 再用75%酒精表面消毒5min，无菌水冲洗干净，然后用10%次氯酸钠溶液浸泡消毒白及蒴 果，无菌水冲洗5~7遍。
[0011] 2.培养基配制：配制1/2MS +0.51^·!^ NAA+SOg·!/1蔗糖的白及液体发芽培养基 和1/2MS+1. On^PNAA+l. Orng·!/1 e-BA+SOg·!/1蔗糖的白及液体壮苗培养基，于高温条件 下灭菌冷却后待用。
[0012] 3.接种：在无菌条件下，用剪刀剪开白及蒴果外壳，将种子抖落在1/2MS +0.51^^171 NAA +30g·!^蔗糖的白及液体发芽培基中。
[0013] 4.悬浮发芽培养：将接种好的白及液体发芽培养基置于摇床中，震荡培养。培养 条件为黑暗培养，培养温度为25 ± 1°C，培养30天。
[0014] 5.悬浮壮苗培养：将悬浮培养发芽30天后的白及原球茎转接于 l/^MS+l.Omg^I^NAA + LOrng·!/1 e-BA+SOg·!/1蔗糖的白及液体壮苗培养基中进行壮苗培 养，培养条件为为培养温度为（25±1) °C，光照强度200(Γ25001χ，光照时间16MCT1。震荡 培养，培养时间为30-45天。
[0015] 6.白及种子悬浮壮苗培养结束，可以转入设施育苗设备中进行炼苗或转接于固 体培养基中进行生根培养，为白及苗下地作准备。
[0016] 本发明相比现有技术具有以下优点：本发明采用液体悬浮培养代替原固体培养， 能有效保证每个种子都充分接触培养基或种胚基部接触到培养基，出苗整齐，且转接操作 简单。本发明利用液体悬浮培养，能有效获得白及原球茎，操作简单、成本低、且能有效缩短 生产周期。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 图1为不同光照条件下白及的发芽情况； 图2为不同培养基对白及发芽的影响。
[0018] 图1中，a为黑暗条件下白及的发芽情况，b为光照条件下白及的发芽情况； 图2中，1为采用培养基配方1对白及发芽的影响，2为采用培养基配方2对白及发芽 的影响，3为采用培养基配方3对白及发芽的影响，4为采用培养基配方4对白及发芽的影 响。
【具体实施方式】
[0019] 下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。
[0020] 1材料和方法 1.1材料 1. 1. 1实验用材料为白及siriaia (Thunb. )Rchb. f.)的当年成熟蒴果。 (由安徽省芜湖市安徽中医药专科学校李林华老师提供，果实采集于安徽芜湖市南陵县丫 山） 1.1.2试剂、仪器及设备6-节氨基腺噪呤（6-Benzylaminopurine，简称6-BA)购自 上海万疆生物技术有限公司、1_萘乙酸（l_Naphthaleneacetic acid,简称NAA)购自江苏 强盛功能化学股份有限公司；ESCO公司OptiMair超净工作台；上海申安医疗器械厂高压 灭菌锅；电子天平由上海海康电子仪器厂提供，解剖镜为奥林巴斯CX41-12C02双目显微镜 CX41上海泽仕光电科技有限公司；手术刀、滤纸等接种工具均购自南京寿德实验器材有限 公司。其它化学试剂购自国药集团化学试剂有限公司。
[0021] 1.2 方法 1.2.1材料处理及接种白芨蒴果表面清洗干净，洗衣粉浸泡洗涤5~10min，流水冲 洗干净，75%酒精浸没消毒5min，无菌水冲洗干净，10%次氯酸钠溶液浸泡消毒白及蒴果，无 菌水冲洗5~7遍。无菌条件下，无菌剪刀剪开白及蒴果外壳，将种子均匀抖落至液体培养基 中。
[0022] 1.2.2液体培养基的配制以1/2MS液体培养基为基础，添加30g · Γ1蔗糖，调 节pH至5. 8，激素 NAA和6-BA设置3个不同的浓度梯度（0、0. 5mg · I71、1. Omg · I71)。培养 基配方见表1。
[0023] 表1白及发芽及原球茎生成培养基配置表
【权利要求】
1. 一种白及种子液体悬浮培养原球茎的方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 白及种子消毒； (2) 悬浮发芽培养：在无菌条件下，用剪刀剪开白及蒴果外壳，将种子抖落在液体发芽 培养基中，进行震荡培养；所述液体发芽培养基采用1/2MS培养基；所述液体发芽培养基中 含有NAA 0. 5-1. Omg/L、蔗糖30g/L ;所述培养条件为暗培养，培养温度24-26°C，培养时间 为30天； (3) 悬浮壮苗培养：将经步骤（2)悬浮发芽培养后得到的白及原球茎转接于液体壮苗 培养基中，进行震荡培养；所述液体壮苗培养基采用1/2MS培养基；所述液体壮苗培养基中 含有NAA 1. 0mg/L、6-BA 1. Omg/L、蔗糖30g/L ;所述培养条件为光照培养，光照时间为16h/ d，光照强度为2000-25001x，培养温度为24-26°C，培养时间为30-45天。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（2)中液体发芽培养基中NAA的 含量为0· 5mg/L。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤（3)中培养时间为30天。
4. 根据权利要求1至3任一所述的方法，其特征在于，所述步骤（1)中对白及种子消毒 采用以下方法：将白及蒴果表面清洗干净，用洗衣粉洗涤5-10min，置流水冲洗干净，再用 75%酒精表面消毒5min，无菌水冲洗干净，然后用10%次氯酸钠溶液浸泡消毒白及蒴果，无 菌水冲洗5-7遍。
5. 根据权利要求1至3任一所述的方法，其特征在于，所述步骤（3)悬浮壮苗培养后得 到的白及原球茎转入设施育苗设备中进行炼苗或转接于固体培养基中进行生根培养。
【文档编号】A01H4/00GK104137778SQ201410368387
【公开日】2014年11月12日 申请日期:2014年7月30日 优先权日:2014年7月30日
【发明者】周义峰, 汤兴利, 刘彦红, 吴亚萍, 王玫 申请人:中国科学院南京分院东台滩涂研究院, 南京农业大学, 江苏琵琶景观有限公司