一种促进转基因番茄生长和虾青素积累的栽培方法
【专利摘要】促进转基因番茄生长和虾青素积累的栽培方法，以虾青素转基因番茄为材料，播种转基因番茄种子，出苗两个月后的幼苗移栽于栽培温室中，将转基因番茄幼苗分别用尼龙网遮阴处理，用量子照度计测定光强分别为遮光75％，50％，30％及全光照四个光照梯度进行处理，分别于花期和果期进行光合作用测定，并于果实成熟时分三次采收，测定果中虾青素含量；种植期间，日常规律浇水，保证水分状态良好，并使用风机及湿帘进行降温处理，定期除虫防病。本发明以虾青素转基因番茄为细胞工厂高效生产虾青素的材料，在光照强度为日照30％条件下，转基因番茄光合能力及果实虾青素含量最佳，为进一步建立富含虾青素的转基因番茄人工高效种植技术体系奠定了基础。
【专利说明】一种促进转基因番茄生长和虾青素积累的栽培方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物【技术领域】，具体地，涉及一种促进转基因番茄生长和虾青素积累 的栽培方法。
【背景技术】
[0002] 光合生物参与光合作用的类胡萝卜素（如β -胡萝卜素、叶黄素和玉米黄素）为 非酮式类胡萝卜素，是人体合成维生素 Α的唯一来源。一些单细胞绿藻在逆境下还能合成 和积累酮式类胡萝卜素（ketocarotenoid),如奸青素（astaxanthin)。奸青素独特的分 子结构和极强的抗氧化活性赋予它高效的抗辐射，抗衰老，抗肿瘤和预防心血管等疾病的 功能。这使虾青素成为保健和美容等行业的新宠。然而天然虾青素的来源非常有限，人类 一般通过食用海鲜（如虾、蟹和三文鱼）获得虾青素。微藻来源的虾青素生产成本高且难 以突破其产量瓶颈而致其价格非常昂贵，发掘新的天然虾青素资源具有重大的意义。中国 科学院昆明植物研究所黄俊潮研究组与香港大学/北京大学的陈峰教授合作，经过十余年 的努力，首次实现了以番茄为细胞工厂高效生产虾青素的目标（1，2, 3)，使利用经济作物 产业化生产高价值天然虾青素成为可能。番茄是我国设施栽培的主要蔬菜之一，为茄科 (Solanaceae)番茄属一年生草本植物，其产量多与栽培条件密切相关，只有保持适当的栽 培条件，才能获得优质高产。光合作用是番茄生育和产量形成的基础，而番茄光合作用除受 植株本身内在因素的制约外，还与各种环境因素密切相关。因此，在设施栽培条件下，有必 要根据番爺光合特性与环境之间的关系，来确定提高番爺光合作用能力的栽培和环境管理 措施。其中，如何选择适宜的光照强度成为限制番茄生长及生产的关键问题（4, 5, 6, 7)。目 前，如何通过调节设施栽培环境条件从而促进虾青素转基因番茄植株的生长及果实虾青素 含量积累的方法仍属空白。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的在于以虾青素转基因番茄为材料，研究不同光照强度下对转基因番 茄生长发育、生理特性及果实虾青素含量的影响，旨在为虾青素转基因番茄高效栽培和果 实虾青素含量积累提供技术，为栽培过程中的光照管理提供方法。最终实现提供通过调节 设施栽培环境条件从而促进虾青素转基因番茄植株的生长及果实虾青素含量积累的方法。
[0004] 为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：
[0005] 促进转基因番茄生长和虾青素积累的栽培方法，以虾青素转基因番茄为材料，播 种转基因番茄种子，出苗两个月后的幼苗移栽于栽培温室中，将转基因番茄幼苗分别用尼 龙网遮阴，用量子照度计测定光强分别为遮光75 %，50 %，30 %及全光照四个光照梯度进行 处理，分别于花期和果期进行光合作用测定，并于果实成熟时分三次采收，测定其中虾青素 含量；种植期间，日常规律浇水，保证水分状态良好，并使用风机及湿帘进行降温处理，定期 除虫防病。
[0006] 根据所述的栽培方法，其中所述虾青素转基因番茄是保藏号为CGMCC No 9223号 的转基因番茄。
[0007] 根据所述的栽培方法，其中光强采用遮光30%的光照。
[0008] 根据所述的栽培方法，其中栽培温室位于Alt. 1942m;北纬25° 8 z 14"，东经 102° 44 13"。
[0009] 根据所述的栽培方法，其中光强采用全光照和30%遮阴条件时，转基因番茄植株 的光合速率高，光合能力强，植株生理活性强，生长和结实好。
[0010] 虾青素是具有极高价值的酮式类胡萝卜素，然而来源非常有限。本发明以虾青素 转基因番茄为细胞工厂高效生产虾青素为材料，利用不同的光照强度梯度栽培虾青素转基 因番茄，实验结果表明在光照强度为日照30%条件下，转基因番茄光合能力及果实虾青素 含量最佳，是虾青素转基因番茄生长的适宜光强，为进一步研究富含虾青素的转基因番茄 人工高效种植技术体系的建立奠定了技术基础。
【具体实施方式】
[0011] 下面用本发明实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但并不以此来限定本发 明。
[0012] 实施例1 :
[0013] 1.材料和方法：
[0014] 1.1研究材料：
[0015] 2013年6月播种虾青素转基因番茄（黄俊潮等（Huang JC等，2013)通过基因工程 方法将绿藻中筛选和分离到能催化植物细胞中β-胡萝卜素和玉米黄素成虾青素的酮化 酶和羟化酶基因转入野生型番茄植株（cv. UC82B)中，得到的转基因番茄（已于2014年5月 14日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为：CGMCC No 9223 号，分类命名：虾红1号转基因番茄。）种子苗120株，出苗后两个月移栽于昆明植物研究 所栽培温室中（Alt. 1942m ;北纬 25° 8 z 14"，东经 102° 44 z 33")。
[0016] 1.2研究方法：
[0017] 1.2. 1实验设计：将转基因番茄幼苗分别用尼龙网遮阴处理，用量子照度计测定 光强分别为遮光75 %，50 %，30 %及全光照四个光照梯度进行处理，每个处理30株，分别于 花期和果期进行光合作用测定。并于果实成熟时分三次采收，测定其中虾青素含量。种植 期间，日常规律浇水，保证水分状态良好，并使用风机及湿帘进行降温处理，定期除虫防病。
[0018] 1. 2. 2光响应曲线测定：利用便携式气体交换系统（LI-6400, LiCor Inc. Nebraska. USA)测定不同光强度下的光合作用速率获得光响应曲线。光响应曲线在0? 180(^111〇11^28 -1的范围内设置12个光梯度（1800，1600，1200、1000、800、600、400、300、200、 100、50、20和0 μ molnT2s_1)。测定时，叶室内叶温分别维持在25°C，C02浓度为400 μ mol πιοΓ1，相对湿度60%左右，平衡2-3min左右记录读数，每个处理重复三次。利用光合助手 软件（Photosyn Assistant，VI. 1，Dundee Scientific，UK)拟合光合响应曲线。
[0019] 1. 2. 3二氧化碳响应曲线测定：利用便携式气体交换系统（LI-6400, LiCor Inc. Nebraska. USA)测定不同二氧化碳强度下的光合作用速率获得二氧化碳响应曲线。维持光 强在1200 mol m2s \ (1)2浓度由0 mol mol 1逐渐升至1800 mol mol、实验结束后， 使用光合助手软件（Photosyn Assistant，VI. 1，Dundee Scientific，UK)拟合光响应曲线 及二氧化碳响应曲线。
[0020] 1. 2. 4果实虾青素含量的测定：分三次随机采收成熟果实，用喷雾干燥机进 行干燥处理采收品，干样送至昆明植物研究所分析测试中心委托测定。测定方法：将 冷冻干燥好的样品粉碎、装袋、密封，进行虾青素含量测定，测定采用高效液相色谱法 分离，其液相条件：色谱柱为WatersSpherisorb 0SD2 (5 μ m, 4. 6, 250mm)，液相型号为 Waters (Milford, MA，USA)，进样量为 20 μ 1 ;流动相 A 相为乙腈 / 甲醇/Tris -HCL (pH 8.0)， 体积比为84:2:14,B相为甲醇/乙酸乙酯，体积比为68:32 ;以1. 2mL/min的流速线性梯度 洗脱色素，从100% A相到100%的B相，每个梯度用时15分钟，随后用B相洗脱10分钟， 通过比对各颜色组分和标准品的光谱吸收和相对保留时间来鉴定各组分，通过将峰面积的 积分值与标准品对比将其转化为浓度值从而对各组分进行定量，标准品购买自sigma公司 和Wako公司。
[0021] 1.2. 5数据分析：所有数据都是使用统计软件SPSS 16. 0 for Windows(SPSS Inc.，Chicag〇，USA)进行分析，不同处理间（内）的差异比较采用单因素方差分析（AVOVA) 和LSD检验。
[0022] 2.结果与讨论
[0023] 2. 1不同光照梯度下转基因番茄的光合特性比较：
[0024] 番茄是喜强光的蔬菜作物，不同的光照强度对番茄光合作用有显著影响。光系统 Π 的最大光化学效率（FV/FM)通常用来表征植物光系统运转及受损情况，在不同光照条件 下，转基因番茄的光系统II的最大光化学效率没有显著差异，并维持在0. 74以上水平，表 明其在四个光照梯度下光系统没有显著性受损情况，均能够进行正常的光合作用（表1)。 不同光照处理下转基因工程番茄的光合能力有显著性差异，转基因番茄的饱和光合速率在 全光照条件下显著高于30%遮阴，30%遮阴条件下的饱和光合速率显著高于50%和75% 遮阴条件（表1)。转基因番茄的光饱和点表现出全光照和30%遮阴条件下显著高于50% 和75%遮阴条件，表明生长光强越强，转基因番茄利用光照的能力越强，同时表明转基因番 茄对生长的光照强度有较好的可塑性。因此，光照强度越强（遮阴度越低），转基因番茄的 饱和光合速率越高，光合能力越强。对转基因工程番茄的生长和生产来说，遮阴会显著影响 植株的光合能力从而影响植株的生长和结实。
[0025] 表1四个不同光照处理下虾青素转基因番茄光合参数比较
[0026]
【权利要求】
1. 促进转基因番茄生长和虾青素积累的栽培方法，以虾青素转基因番茄为材料，播种 转基因番茄种子，出苗两个月后的幼苗移栽于栽培温室中，将转基因番茄幼苗分别用尼龙 网遮阴，用量子照度计测定光强分别为遮光75 %，50 %，30 %及全光照四个光照梯度进行处 理，分别于花期和果期进行光合作用测定，并于果实成熟时分三次采收，测定其中虾青素含 量；种植期间，日常规律浇水，保证水分状态良好，并使用风机及湿帘进行降温处理，定期除 虫防病。
2. 根据权利要求1所述的栽培方法，其特征在于所述虾青素转基因番茄是保藏号为 CGMCC No 9223号的转基因番茄。
3. 根据权利要求1所述的栽培方法，其特征在于光强采用遮光30%的光照。
4. 根据权利要求1所述的栽培方法，其特征在于栽培温室位于Alt. 1942m;北纬 25。8 z 14"，东经 102。44 z 33"。
5. 根据权利要求1所述的栽培方法，其特征在于光强采用全光照和30%遮阴，转基因 番爺植株光合速率高，光合能力强，植株生理活性强，生长和结实好。
【文档编号】A01G1/00GK104145678SQ201410403560
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月15日 优先权日:2014年8月15日
【发明者】常玮, 王 华, 胡虹, 严宁, 黄俊潮 申请人:中国科学院昆明植物研究所