栽培小麦Brock中转录因子TaWRKY基因序列及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及WRKY类转录因子基因— TaWRKY 基因序列及功能。该基因全长1242bp，编码354个氨基酸多肽,相对分子量38.7kD,等电点4.96，与小麦和大麦中 WRKY 类基因同源性分别达90%和80%以上。进化分析， TaWRKY 与WRKY家族中 TaWRKY8 亲缘关系最近。 TaWRKY 被白粉菌诱导表达；用病毒介导沉默抗病小麦Brock中的 TaWRKY ，Brock对白粉菌的抵抗明显降低：与对照相比，沉默株叶片表面畸形附着胞比例降低，7d时仅为对照的四分之一，而白粉菌成功侵染率较对照株提高约14倍。以上结果显示TaWRKY具有WRKY家族成员结构特征，在小麦抗白粉病应答途径中起重要作用。
【专利说明】栽培小麦Brock中转录因子7^#/?/rr基因序列及其应用
[0001]本发明得到:国家自然科学基金(31071671)和天津市科委青年基金(14JCQNJC14900)资助。
[0002]【技术领域】:
本发明属于农业生物基因工程【技术领域】，涉及小麦一种WRKY转录因子的基因序列的获得及其在小麦抗白粉病基因功能研究方面的应用。
【背景技术】
[0003]植物在漫长的进化过程中形成一系列复杂而精确的机制，来抵御生长发育过程中受到各种生物和非生物胁迫。逆境胁迫下，植物通过一系列生理、生化和分子水平上的改变来适应逆境胁迫。大量研究表面，植物对逆境的响应是自身多个基因和基因家族共同作用的结果，这些基因主要分为功能基因和调节基因两类。转录因子是植物中非常重要的一类调节基因。
[0004]WRKY转录因子是近年来在植物中被广泛研究的一类转录因子家族，因其含有一段高度保守的WRKYGQK氨基酸序列而得名。WRKY转录因子广泛参与植物的抗逆胁迫和衰老等生理生化过程，机械损伤、病原菌侵害、植物激素类物质刺激都会引起WRKY基因的表达变化。烟草WRKY3和WRKY6能够响应昆虫取食造成的伤害。水稻中，过表达可以提高其对细菌和真菌疫病的抗性。拟南芥中转录因子WRKY2介导了依赖于ABA的种子萌发以及萌发后发育的阻滞过程。HvWRKY38在大麦中受干旱、低温胁迫的诱导。在水稻中，干旱诱导水稻的叶中0sWRKY80的表达量显著增加。1994年，Ishiguro和Nakamura首次从甘薯(Ipomoea batatas)中克隆出第一个WRKY蛋白SPF1，此后人们相继在野生燕麦、欧芹、拟南芥、烟草和水稻等多种植物中都得到了 WRKY基因。目前，在拟南芥和水稻中分别发现了 72个和107个WRKY基因，Wu等和Niu等也分别在小麦中克隆了 15个和43个WRKY基因。
[0005]前期工作中，我们在利用cDNA-AFLP技术分析Brock中白粉菌诱导下基因表达谱时，发现一个367 bp的片段F16，经Blast比对，该片段与NCBI GenBank中小麦WRKY8(Genbank 登录号:DQ323885.1)，小麦 rM7Z/(Genbank 登录号:EF368356.1),小茇 WRKY80(Genbank 登录号 JX679079.1)，小麦 cDNA 文库序列(Genbank 登录号:AK331823.1)，大茇 WRKYl (Genbank 登录号:AJ536667.1)，大茇 WRKY38 (Genbank 登录号:ΑΥ541586.I)分别有94%、93%、93%、92%、85%和80%的同源性。我们根据上述基因序列设计兼并引物，在抗白粉病小麦Brock中克隆了一个WRKY基因cDNA全长序列，命名为TaWRKY0利用荧光定量PCR技术对该基因的表达模式进行了分析，利用病毒介导的基因沉默(VIGS)技术获得沉默植株，通过对小麦叶片基因沉默前后白粉菌侵染情况观察统计，初步认为该WRKY基因参与了小麦抗白粉病早期防御反应过程。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是公开了小麦转录因子AMXT基因序列的获得以及在小麦抗白粉病相关性研究方面的应用。主要内容包括: 小麦WRKY转录因子基因序列，该基因序列全长1242bp，具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。编码蛋白含354个氨基酸，相对分子量为38.7 kD，理论等电点为4.96，具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
[0007]本发明进一步公开了小麦WRKY转录因子AMXT基因序列在用于小麦抵抗白粉病方面的应用。进化树分析表明，TaWRKY与WRKY家族中TaWRKY8亲缘关系最近。基因的诱导表达模式分析显示，AFMT被白粉菌强烈、迅速诱导表达；用病毒介导的基因沉默方法沉默抗病小麦Brock中的基因，小麦对白粉菌的抵抗明显降低，表现在两个方面--第一，与对照相比，沉默株叶片表面畸形附着胞比例明显降低，7d时仅为对照的四分之一；第二，白粉菌接种小麦叶片7天时，白粉菌成功侵染率对照株约为6%，基因沉默株则达86%，提高了约14倍。以上结果显示7?腸转录因子具有WRKY家族成员基因结构特征，在小麦抗白粉病应答途径中起重要作用。
[0008]本发明人所在实验室前期在利用cDNA-AFLP技术分析Brock中白粉菌诱导下基因表达谱时，发现一个367 bp的EST F16，经Blast比对，该片段与NCBI GenBank中多个植物WRKY基因有同源性，因此，我们根据上述基因序列设计兼并引物，在抗白粉病小麦Brock中克隆了一个WRKY基因cDNA全长序列，命名为rarMT。为了研究TaWRKY基因对白粉菌诱导的应答情况，我们利用荧光定量分析法(qRT-PCR)分析白粉菌诱导后AMXT基因mRNA积累情况。Brock中，基因受白粉菌诱导后的表达趋势呈“W”型曲线特征，在白粉菌诱导2h时基因表达开始上升，约为本底表达的1.2倍；4h时约为1.5倍，8h时达到最高，约为本底表达量的3.75倍；之后迅速回复到2倍以下，24h后又开始上升，48h时达到接近本底表达量的3倍。以上结果说明，的表达水平与白粉菌的诱导密切相关。沉默AMXT基因小麦叶片白粉菌附着胞畸形率低，成功侵染率高，试验小麦的抗病性由强变弱，说明目标基因与抗白粉病特性密切相关。以上结果显示转录因子具有WRKY家族成员基因结构的特征，在小麦抗白粉病应答途径中起重要作用。因此完成了本发明。
[0009]小麦转录因子TaWRKY基因属于WRKY基因家族成员，该基因序列全长1242bp，碱基序列如下(SEQ ID NO:1):
CCACGCGTCCGCGGAAATAGTTCTCCATCTCAACCTTCTCTTCTCCCTTCTCTTCTCTCCCGCGCGTTACCT
CGAACCGGAAGCGAACTCTACATCCATCCTCGACCGATGGATCCATGGGTCAGCAGCCAGCCTTCCCTTAGCCTCGA
CCTGCACGTCGGCCTCCCGCCGATGGGGCACCCGCACCACCACCAGGCGGCGCCCATGGTCGCGCTGGCCAAGCCCA
AGGTCCTCGTCGAGGAGAACTTCATGCAGCTCAAGAAGGACCCTGAGGTTGCGGTTCTTGAGTCTGAGCTACAGCGG
GTGAGCGAGGAGAACCGGCGGCTGGGCGAGATGCTCAGGGAGGTGGCCTCCAAGTACGAGACCCTGCAGGGCCAGTT
CACCGACATGGTCACGGCCGGCGCCCACGCCGGCGGCAATAACCACTACAACAACCAGCCGTCCTCCGCGTCGGAGG
GCGGGTCGGTGTCGCCGTCGAGGAAGCGCAAGAGCGAGGAGAGCAACGGCACGCCACCGCCGTCGCACCAGCAGCAG
CAGCAGCACTACGCCGGCGGCCTCGCGTACGCGGCGGCGCCGGACCAGGCGGAGTGCACGTCCGGCGAGCCGTGCAA
GCGCATCCGGGAGGAGTGCAAACCCGTCATCTCCAAGCGCTACGTCCACGCCGACCCCGCCGACCTCAGCCTGGTGG
TGAAGGACGGGTACCAATGGCGCAAGTACGGGCAGAAGGTGACCAAGGACAACCCCTGCCCCAGAGCCTACTTCCGG
TGCTCCTTCGCCCCCGGCTGCCCCGTCAAGAAGAAGGTGCAGAGGAGCGCCGAGGACAAGACCATACTCGTGGCGAC
GTACGAGGGCGAGCACAACCACAGCCAGCCCCCGTCGTCGCAGCCGCAGCAGCAGAACGACGGCTCCGGCGCGGGCA
AGAACGCCGGGAAGCCACCCCAGGCGCCGGCCACGCCTCACCACCCGCAGCAGCATCAGCAGCAGCACAAGCAGGAA
GCGCCAGCGGTAGCCGTCAGCGGCGAGTCCGCCGCCGCGGAATCCGAGATGATCCGTCGGAACCTGGCGGAGCAGATGGCCATGACGCTGACGAGGGACCCCAGCTTCAAGGCGGCGCTCGTCACCGCCCTCTCCGGCCGGATCCTCGAGCTAT
CGCCGACCAGGGACATCAATTAAAATCACTAGTGAATTCGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCA
ACGCGTTGATTCCAT
阴影单划线部分为起始密码子，阴影双划线部分为终止密码子。
[0010]本发明所述的小麦转录因子AMXT基因序列，该基因含有编码354个氨基酸的开放读码，理论预测该蛋白的分子量为38.7kDa，序列如下(SEQ ID N0:2):
MDPWVSSQPSLSLDLHVGLPPMGHPHHHQAAPMVALAKPKVLVEENFMQLKKDPEVAVLESELQRVSEENRR
LGEMLREVASKYETLQGQFTDMVTAGAHAGGNNHYNNQPSSASEGGSVSPSRKRKSEESNGTPPPSHQQQQQHYAGG
LAYAAAPDQAECTSGEPCKRIREECKPVISKRYVHADPADLSLVVKDGYQffRKYGQKVTKDNPCPRAYFRCSFAPGC
PVKKKVQRSAEDKTILVATYEGEHNHSQPPSSQPQQQNDGSGAGKNAGKPPQAPATPHHPQQHQQQHKQEAPAVAVS
GESAAAESEMIRRNLAEQMAMTLTRDPSFKAALVTALSGRILELSPTRDIN。
[0011]阴影单划线部分为WRKY保守结构域。
[0012]本发明公开的栽培小麦Brock中转录因子AMXT基因序列所具有的积极效果在于:
(1)为从抗病栽培小麦Brock中获得的转录因子基因，通过基因沉默技术研究发现该基因在小麦抗白粉病早期应答方面有重要作用；
(2)转录因子基因具有迅速调控其下游基因的表达，从而提高植物的整体抗性，因此转录因子AMXT可以作为目标基因应用于小麦抗白粉病分子育种研究。
[0013]【专利附图】
【附图说明】:
图1.小麦TaWRKY与其他物种的WRKY的系统进化树分析；
图2.基因在Brock中的表达趋势；
图3.7?腸《7基因沉默植株叶片形态；A = GKP-Buffer水稀释液对照组，B: BSMV y: GFP对照组，C: BSMVy: /--对照组，D: BSMVy基因沉默组；
图4.AMXT基因沉默效率检测；
图5.基因沉默植株(BSMV:和对照(BSMV:ff^)的白粉菌侵染情况；
图6.对照和沉默植株上的畸形附着胞和成功侵染率比较，A为对照和沉默植株上畸形附着胞比较为对照和沉默植株白粉菌成功侵染率比较。
[0014]【具体实施方式】:
下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内，本发明的范围和实质由权利要求来限定。
[0015]实施例1 I材料与方法
1.1实验材料与试剂
白粉菌抗性品种Brock,由Ray Johnson博士惠赠。
[0016]小麦白粉菌15号生理小种，由中国农业科学院植物保护研究所提供。
[0017]1.2 TaWRKY基因的克隆
参照Roche公司TriPure Isolat1n Reagent试剂盒操作手册提取总RNA。利用NanodroplOOO和琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量及浓度。然后以4 μ g总RNA为模板，利用Oligo (dT) 18,在 Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit (Roche)的作用下合成cDNA。根据F16的Blast比对结果，设计一对兼并引物，
WRKYCDS-F: 5’ -ATGGATCCATGGRTSRGCAGCC-3’ ;
WRKYCDS-R: 5，-TTAATTGATGTCCCTGGTCGGCGAK-3，进行 PCR 扩增，扩增体系为 5 X HFBuffer 10.Ομ I, 10mM dNTP Mixture 1.0 μ 1，WRKYCDS-F 2.5 μ 1，WRKYCDS-R 2.5 μ I,cDNA 1.0 μ I, DNA polymerase 0.5 μ 1，ddH20 补齐至 50 μ I。PCR 反应参数:98°C预变性5 min ;98°C变性10s，58°C退火30s，72°C延伸2 min ;反应进行35个循环。72°C终延伸7min。将目标条带回收纯化,纯化产物连接到pGEM-T easy Vector上，转化大肠杆菌,蓝白斑筛选阳性克隆，经PCR验证和酶切验证后，阳性克隆送公司测序，测序结果提交NCBIGenBank进行同源性分析。
[0018]1.3 7?腸?Τ基因表达模式分析
在小麦幼苗长至一叶一心期时采用抖落法高密度接种新鲜白粉菌孢子，接种0，2，4，8，12，24和48h后取叶片用于提取RNA和表达趋势分析。
[0019]根据小麦TaWRKY基因的特异区段设计一对荧光定量引物QTaWRKYF: 5’-AGTCCAATCCCGTCATCTCC-3’
和 QTaWRKYR: 5’-GTCGCCACGAGTATGGTCTT-3’，大小为 154bp。使用 FastStart UniversalSYBR Green Master (Roche)在突光定量PCR仪(Corbett Rotor Gene 6000)上进行基因扩增、荧光信号检测和溶解曲线分析。内参基因为小麦基因(GenBank: U76744.1)，该基因扩增引物为 TubulinF: 5’ -CCGTCTCCTTCTGGCTGCTT-3’ 和 TubulinR: 5’ -GCCCGATGTGGATGCTTAT-3’，扩增片段大小为186bp。PCR扩增体系及程序参照试剂盒说明书进行，每个样品设置3个重复，采用2_ΛΛσΓ法进行数据分析[11]。
[0020]1.4 VIGS 载体构建
用于载体构建的是大麦条纹花叶病毒(Barley stripe mosaic virus, BSMV)病毒，它由BSMVa，BSMVβ，BSMVy:PDS/GFP 3个组分组成。BSMVy上的Yb开放阅读框下游终止密码子处引入了觔e I切点，用于插入克隆DNA片段。BSMVy-PDS经觔e I酶切后，去掉PDS基因片段，回收载体片段。根据AMXT基因保守区序列设计一对两端添加 Nhe I 酶切位点的上下游引物，WRKY-V-F: 5，-AGCCGCAGCAGCAGAACG-3 ’ 和 WRKY-V-R5’-CTTGAAGCTGGGGTCCCTC-3’。扩增片段大小为200bp左右。以含基因全长的质粒作为模板进行PCR扩增，扩增产物经电泳、纯化、酶切后与同样经#知I酶切并磷酸化的BSMV Y:PDS载体连接。连接产物经克隆，筛选，测序后成功构建VIGS重组载体。
[0021]1.5体外转录和病毒接种
载体 BSMV a，BSMV Y 和 BSMV β 酶切线性化，然后用 RiboMAX large Scale RNAProduct1n-T7 kit (Promega)体外转录获得BSMV病毒RNA。将病毒的3个RNA组分等量混合，加等体积GKP缓冲液混匀后，接种于小麦二叶期在第2片叶子上。以GKP缓冲液作为阴性对照；接种RNA a +RNA β +RNA Y:PDS/GFP (BSMV: PDS/GFP)并以叶片漂白症状跟踪基因沉默情况作为阳性对照。接种后保湿24 h，然后在光照培养箱中于20°C培养数天，定期观察病毒症状和接种BSMV = PDS植株叶片漂白情况。
[0022]1.6基因沉默效率检测
提取接种BSMV:且有病毒症状的小麦第3叶总RNA，反转录成cDNA，qRT-PCR分析基因的表达水平，进而确定基因的沉默效率。
[0023]1.7基因沉默对白粉菌侵染小麦叶片的影响
在Brock第三片叶子上接种白粉菌，接菌48hr，72hr和7d的TaWRKY实验组、GFP对照组和GKP-Buffer水稀释液对照组的叶片上取3-4cm长的叶段，浸泡于脱色液中脱色48h，期间更换脱色液直至叶片透明。再于考马斯亮蓝R-250染色液中染色4hr。以蒸馏水洗去叶片表面残余的染色液，随后将叶片置于保存液中保存并在显微镜下观察，统计白粉菌与叶片的互作情况。
[0024]实验结果
2.1基因的克隆
分离白粉菌诱导8h的小麦Brock叶片总RNA,以Oligo (dT) 18为引物进行反转录，获得cDNA，以该cDNA为模版，WRKYCDS-F和WRKYCDS-R为引物，PCR扩增出一个约1.3kb的基因片段，将该片段连接到T-easy克隆载体，克隆并测序，该片段长1242 bp，包含F16序列区段，与小麦腸基因(GenBank登陆号:DQ323885.1)有97%同源性。其ORF区共1065bp，推测编码354个氨基酸(SEQ ID NO: 2),理论预测该蛋白的分子量为38.7 kD,等电点4.96。氨基酸序列的分析发现，TaWRKY中后部包含WRKY基因超家族保守结构域WRKYGQK，故将该基因命名为TaWRKY (图1)。
[0025]本发明所述的小麦转录因子基因序列，该基因含有编码354个氨基酸的开放读码，理论预测该蛋白的分子量为38.7kDa，见SEQ ID NO: 2
利用ClustalW软件进行系统谱系分析发现，本研究中克隆的基因与WRKY家族中WRKY8亲缘关系较近(图1)
2.2 TaffRKY基因表达模式分析
为了研究TaWRKY基因对白粉菌诱导的应答情况，我们利用荧光定量分析法(qRT-PCR)分析白粉菌诱导后基因mRNA累计情况。Brock中，TaWRKY基因受白粉菌诱导后的表达趋势呈“W”型曲线特征，在白粉菌诱导2h时基因表达开始上升，约为本底表达的1.2倍；4h时约为1.5倍，8h时达到最高，约为本底表达量的3.75倍；之后迅速回复到2倍以下，24h后又开始上升，48h时达到接近本底表达量的3倍(图2)。以上结果说明，
的表达水平与白粉菌的诱导密切相关。
[0026]小麦沉默基因植株的获得
将rarMT基因非保守区片段插入BSMV Y载体，构成重组BSMV病毒(BSMV y: TaWRKV)；作为对照，同时以I3DS和GFP构建相同的重组病毒BSMV Y: PDS和BSMV y: GFP,分别接种小麦Brock第二片叶，结果发现接种重组病毒BSMV: PDS的植株叶片出现明显的白化现象(图3)，说明该基因沉默实验体系有效。除去病毒引起的溃水斑外，本研究中基因沉默小麦与对照组小麦在生长、形态等方面没有明显差异。然后分别提取了实验组和对照组的小麦的第三片叶总RNA，利用半定量PCR分析实验材料中基因的mRNA水平。如图4所示，实验组中hrMT基因的表达量明显下降，说明我们设计的片段可以有效的沉默内源TaWRKY基因。
[0027]TaWRKY基因沉默后小麦叶片对白粉菌侵染的抗性变化
以接种BSMV Y: GFP %对照，本研究分别观察了白粉菌侵染48h，72h和7d后，BSMVy laMXT基因沉默小麦植株对白粉菌侵染的抗性变化。接种白粉菌48h后，BSMV y:基因沉默小麦植株叶片上开始出现次生菌丝，而对照组BSMV y: 中的白粉菌基本处于附着胞状态；接种72h后，基因沉默株叶片上出现大量多分支的次级菌丝，而对照组中则刚刚开始出现次级菌丝；染菌7d后，基因沉默株出现大量串珠状孢子，对照组中的菌丝开始出现多分支，但是数量明显少于基因沉默组(图5)。结果暗示，沉默hrMT基因在一定程度上降低了植株的抗病水平。
[0028]本研究共对每组9个叶片上的畸形附着胞和菌丝的生长情况分别进行统计，如统计图6A和B。与对照组相比，沉默株叶片表面畸形附着胞比例明显低于对照，7d时仅为对照的四分之一(图6A)，表明由于基因沉默导致植株对白粉菌的抵抗能力下降；与之相对应，白粉菌成功侵染率明显提高，7d时对照株约为6%，基因沉默株则达86% (图6B)，提高了约14倍，进一步说明该基因在小麦抵抗白粉病过程中具有重要作用。
【权利要求】
1.小麦WRKY转录因子基因序列，该基因序列全长1242bp，具有SEQID NO:1所示的核苷酸序列。
2.小麦WRKY转录因子AMXT基因序列，编码蛋白含354个氨基酸，相对分子量为38.7 kD,理论等电点为4.96，具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列。
3.权利要求1或2所述的小麦WRKY转录因子AMXT基因序列在用于小麦抵抗白粉病方面的应用。
【文档编号】A01P3/00GK104357457SQ201410691682
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月27日 优先权日:2014年11月27日
【发明者】王振英, 刘晓颖, 肖莹, 彭永康, 范宝莉, 陈宏
申请人:天津师范大学