一种在冬季获取青花菜小孢子材料的方法与流程

本发明涉及一种小孢子材料的获取方法，更具体地说涉及一种在冬季获取青花菜小孢子材料的方法。

背景技术：

青花菜又名西兰花、绿菜花、茎椰菜等，是十字花科芸薹属甘蓝种中以绿色花球为产品器官的一、二生草本植物，其以主茎及侧枝顶端形成的绿色花球为产品，营养丰富，色、香、味具佳，是国际市场十分畅销的一种名特蔬菜。

自1982年Lichter首次报道油菜游离小孢子培养获得再生植株以来，芸薹属作物，尤其是油菜的小孢子培养，无论是在出胚率、出胚量，还是胚培养及再生植株方面都获得了很大的成功。相对于甘蓝型油菜、结球甘蓝等作物，青花菜游离小孢子的培养难度较大。

而且，在青花菜的正常开花季节，可以大量获得小孢子；但当合适的花期季节一过，进入秋冬季后，由于外界栽培条件不允许，无法正常抽出合适做小孢子的花蕾，进而无法在冬季获得青花菜小孢子，为创制DH(双单倍体)材料提供资源，这给青花菜小孢子培养育种技术带来了更多困难。

技术实现要素：

为了弥补现有技术不能在冬季获得小孢子材料的不足，本发明目的是提供一种方法，该方法能够在冬季无法正常开花的季节，提供正常开花的小孢子材料，为创制DH提供资源。

本发明解决技术问题所采用的技术方案是：一种在冬季获取青花菜小孢子 材料的方法，所述方法主要包括以下步骤：

a.播种：在温室大棚中，准备好穴盘，在穴盘中装满栽培基质，并用水浇透，将青花菜种子浅层播种于穴盘内；

b.催芽：将上述播种有青花菜种子的穴盘放置温床上催芽，催芽温度控制在白天20～25℃，夜间10～15℃；在催芽期间，根据基质干湿情况浇水管理；

c.定植：待到长出2～3片真叶时，定植栽培于基质营养杯中，并根据基质干湿情况，定期浇灌营养液MB1，控制环境温度和湿度，从而达到满足其营养生长所需条件；

d.低温春化：待到真叶长出14～16片营养生长结束后，控制环境温度在8～15℃，低温春化诱导其进入生殖生长，春化作用20天左右，期间并配合浇灌营养液MB2；

e.栽培：待到花球形成后，根据基质干湿情况，配合浇灌营养液MB3继续栽培；控制大棚内的环境温度为20～25℃，获得正常花蕾；

f.提取小孢子：选取长度合适的花蕾，将花蕾经过消毒、抽提花粉，即可在冬季获得青花菜的小孢子材料。

所述培养液MB1的具体组成如下：以一立方米水计，其中含有硝酸钾1.6kg、硝酸铵1.4kg、氯化钙0.5kg、硫酸镁0.37kg、磷酸二氢钠2.15kg、肌醇50g、硫酸亚铁28g、乙二胺四乙酸二钠40g、硫酸锰22g、硫酸锌9g、硼酸钠6g、碘化钾1g、甘氨酸2g、钼酸钠0.25g、硫酸铜0.5g、氯化钴0.5g。

所述培养液MB2的具体组成如下：以一立方米水计，其中含有氯化钾1.05kg、硝酸铵1.5kg、氯化钙0.5kg、硫酸镁0.37kg、磷酸二氢钠2.5kg、肌醇30g、硫酸亚铁28g、乙二胺四乙酸二钠40g、硫酸锰22g、硫酸锌9g、硼酸钠10g、碘化钾1g、甘氨酸2g、钼酸钠0.35g、硫酸铜0.5g、氯化钴0.5g。

所述培养液MB3的具体组成如下：以一立方米水计，其中含有氯化钾1kg、硝酸铵1.15kg、氯化钙0.5kg、硫酸镁0.37kg、磷酸二氢钠2.9kg、肌醇10g、硫酸亚铁28g、乙二胺四乙酸二钠40g、硫酸锰22g、硫酸锌9g、硼酸钠12g、碘化钾1g、甘氨酸2g、钼酸钠0.5g、硫酸铜0.5g、氯化钴0.5g。

上述小孢子的提取方法具体包括以下内容：

(1)选蕾：选取生长良好长度为2.5～3.5mm的主花序花蕾，或者是选取长度为3.5～4mm的侧枝花蕾；

(2)消毒：将上述选取好的花蕾用酒精消毒30～40S，然后用次氯酸钠消毒10min，最后用无菌水清洗3次，每次5min；

(3)抽提花粉：将灭过菌的花蕾放置于离心管中，加入1～2mL B5培养液，用玻璃棒研磨使花粉散出，研磨至糊状，在管中加入半吸管B5培养液，倒入过滤器过滤，将滤液盛入10mL的离心管中；加入B5培养液冲洗过滤器中的花粉，冲2～3次后，合并滤液，在10mL离心管中将花粉悬浮液稀释；

将花粉悬浮液800转/min下离心处理5min；将离心管中的上层清液除去，再加液体B5培养液，并将沉淀的花粉用吸管冲散，再次悬浮离心，除去上清液；

将沉淀的花粉用NLN-13培养液稀释，稀释后的悬浮液分装入6cm培养皿，一般每皿加入悬浮液5mL左右，每mL含花蕾大约1.5～2个，用封口膜封口，便可得到所需的小孢子材料；该小孢子材料在培养皿内可继续培养成胚状体。

进一步地，所述消毒步骤中采用的酒精的质量百分数为75％，所述消毒步骤中采用的次氯酸钠的质量百分数为2％。

本发明的有益效果是：与现有技术相比，本发明通过无土栽培技术在冬季的温室大棚内栽培出适合做小孢子材料的花蕾，选取合适的花蕾提取小孢子材 料，解决了冬季无法正常获得青花菜小孢子的技术难题。

附图说明

图1为本发明青花菜种子播种阶段的示意图。

图2为本发明青花菜种子催芽阶段的示意图。

图3为本发明定植阶段的示意图。

图4为本发明低温春化阶段的示意图。

图5为本发明花球形成阶段的示意图。

图6为本发明中获得的正常花球的示意图。

图7为本发明中小孢子形态倒置显微镜下放大40倍后的示意图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例

一种在冬季获取青花菜小孢子材料的方法，所述方法主要包括以下步骤：

a.播种：在温室大棚中，准备好穴盘，在穴盘中装满栽培基质，并用水浇透，将青花菜种子浅层播种于穴盘内，如图1所示；

b.催芽：将上述播种有青花菜种子的穴盘放置温床上催芽，催芽温度控制在白天20～25℃，夜间10～15℃；在催芽期间，根据基质干湿情况浇水管理如图2所示；

c.定植：待到长出2～3片真叶时，定植栽培于基质营养杯中，并根据基质 干湿情况，定期浇灌营养液MB1，控制环境温度和湿度，从而达到满足其营养生长所需条件，如图3所示；

d.低温春化：待到真叶长出14～16片营养生长结束后，控制环境温度在8～15℃，低温春化诱导其进入生殖生长，春化作用20天左右，期间并配合浇灌营养液MB2，如图4所示；

e.栽培：待到花球形成后，根据基质干湿情况，配合浇灌营养液MB3继续栽培；控制大棚内的环境温度为20～25℃，获得正常花蕾，如图5所示；

f.提取小孢子：选取长度合适的花蕾(如图6所示)，将花蕾经过消毒、抽提花粉，即可在冬季获得青花菜的小孢子材料，小孢子在显微镜下的形态如图7所示。

所述培养液MB1的具体组成如下：以一立方米水计，其中含有硝酸钾1.6kg、硝酸铵1.4kg、氯化钙0.5kg、硫酸镁0.37kg、磷酸二氢钠2.15kg、肌醇50g、硫酸亚铁28g、乙二胺四乙酸二钠40g、硫酸锰22g、硫酸锌9g、硼酸钠6g、碘化钾1g、甘氨酸2g、钼酸钠0.25g、硫酸铜0.5g、氯化钴0.5g。

所述培养液MB2的具体组成如下：以一立方米水计，其中含有氯化钾1.05kg、硝酸铵1.5kg、氯化钙0.5kg、硫酸镁0.37kg、磷酸二氢钠2.5kg、肌醇30g、硫酸亚铁28g、乙二胺四乙酸二钠40g、硫酸锰22g、硫酸锌9g、硼酸钠10g、碘化钾1g、甘氨酸2g、钼酸钠0.35g、硫酸铜0.5g、氯化钴0.5g。

所述培养液MB3的具体组成如下：以一立方米水计，其中含有氯化钾1kg、硝酸铵1.15kg、氯化钙0.5kg、硫酸镁0.37kg、磷酸二氢钠2.9kg、肌醇10g、硫酸亚铁28g、乙二胺四乙酸二钠40g、硫酸锰22g、硫酸锌9g、硼酸钠12g、碘化钾1g、甘氨酸2g、钼酸钠0.5g、硫酸铜0.5g、氯化钴0.5g。

上述小孢子的提取方法具体包括以下内容：

(1)选蕾：选取生长良好长度为2.5～3.5mm的主花序花蕾，或者是选取长度为3.5～4mm的侧枝花蕾；

(2)消毒：将上述选取好的花蕾用质量百分数为75％的酒精消毒30～40S，然后用质量百分数为2％的次氯酸钠消毒10min，最后用无菌水清洗3次，每次5min；

(3)抽提花粉：将灭过菌的花蕾放置于离心管中，加入1～2mL B5培养液，用玻璃棒研磨使花粉散出，研磨至糊状，在管中加入半吸管B5培养液，倒入过滤器过滤，将滤液盛入10mL的离心管中；加入B5培养液冲洗过滤器中的花粉，冲2～3次后，合并滤液，在10mL离心管中将花粉悬浮液稀释；

将花粉悬浮液800转/min下离心处理5min；将离心管中的上层清液除去，再加液体B5培养液，并将沉淀的花粉用吸管冲散，再次悬浮离心，除去上清液；

将沉淀的花粉用NLN-13培养液稀释，稀释后的悬浮液分装入6cm培养皿，一般每皿加入悬浮液5mL左右，每mL含花蕾大约1.5～2个，用封口膜封口，便可得到所需的小孢子材料；

将封口的培养皿在25℃的条件下进行暗培养，大概10天左右开始查看是否有可见的颗粒状胚的形成，如果没有则继续培养，如果有可见的胚出现，则移至50rpm、25℃恒温摇床上继续进行暗培养。

以上实施方式仅用于说明本发明，而并非对本发明的限制，有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型，因此所有等同的技术方案也属于本发明的范畴，本发明的专利保护范围应由权利要求限定。