本发明涉及一种高效的小麦花培方法，属于农业科学技术领域。
背景技术：
小麦是一种在世界各地广泛种植的禾本科植物，是小麦属植物的统称，最早起源于中东的新月沃土地区。小麦是三大谷物之一，绝大部分作为食用，仅约有六分之一作为饲料使用。小麦作为世界上总产量第二的粮食作物也是中国第二大粮食作物，在国人食品中扮演着重要角色。据统计，在当前中国的口粮消费总量中，小麦占43%左右。近年来，世界人口增长以及人们生活水平不断提高，粮食需求持续增长，与此同时，耕地逐渐减少、水资源不足、小麦病害频发、生态环境恶化、自然灾害频发，以及饲料用粮和生物燃料耗粮增加等给世界粮食供给带来了严峻的挑战，小麦生产在粮食安全的地位日益重要。
花药培养是利用植物组织培养技术，把发育到一定阶段的花药，通过无菌操作技术，接种在人工培养基上以改变花药内花粉粒的发育程序，诱导其分化，并连续进行有丝分裂，形成细胞团，进而形成一团无分化的薄壁组织-愈伤组织，或分化成胚状体，随后使愈伤组织分化成完整的植株的过程，因此花药培养育种也叫单倍体育种。
与传统的育种方法相比，单倍体育种可以缩短育种时间提高选择效率，其产生的加倍单倍体（DH）植株也是进行遗传转化和进行构建分子标记群体的良好材料。从20世纪70年代以来，单倍体育种技术已广泛的用于小麦育种，至今已培育出许多优良品种，是小麦育种的有效途径之一，而且单倍体诱导可以与分子标记和遗传操作技术相结合用于作物的遗传改良研究。
尽管小麦小孢子培养近几年已取得很大进展，但花药培养技术简单，仍是目前诱导单倍体的主要途径。小麦花药培养虽然已进行过大量的研究，并建立了花培育种体系，但目前仍存在诱导率低、群体小、效率还比较低的问题，不能满足育种的需求，花药培养目前仍处于边研究边应用状况。因此，不断改进和优化培养方法，提高花药培养效率对小麦花培育种技术在育种中的广泛应用是十分必要的。
现阶段花培育种在花药培养方法上仍存在着工作量大、工作效率低的矛盾，限制了花培技术在育种中的更广泛的应用。如何提高工作效率、加快选择效率、缩短育种周期、创新种质材料、配合其它生物技术的应用，快速获得纯系，充分利用花培技术在基础理论研究和育种应用研究的雄厚基础，成为我们迫切需要解决的问题。多年的实践经验发现，花培工作效率低的最重要的原因是花培操作方法的局限性。剪颖抖药法是目前花药分离最普遍的操作方法，然而，剪颖和抖药过程既需要专业组培操作，又需要消耗大量的劳动，成为花培操作的限速步骤。如何快捷分离小麦花药，并且保证分离后小麦花药维持活力且无污染适宜离体培养，是解决花培操作低效的关键。
离心机是利用离心力，分离液体与固体颗粒或液体与液体的混合物中各组分的机械。离心机主要用于将悬浮液中的固体颗粒与液体分开，或将乳浊液中两种密度不同又互不相溶的液体分开。利用不同密度或粒度的固体颗粒在液体中沉降速度不同的特点，有的沉降离心机还可对固体颗粒按密度或粒度进行分级。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有花药离体培养操作方法的专业操作要求高且耗时耗力的缺陷，提供一种提高操作量、工作效率高的高效的小麦花培方法。
本发明的目的是通过以下技术方案解决的：
一种高效的小麦花培方法，其特征在于：所述花培方法的步骤如下：
（1）取穗及预处理；
（2）对预处理后的麦穗进行灭菌；
（3）在无菌条件下将麦穗进行机械分割，切碎的麦穗倒入离心管中密封后震荡；
（4）将初步震荡后的离心管放入高速冷冻离心机中，离心获得离体花药；
（5）对离体花药进行接种和诱导培养出花药愈伤组织；
（6）分化、继代与移栽，完成该花培过程。
所述花培方法的详细步骤如下：
（1）取穗及预处理：
取穗时间一般选择晴天上午9:00-11: 00，取材后，用75%乙醇表面消毒，然后湿润的纱布包裹整个麦穗，保持麦穗湿润，放到冰箱中，在3-5℃下低温预处理2-5天；
（2）对预处理后的麦穗进行灭菌：
预处理后，剪下麦穗，将麦穗浸泡于75%的酒精中处理2～3min，然后将该麦穗转移于超净工作台中，用消毒过的纱布包裹麦穗后用浓度为0.1%的升汞灭菌并间或摇动，无菌水漂洗3～4次；
（3）在无菌条件下将麦穗进行机械分割，切碎的麦穗倒入离心管中密封后震荡：
在无菌条件下将麦穗进行机械分割，将20-30g切碎的麦穗倒入含有60-80ml蔗糖溶液的100毫升离心管中，盖上离心管盖并用保鲜膜将离心管盖头位置紧紧封闭，从超净工作台中取出离心管，置于摇床上300-400rpm震荡8-10min；
（4）将初步震荡后的离心管放入高速冷冻离心机中，离心获得离体花药：
将离心管放入高速冷冻离心机中离心，完成后然后轻轻取出离心管，可发现破碎的颖壳和支梗沉降到离心管底部，而花药漂浮在液面，将离心管轻轻放回超净工作台中，无菌操作，轻轻撕开保险膜，打开离心管盖，将上层花药倒入盛有已灭菌的蔗糖溶液容器；
（5）对离体花药进行接种和诱导培养出花药愈伤组织：
用灭菌过的合适孔径的网筛勺搅动蔗糖溶液，使花药均匀分散，然后舀出，使得花药均匀分散到网筛勺上，控出液滴，将花药磕到装有诱导培养基的培养瓶内， 27-29℃暗培养，诱导愈伤组织；
（6）分化、继代与移栽，完成该花培过程：
待花药愈伤组织直径1.0-1.5cm后，转接于分化培养基上光培养，分化出花培幼苗，待花培苗苗高达到3cm后转接于生根培养基进行继代培养，待花培苗长至8cm后移栽至周转箱壮苗，15～20天后移栽入大田。
所述步骤（1）中的取穗以小孢子发育处于单核靠边期的孕穗期小麦幼穗为标准取穗。
所述步骤（2）中的0.1%的升汞灭菌时间为10-12min。
所述步骤（3）中的麦穗进行机械分割的距离是4.0-4.4mm/段。
所述步骤（4）中的离心机参数设置为：离心转速12000-14000rpm，离心时间8-10分钟，离心温度10-20℃。
所述步骤（3）和（4）中的蔗糖溶液的质量分数为18%。
所述步骤（5）中的合适孔径的网筛勺的孔径为36-42目。
所述步骤（6）中的光培养的条件为：温度27～29℃，光照强度1500-2000lx、光周期12h/暗12h。
本发明相比现有技术有如下优点：
本发明通过创造性地对小麦花药采取机械切割的方式进行破碎，然后根据具体需要采用不同大小的离心力对碎片进行分离，成功提取到了纯净的小麦花药，并通过优化离心介质和采用无菌操作，成功获取到了活力旺盛的小麦花药并进一步花培成功，获得了健壮的花培苗；提高操作量的同时大大提升了花培工作效率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
本发明提供的高效的小麦花培方法的详细技术方案为：
（1）取穗及预处理：
取穗以小孢子发育处于单核靠边期的孕穗期小麦幼穗为标准取穗，取穗时间一般选择晴天上午9:00-11: 00，取材后，用75%乙醇表面消毒，然后湿润的纱布包裹整个麦穗，保持麦穗湿润，放到冰箱中，在3-5℃下低温预处理2-5天；
（2）对预处理后的麦穗进行灭菌：
预处理后，剪下麦穗，将麦穗浸泡于75%的酒精中处理2～3min，然后将该麦穗转移于超净工作台中，用消毒过的纱布包裹麦穗后用浓度为0.1%的升汞灭菌10-12min并间或摇动，无菌水漂洗3～4次；
（3）在无菌条件下将麦穗进行机械分割，切碎的麦穗倒入离心管中密封后震荡：
在无菌条件下将麦穗按照4.0-4.4mm/段的距离进行机械分割，将20-30g切碎的麦穗倒入含有60-80ml质量分数为18%的蔗糖溶液的100毫升离心管中，盖上离心管盖并用保鲜膜将离心管盖头位置紧紧封闭，从超净工作台中取出离心管，置于摇床上300-400rpm震荡8-10min；
（4）将初步震荡后的离心管放入高速冷冻离心机中，离心获得离体花药：
将离心管放入高速冷冻离心机中离心，离心机参数设置为：离心转速12000-14000rpm，离心时间8-10分钟，离心温度10-20℃，完成后然后轻轻取出离心管，可发现破碎的颖壳和支梗沉降到离心管底部，而花药漂浮在液面，将离心管轻轻放回超净工作台中，无菌操作，轻轻撕开保险膜，打开离心管盖，将上层花药倒入盛有已灭菌的质量分数为18%的蔗糖溶液容器；
（5）对离体花药进行接种和诱导培养出花药愈伤组织：
用灭菌过的孔径为36-42目的网筛勺搅动蔗糖溶液，使花药均匀分散，然后舀出，使得花药均匀分散到网筛勺上，控出液滴，将花药磕到装有诱导培养基的培养瓶内， 27-29℃暗培养，诱导愈伤组织；
（6）分化、继代与移栽，完成该花培过程：
待花药愈伤组织直径1.0-1.5cm后，转接于分化培养基上光培养，光培养的条件为温度27～29℃、光照强度1500-2000lx、光周期12h/暗12h，分化出花培幼苗，待花培苗苗高达到3cm后转接于生根培养基进行继代培养，待花培苗长至8cm后移栽至周转箱壮苗，15～20天后移栽入大田。
实施例一
为说明本发明的高效的小麦花培方法中所采用的蔗糖溶液浓度是适合维持花药生命力，我们进行设置了不同的蔗糖溶液浓度来观察花粉细胞的质壁分离现象。
为使分离用的蔗糖溶液浓度接近小麦花药的渗透压，防止花药吸水膨胀或失水萎焉，维持花药内花粉生命力，我们测试了对花粉细胞等渗的蔗糖溶液浓度，采用不同浓度的蔗糖溶液浸泡分离的花粉，浸泡时间均为4小时，观察花粉细胞的质壁分离现象，结果如下表一。
根据表一实验结果，由于小麦花粉细胞外有细胞壁，无法观察到吸水现象，然而18%浓度的蔗糖溶液是小麦花粉细胞不失水的最大浓度，因此我们推断18%的蔗糖溶液最接近小麦花粉细胞的渗透压，又由于蔗糖对花药无损伤，而且分离后的小麦花药亦需接种到高浓度的蔗糖培养基上诱导培养，因此选择18%浓度的蔗糖溶液作为花药离心的介质溶液，不会造成花粉细胞失水或吸水，能够有效维持花粉细胞的生命力。
实施例二
为说明本发明的高效的小麦花培方法中所采用的最适离心力是适合花药分离需求的，我们设置了不同的离心转速来观察离心效果。
由于不同的小麦组织器官由于密度大小不同，具有不同的沉降系数；为寻找出能有效分离小麦花药所需的最适离心力，我们将4.0-4.4mm/段机械分割后的碎麦穗加入18%蔗糖溶液后置于摇床上300-400rpm震荡8-10min，然后采用不同转速的离心力进行离心分离（20℃，8min），观测离心结果，如表二。
由表二可以发现，采用12000-14000rpm转速离心能有效分离出破碎小麦穗中的颖壳和支梗杂质，从小麦穗碎片中离心分离出纯净的小麦花药，对机械分割后的小麦穗碎片14000rpm 8min离心后，能够清晰的发现小麦花药被分离出来。
实施例三
为说明本发明提供的高效的小麦花培方法的创造性，现将本发明获得的小麦花药和常规抖药法分离的小麦花药进行同样的诱导培养，比较二者诱导率差异，结果如表三。
由表三可以发现，本发明提供的技术分离的小麦花药愈伤诱导率与抖药法分离的小麦花药愈伤诱导率并无显著性差异，因此能够说明，采用本技术方法分离花药能够较好的维持分离花药的生命力，适用于进一步接种培养之用。将采用本技术路线分离出的小麦花药进行诱导培养出优良的花药愈伤组织，进一步分化培养，能够分化出生长旺盛的花培幼苗。
本发明通过创造性地对小麦花药采取机械切割的方式进行破碎，然后根据具体需要采用不同大小的离心力对碎片进行分离，成功提取到了纯净的小麦花药，并通过优化离心介质和采用无菌操作，成功获取到了活力旺盛的小麦花药并进一步花培成功，获得了健壮的花培苗；提高操作量的同时大大提升了花培工作效率。
以上实施例仅为说明本发明的技术思想，不能以此限定本发明的保护范围，凡是按照本发明提出的技术思想，在技术方案基础上所做的任何改动，均落入本发明保护范围之内；本发明未涉及的技术均可通过现有技术加以实现。