本发明涉及河蚬的多倍体繁育方法，具体涉及河蚬雄性四倍体纯系高效育成方法。
背景技术：
河蚬，俗称河蚬、黄蚬等，属双壳纲，广泛分布于除南极洲外各大洲水域。壳厚而坚，外形圆形或近三角形。食用可补肝，亦为鱼类、禽类的饵料，并可做为农田肥料。河蚬3月龄(壳长1.1～1.2cm)达性成熟，雄雌异体(偶有雄雌同体)，分批成熟、分批产卵类型，体外受精。因河蚬三倍体的不育特征，使其在生长速度、抗病性、肉质等方面表现出更为显著的优势。现有技术中，要获得三倍体不育河蚬，最快捷有效的方法是通过四倍体河蚬与二倍体河蚬倍间杂交获得，那么就需要建立遗传稳定、纯度极高的四倍体河蚬纯系。但在河蚬的遗传育种中，到目前为止还未见四倍体全雄河蚬高效育成的报道。
技术实现要素：
针对上述现有技术存在的不足，本发明的目的是提供一种方法稳定、种群纯度高达100%的河蚬雄性四倍体纯系高效育成方法。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
河蚬雄性四倍体纯系高效育成方法，包括如下步骤：
（1）他莫昔芬喂养料的配备：取纯度为95%以上的他莫昔芬粉剂，加入到河蚬人工饲养饲料中，制成喂养料，其中他莫昔芬含量为10～20g/500g喂养料，待用；
（2）投喂：在母蚬产卵前5～10天，按常规饲料投喂方法对母蚬进行投喂他莫昔芬喂养料，每天两次，早上8：00每100g母蚬投喂10～20g，下午6：00每100g母蚬投喂10～15g；至其卵发育成熟，然后，取公蚬放在一起，使其自然产卵受精，得受精卵，备用；
（3）冷休克+静水压处理：在一次卵裂时，采用冷休克与静水压相结合的方法，把步骤（2）中的受精卵放入温度为-1～1.0℃的冷水中，静水压压力为180～300Kg/cm2，持续时间为3～5min；
（4）雌激素抑制剂溶液的配制：将氯米芬和睾酮一起溶于80%～90%的乙醇中，再加蒸馏水配制成雌激素抑制剂溶液，其中雌激素抑制剂溶液中氯米芬的浓度为80～140mg/l，睾酮的浓度为20～80mg/l；
（5）取步骤（3）处理后的受精卵放入按步骤（4）所制备的雌激素抑制剂溶液中，常温浸泡10～30s，然后取出放于孵化池中正常孵化，至受精卵的胚体在担轮幼体期之后脱膜，脱膜后进入面盘幼体期；
（6）取步骤（5）中的面盘幼体，投喂氯米芬幼体料；配比量为每kg幼体料加10～15g氯米芬，投喂量为每万只10～20g加有氯米芬的幼体料，直至结束浮游生活后沉入水底；从而获得100%雄性河蚬四倍体纯系。
本发明的优点：1、本发明中对母本进行添加他莫昔芬饲料投喂，起到抑制DNA分裂和促雄性的双重作用的同时，将受精卵第一次卵裂的时间推迟了3～5min，并提高所有受精卵第一次卵裂的同步程度（可达99%），为操作下一步提供时间保障和奠定染色体加倍基础；2、在受精卵第一次卵裂采用冷休克与较低的静水压（低于常用350kg/cm2）和较短的处理时间（低于5min），不仅有效减少了冷休克时间过程、压力过高对受精卵的破坏程度，提高受精卵的成活率；而且降低了操作难度和加压成本；3、雌激素抑制剂溶液浸泡，再一次强化雄性转化率；4、投喂氯米芬幼体料，有效保证雄性的转化率。因而通过此方法，可获得100%的河蚬雄性四倍体纯系。此方法，不仅有效地育成河蚬的四倍体，而且提高了四倍体的育成率与出苗率；为生产三倍体不育鱼奠定了坚实的基础。
具体实施方式
现结合具体实施例，对本发明作进一步描述。
实施例一
河蚬雄性四倍体纯系高效育成方法，包括如下步骤：
（1）他莫昔芬喂养料的配备：取纯度为95%以上的他莫昔芬粉剂，加入到河蚬人工饲养饲料中，制成喂养料，其中他莫昔芬含量为15g/500g喂养料，待用；
（2）投喂：在母蚬产卵前5天，按常规饲料投喂方法对母蚬进行投喂他莫昔芬喂养料，每天两次，早上8：00每100g母蚬投喂10g，下午6：00每100g母蚬投喂10g；至其卵发育成熟，然后，取公蚬放在一起，使其自然产卵受精，得受精卵，备用；
（3）冷休克+静水压处理：在一次卵裂前3～5min，采用冷休克与静水压相结合的方法，把步骤（2）中的受精卵放入温度为0℃的冷水中，静水压压力为300Kg/cm2，持续时间为3min；
（4）雌激素抑制剂配制：将氯米芬和睾酮一起溶于80%的乙醇中，再加蒸馏水配制成雌激素抑制剂溶液，其中雌激素抑制剂溶液中氯米芬的浓度为120mg/l，睾酮的浓度为60mg/l；
（5）取步骤（3）处理后的受精卵放入按步骤（4）所制备的雌激素抑制剂溶液中，常温浸泡30s，然后取出放于孵化池中正常孵化，至受精卵的胚体在担轮幼体期之后脱膜，脱膜后进入面盘幼体期；
（6）取步骤（5）中幼体，投喂氯米芬幼体料；配比量为每kg幼体料加15g氯米芬，投喂量为每万只20g氯米芬的幼体料，直至结束浮游生活后沉入水底；从而获得100%雄性河蚬四倍体纯系。
实施例二
河蚬雄性四倍体纯系高效育成方法，包括如下步骤：
（1）他莫昔芬喂养料的配备：取纯度为95%以上的他莫昔芬粉剂，加入到河蚬人工饲养饲料中，制成喂养料，其中他莫昔芬含量为20g/500g喂养料，待用；
（2）投喂：在母蚬产卵前10天，按常规饲料投喂方法对母蚬进行投喂他莫昔芬喂养料，每天两次，早上8：00每100g母蚬投喂20g，下午6：00每100g母蚬投喂15g；至其卵发育成熟，然后，取公蚬放在一起，使其自然产卵受精，得受精卵，备用；
（3）冷休克+静水压处理：在一次卵裂时，采用冷休克与静水压相结合的方法，把步骤（2）中的受精卵放入温度为-1℃的冷水中，静水压压力为220Kg/cm2，持续时间为3min；
（4）雌激素抑制剂配制：将氯米芬和睾酮一起溶于80%的乙醇中，再加蒸馏水配制成雌激素抑制剂溶液，其中雌激素抑制剂溶液中氯米芬的浓度为140mg/l，睾酮的浓度为80mg/l；
（5）取步骤（3）处理后的受精卵放入按步骤（4）所制备的雌激素抑制剂溶液中，常温浸泡10s，然后取出放于孵化池中正常孵化，至受精卵的胚体在担轮幼体期之后脱膜，脱膜后进入面盘幼体期；
（6）取步骤（5）中的面盘幼体，投喂氯米芬幼体料；配比量为每kg幼体料加10g氯米芬，投喂量为每万只10g加有氯米芬的幼体料，直至结束浮游生活后沉入水底；从而获得100%雄性河蚬四倍体纯系。
上述两个实施例仅为本发明的优选方案之二，并不能限制本发明的保护范围，任意与本发明等同或相似的技术手段视为本发明的保护范围。以下附上本发明部分处理方式及结果统计。
附：河蚬雄性四倍体育成结果统计
注：上述结果是在河蚬产卵前10天投喂他莫昔芬，静水压处理3分钟，雌激素抑制剂常温浸泡10s，每万尾投喂氯米芬0.1g所取得的结果。