一种建立农杆菌介导的宽叶不死鸟转染体系的方法与流程

文档序号:11781075阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种建立农杆菌介导的宽叶不死鸟转染体系的方法,其特征在于,所述方法包括以下步骤:

步骤(1)宽叶不死鸟组织培养:摘取带宽叶不死鸟的小芽,进行清洗灭菌;将清洗灭菌后的小芽接种到SH基础培养基中进行光照培养;将长至3~5cm高的苗整株取出,切成小段,每段带有一个叶节,然后把叶节接入SH基础培养基中,进行扩繁培养得到宽叶不死鸟幼苗;

步骤(2)侵染和共培养:将扩繁培养后的宽叶不死鸟幼苗取出,并将叶片剥下,沿主叶脉方向将叶片切为2-3截,放入无菌三角瓶;加入农杆菌菌液进行侵染;结束后将叶片取出,滤去菌液,待叶片晾干后接种到垫有滤纸的共培养基中进行共培养;

步骤(3)筛选和分离抗性苗:共培养结束后,将叶片转接到筛选培养基上进行筛选培养,部分活下来并分化出小芽;将小芽转接到抗性苗培养基中进行抗性苗分离培养;然后将分离出的抗性苗再转接到新的抗性苗培养基中进行抗性苗生长培养;

所述筛选培养基由以下成分组成:SH基础配方、2,4-D 0.1~1.2mg/L、NAA 0.1~1.0mg/L、6-BA0.3~0.9mg/L、蔗糖20~60g/L、Hyg 10~40mg/L、carb 250~750mg/L、cef 250~750mg/L、琼脂8~16g/L;

步骤(4)验证:提取获得的抗性苗的叶片的DNA,进行PCR扩增,将PCR产物进行凝胶电泳,得到农杆菌成功侵染宽叶不死鸟的阳性苗,即农杆菌介导的宽叶不死鸟转染体系。

2.如权利要求1所述的建立农杆菌介导的宽叶不死鸟转染体系的方法,其特征在于,步骤(1)所述宽叶不死鸟叶片清洗灭菌操作如下:用流水冲洗除去叶片表面的灰尘和泥土,使用75%酒精消毒50~70s,用无菌水涮洗3~5次,转移到无菌培养瓶中,加入0.1~0.2%的升汞消毒3~5min,升汞倒回原来的瓶中,最后用无菌水洗5-7次。

3.如权利要求1所述的建立农杆菌介导的宽叶不死鸟转染体系的方法,其特征在于,步骤(1)所述SH基础培养基的成分如下:SH基础配方+琼脂8~16g·L-1+蔗糖20~60g·L-1;pH5.2~5.8,118~125℃高温灭菌20~30min;

所述SH基础配方成分如下:硝酸钾2.5~5.0g·L-1,硫酸镁0.195~0.4g·L-1,磷酸二氢铵0.3~0.6g·L-1,氯化钙151~300mg·L-1,甘氨酸2~4mg·L-1,肌醇100~200mg·L-1,盐酸硫胺素0.4~0.8mg·L-1,盐酸吡哆素0.5~1.0mg·L-1,烟酸0.5~1.0mg·L-1,乙二胺四乙酸铁纳19.8~40mg·L-1,六水氯化钴0.1~0.2mg·L-1,五水硫酸铜0.2~0.4mg·L-1,硼酸5~10mg·L-1,碘化钾1~2mg·L-1,一水硫酸锰10~20mg·L-1,二水钼酸钠0.1~0.2mg·L-1,七水硫酸锌1~2mg·L-1

4.如权利要求1所述的建立农杆菌介导的宽叶不死鸟转染体系的方法,其特征在于,步骤(1)所述光照培养的条件如下:光照强度1500~2500lx,每天光照12~14h,22~26℃培养15~20天。

5.如权利要求1所述的建立农杆菌介导的宽叶不死鸟转染体系的方法,其特征在于,步骤(1)所述扩繁培养的条件如下:光照强度1500~2500lx,每天光照12~14h,22~26℃培养15~20天。

6.如权利要求1所述的建立农杆菌介导的宽叶不死鸟转染体系的方法,其特征在于,步骤(2)所述含有AS的农杆菌菌液的OD600为0.4~1.8,AS终浓度为100~500μmol/L;侵染期间将叶片与含有AS的农杆菌菌液轻轻摇匀,静置1~2h,静置过程中采用0.5~0.9MPa真空处理40~80min。

7.如权利要求1所述的建立农杆菌介导的宽叶不死鸟转染体系的方法,其特征在于,步骤(2)所述共培养培养基由以下成分组成:SH基础配方、2,4-D 0.1~0.9mg/L、NAA 0.2~1.0mg/L、6-BA 1.0~3.0mg/L、蔗糖20~50g/L、葡萄糖10~50g/L、200~500ul/L AS、琼脂8~16g/L;所述共培养的条件为:22~26℃暗培养3~5天。

8.如权利要求1所述的建立农杆菌介导的宽叶不死鸟转染体系的方法,其特征在于,步骤(3)所述筛选培养条件如下:光照强度1500~2500lx,每天光照12~14h,22~26℃培养15~20天。

9.如权利要求1所述的建立农杆菌介导的宽叶不死鸟转染体系的方法,其特征在于,步骤(3)所述抗性苗培养基由以下成分组成:SH基础配方、蔗糖30~60g/L、carb 250~750mg/L、cef250~750mg/L、琼脂8~16g/L。

10.如权利要求1所述的建立农杆菌介导的宽叶不死鸟转染体系的方法,其特征在于,步骤(3)所述抗性苗分离培养的条件:当抗性苗长到2mm长度,就可以进行分离培养;

抗性苗生长培养的条件为:光照强度1500~2500lx,每天光照12~14h,22~26℃光照培养15~20天。

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