本发明涉及一种培养基及其应用，具体涉及一种雪胆快繁培养基及其应用，属于农业高新技术领域。
背景技术：
雪胆为葫芦科雪胆属植物，该属植物据目前了解约有20多种，主要产于我国西南地区。其性味苦、性寒，传统药用使用量较少，野生资源较为丰富。但随着医学的发展，研究发现雪胆具有清热解毒，消炎止痛的功效。常用于胃痛，溃疡病，上呼吸道感染，支气管炎，肺炎，细菌性痢疾，肠炎，泌尿系感染，败血症及其他多种感染。近年来雪胆素片、雪胆胃肠丸、雪胆素胶囊、雪胆解毒丸等雪胆粗提物或复方制剂广泛用于临床，雪胆资源不断得到开发利用，野生资源遭到过度采挖，同时因雪胆分布区域狭窄，易受人为因素干扰，种群稳定性低，繁殖力不高，部分区域雪胆资源已濒临灭绝或完全绝种。
现有技术人工繁殖雪胆的方法主要有藤蔓扦插、种子栽培、组织培养等。藤蔓扦插法受季节限制，而且由于雪胆本身资源不够丰富，其母本数量不多，造成扦插繁殖的速度慢。雪胆种子富含脂肪及种皮较厚，播种前须砂藏处理，雪胆经砂藏后的种子发芽率可达20～40％，干贮种子播种后2～3年才能出苗，发芽率在5％以下，出苗周期漫长、发芽率低。雪胆的组织培养是采用人工配置的培养液，在适宜的温度环境条件下，对雪胆进行快繁诱导，可缩短培育时间，但现有技术在快繁诱导过程中易造成雪胆种苗发生无性变异，且现有技术中的快繁培养基存在组织诱导率低、诱导苗质量差、多弱苗和幼苗增殖效率低、幼苗移栽成活率低等问题。实验表明，由现有技术快繁培养基培育得到的雪胆中雪胆素和雪胆皂甙的含量与野生雪胆相差较大。
技术实现要素：
基于现有技术的不足，本发明的第一方面的目的是提供一种雪胆快繁培养基。所述一种雪胆快繁培养基分为三种，分别在快繁培养的不同阶段使用，为：愈伤组织培养基、嫩芽培养基和生根培养基。
所述愈伤组织培养基的组成成分为：KNO3 800～1300mg/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺800～1200mg/L，KH2PO4 300～450mg/L，CaCl2·2H2O 320～350mg/L，MgSO4·7H2O 180～240mg/L，EDTA 120～180mg/L，FeSO4·7H2O 30～50mg/L，MnSO4·4H2O 50～80mg/L，ZnSO4·7H2O 15～30mg/L，H3BO3 8～10mg/L，KI 5～10mg/L，Na2MoO4·2H2O 1～5mg/L，CoCl2·6H2O 0.2～0.5mg/L，4-碘苯氧乙酸0.15～0.20mg/L，肌醇30～80mg/L，甘氨酸0.5～1.0mg/L，维生素B1 0.5～0.75mg/L，维生素B6 1.0～1.5mg/L，烟酸1.0～1.5mg/L，蔗糖30～50g/L，琼脂10～15g/L，激动素KT 0.5～1.0mg/L，萘乙酸NAA0.3～0.4mg/L，山梨醇50～70g/L，生物素0.15～0.20mg/L，盐酸吡哆醇0.5～1.0mg/L，盐酸硫胺素0.5～1.0mg/L，甲基亚硝基脲1.5～2.0mg/L，吲哚丁酸1.5～2.0mg/L，丙氨酸5～10mg/L，叶酸5～10mg/L，调环酸钙1.5～2.0mg/L，秋水仙碱1.5～2.0mg/L，水解蛋白0.75～1.5g/L，吲哚-3-乙酸IAA 0.30～0.55mg/L，甲基茉莉酸0.05～0.11mg/L，复酞核酸4.5～8.5mg/L，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷300～600mg/L，植物硫化激动素PSK-α0.1～0.2mg/L，胰岛素2.0～4.0mg/L，赤霉素GA3 0.6～1.2mg/L。
所述嫩芽培养基的组成成分在所述愈伤组织培养基基础上添加了吲哚丁酸0.5～2.0mg/L和2,4-二氯苯氧乙酸丁酯1.5～2.0mg/L。
所述生根培养基的组成成分在所述嫩芽培养基基础上添加了6-苄氨基嘌呤1.5～2.0mg/L。
进一步地，所述愈伤组织培养基的组成成分为：
KNO3 900mg/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺1000mg/L，KH2PO4 360mg/L，CaCl2·2H2O 340mg/L，MgSO4·7H2O 190mg/L，EDTA 150mg/L，FeSO4·7H2O 40mg/L，MnSO4·4H2O 60mg/L，ZnSO4·7H2O 20mg/L，H3BO3 9mg/L，KI 8mg/L，Na2MoO4·2H2O 3mg/L，CoCl2·6H2O 0.3mg/L，4-碘苯氧乙酸0.18mg/L，肌醇50mg/L，甘氨酸0.8mg/L，维生素B1 0.65mg/L，维生素B6 1.3mg/L，烟酸1.1mg/L，蔗糖40g/L，琼脂12g/L，激动素KT 0.8mg/L，萘乙酸NAA0.35mg/L，山梨醇60g/L，生物素0.18mg/L，盐酸吡哆醇0.8mg/L，盐酸硫胺素0.8mg/L，甲基亚硝基脲1.6mg/L，吲哚丁酸1.6mg/L，丙氨8mg/L，叶酸8mg/L，调环酸钙1.7mg/L，秋水仙碱1.8mg/L，水解蛋白0.85g/L，吲哚-3-乙酸IAA 0.45mg/L，甲基茉莉酸0.05mg/L，复酞核酸5mg/L，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷320mg/L，植物硫化激动素PSK-α0.12mg/L，胰岛素2.6mg/L，赤霉素GA3 0.8mg/L。
本发明的第二方面的目的是提供一种雪胆快繁培养基在雪胆快繁方面的应用。具体步骤如下：
(1)雪胆茎预处理：
选取雪胆块茎组织培育的幼苗茎段，即雪胆茎，在4℃环境中冷藏3～5天后，将雪胆茎取出自然恢复至室温，用纯净水冲洗，先在0.05％的升汞水溶液中消毒5～8min，再用70％的酒精消毒20～40s，之后用无菌水冲洗3次，即得雪胆外植体。以上涉及的百分比均为体积百分比。
(2)外植体接种及诱导培养：
将雪胆外植体移入到灭菌后的所述愈伤组织培养基中，将温度设定为23±1℃，以蓝光灯为光源，光照强度控制为400～800Lx，光周期控制为光14h/暗10h，10天左右诱导出愈伤组织。
(3)转移诱导培养：
将步骤(2)得到的愈伤组织转移到嫩芽培养基，温度为27±1℃，以荧光灯为光源，光照强度控制为1800～2500Lx，光周期控制为光14h/暗10h，14天愈伤组织诱导出嫩芽后，将嫩芽从外植体上完整地切下，转移到生根培养基内继续以相同的条件培养至形成雪胆幼苗。
(4)幼苗的驯化与炼苗：
将雪胆幼苗移栽到炼苗基质中，并逐步转移到外部环境中，在幼苗适应外部环境正常生长后，再移栽至普通土壤中正常培养。
所述逐步转移到外部环境中的方法为：将雪胆幼苗移栽到炼苗基质后，从诱导环境中逐天降低温度并逐天增加光照强度，至与外部环境相同时，再培养2～3天即可移栽至普通土壤中，转移过程的周期根据室外环境不同而调节，转移过程的周期持续10～15天。
所述炼苗基质的组成成分为：珍珠岩、蛭石、锯末、松树皮、水苔、花泥、泥炭土以及钙镁磷钾肥，质量比为1:0.5～1.5:0.2～0.8:0.2～0.8:0.1～0.5:0.05～0.15:0.05～0.15:0.005～0.015，优选质量比为1:1:0.5:0.5:0.3:0.1:0.1:0.01。
本发明中，所述雪胆为滇西雪胆、中华雪胆、丽江雪胆、曲莲、大籽雪胆、独江龙雪胆、椭圆果雪胆、大花雪胆、文山雪胆、长果雪胆、巨花雪胆、峨眉山雪胆、帽果雪胆、十一叶雪胆、浙江雪胆中的一种。
进一步地，所述雪胆为独江龙雪胆或大花雪胆。
本发明涉及的一种雪胆快繁培养基及其应用，具有以下技术效果：
1、本发明涉及的培养基，在雪胆愈伤组织的诱导培养过程提供科学合理的营养，提高幼苗成苗率，本发明的雪胆幼苗平均成苗率达到75.1％。
2、本发明涉及的培养基减少雪胆快繁的培育周期。
3、本发明涉及的培育基克服了雪胆在快繁过程中的有效成分损失，经检测，运用本发明培养基及方法快繁得到的雪胆中雪胆素甲、雪胆素乙、雪胆皂甙的含量与野生雪胆的含量相当。
本发明的技术方案，提高雪胆幼苗的成苗率、缩短培育周期、保持野生雪胆的效用，在雪胆野生资源保存、保护、开发利用等方面具有应用前景。
具体实施方式
下面通过具体实施例，进一步对本发明的技术方案进行具体说明。应该理解，下面的实施例只是作为具体说明，而不限制本发明的范围，同时本领域的技术人员根据本发明所做的显而易见的改变和修饰也包含在本发明范围之内。
实施例1
一种雪胆快繁培养基，分别在快繁培养的不同阶段使用，为：愈伤组织培养基、嫩芽培养基和生根培养基。
愈伤组织培养基的组成成分为：KNO3 900mg/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺1000mg/L，KH2PO4 360mg/L，CaCl2·2H2O 340mg/L，MgSO4·7H2O 190mg/L，EDTA 150mg/L，FeSO4·7H2O 40mg/L，MnSO4·4H2O 60mg/L，ZnSO4·7H2O 20mg/L，H3BO3 9mg/L，KI 8mg/L，Na2MoO4·2H2O 3mg/L，CoCl2·6H2O 0.3mg/L，4-碘苯氧乙酸0.18mg/L，肌醇50mg/L，甘氨酸0.8mg/L，维生素B1 0.65mg/L，维生素B6 1.3mg/L，烟酸1.1mg/L，蔗糖40g/L，琼脂12g/L，激动素KT 0.8mg/L，萘乙酸NAA0.35mg/L，山梨醇60g/L，生物素0.18mg/L，盐酸吡哆醇0.8mg/L，盐酸硫胺素0.8mg/L，甲基亚硝基脲1.6mg/L，吲哚丁酸1.6mg/L，丙氨8mg/L，叶酸8mg/L，调环酸钙1.7mg/L，秋水仙碱1.8mg/L，水解蛋白0.85g/L，吲哚-3-乙酸IAA 0.45mg/L，甲基茉莉酸0.05mg/L，复酞核酸5mg/L，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷320mg/L，植物硫化激动素PSK-α0.12mg/L，胰岛素2.6mg/L，赤霉素GA3 0.8mg/L。
所述嫩芽培养基的组成成分在所述愈伤组织培养基基础上添加了吲哚丁酸0.5～2.0mg/L和2，4-二氯苯氧乙酸丁酯1.5～2.0mg/L。
所述生根培养基的组成成分在所述嫩芽培养基基础上添加了6-苄氨基嘌呤1.5～2.0mg/L。
所述雪胆快繁培养基在雪胆快繁方面的应用，具体步骤如下：
(1)雪胆茎预处理：
选取雪胆块茎组织培育的幼苗茎段，即雪胆茎，在4℃环境中冷藏3～5天后，将雪胆茎取出自然恢复至室温，用纯净水冲洗，先在0.05％的升汞水溶液中消毒5～8min，再用70％的酒精消毒20～40s，之后用无菌水冲洗3次，即得雪胆外植体。以上涉及的百分比均为体积百分比。
(2)外植体接种及诱导培养：
将外植体移入到灭菌后的所述愈伤组织培养基中，将温度设定为23±1℃，以蓝光灯为光源，光照强度控制为600Lx，光周期控制为光14h/暗10h，10天左右诱导出愈伤组织。
(3)转移诱导培养：
将步骤(2)得到的愈伤组织转移到嫩芽培养基，温度为27±1℃，以荧光灯为光源，光照强度控制为1800～2500Lx，光周期控制为光14h/暗10h，14天愈伤组织诱导出嫩芽后，将嫩芽从外植体上完整地切下，转移到生根培养基内继续以相同的条件培养至形成雪胆幼苗；
(4)幼苗的驯化与炼苗：
将雪胆幼苗移栽到炼苗基质后，从诱导环境中每天降低温度1℃，光照强度每天增加300Lx，至与外部环境相同时，再培养2～3天即可移栽至普通土壤中。
所述炼苗基质的组成成分为：珍珠岩、蛭石、锯末、松树皮、水苔、花泥、泥炭土以及钙镁磷钾肥，其质量比为1:1:0.5:0.5:0.3:0.1:0.1:0.01。
实施例2
一种雪胆快繁培养基，分别在快繁培养的不同阶段使用，为：愈伤组织培养基、嫩芽培养基和生根培养基。
所述愈伤组织培养基的组成成分为：KNO3 800mg/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺800mg/L，KH2PO4 300mg/L，CaCl2·2H2O 320mg/L，MgSO4·7H2O 180mg/L，EDTA 120mg/L，FeSO4·7H2O 30mg/L，MnSO4·4H2O 50mg/L，ZnSO4·7H2O 15mg/L，H3BO3 8mg/L，KI 5mg/L，Na2MoO4·2H2O 1mg/L，CoCl2·6H2O 0.2mg/L，4-碘苯氧乙酸0.15mg/L，肌醇30mg/L，甘氨酸0.5mg/L，维生素B1 0.5mg/L，维生素B6 1.0mg/L，烟酸1.0mg/L，蔗糖30g/L，琼脂10g/L，激动素KT 0.5mg/L，萘乙酸NAA0.3mg/L，山梨醇50g/L，生物素0.15mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.5mg/L，甲基亚硝基脲1.5mg/L，吲哚丁酸1.5mg/L，丙氨酸5mg/L，叶酸5mg/L，调环酸钙1.5mg/L，秋水仙碱1.5mg/L，水解蛋白0.75g/L，吲哚-3-乙酸IAA 0.30mg/L，甲基茉莉酸0.05mg/L，复酞核酸4.5mg/L，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷300mg/L，植物硫化激动素PSK-α0.1mg/L，胰岛素2.0mg/L，赤霉素GA3 0.6mg/L。
所述嫩芽培养基的组成成分在所述愈伤组织培养基基础上添加了吲哚丁酸0.5mg/L和2,4-二氯苯氧乙酸丁酯1.5mg/L。所述生根培养基的组成成分在所述嫩芽培养基基础上添加了6-苄氨基嘌呤1.5mg/L。
所述雪胆快繁培养基在雪胆快繁方面的应用，具体步骤如下：
(1)雪胆茎预处理：
选取雪胆块茎组织培育的幼苗茎段，即雪胆茎，在4℃环境中冷藏3～5天后，将雪胆茎取出自然恢复至室温，用纯净水冲洗，先在0.05％的升汞水溶液中消毒5～8min，再用70％的酒精消毒20～40s，之后用无菌水冲洗3次，即得雪胆外植体。以上涉及的百分比均为体积百分比。
(2)外植体接种及诱导培养：
将外植体移入到灭菌后的所述愈伤组织培养基中，将温度设定为23±1℃，以蓝光灯为光源，光照强度控制为400Lx，光周期控制为光14h/暗10h，10天左右诱导出愈伤组织。
(3)转移诱导培养：将步骤(2)得到的愈伤组织转移到嫩芽培养基，温度为27±1℃，以荧光灯为光源，光照强度控制为1800Lx，光周期控制为光14h/暗10h，14天愈伤组织诱导出嫩芽后，将嫩芽从外植体上完整地切下，转移到生根培养基内继续以相同的条件培养至形成雪胆幼苗。
(4)幼苗的驯化与炼苗：
将雪胆幼苗移栽到炼苗基质中，并逐步转移到外部环境中，在幼苗适应外部环境正常生长后，再移栽至普通土壤中正常培养。
所述逐步转移到外部环境中的方法为：将雪胆幼苗移栽到炼苗基质后，从诱导环境中每天降低温度1.5℃，光照强度每天增加400Lx，至与外部环境相同时，再培养2天即可移栽至普通土壤中。
所述炼苗基质的组成成分为：珍珠岩、蛭石、锯末、松树皮、水苔、花泥、泥炭土以及钙镁磷钾肥，质量比为1:0.5:0.2:0.2:0.1:0.05:0.05:0.005。
实施例3
一种雪胆快繁培养基，分别在快繁培养的不同阶段使用，为：愈伤组织培养基、嫩芽培养基和生根培养基。
所述愈伤组织培养基的组成成分为：KNO3 1300mg/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺1200mg/L，KH2PO4 450mg/L，CaCl2·2H2O 350mg/L，MgSO4·7H2O 240mg/L，EDTA 180mg/L，FeSO4·7H2O 50mg/L，MnSO4·4H2O 80mg/L，ZnSO4·7H2O 30mg/L，H3BO3 10mg/L，KI 10mg/L，Na2MoO4·2H2O 5mg/L，CoCl2·6H2O 0.5mg/L，4-碘苯氧乙酸0.20mg/L，肌醇80mg/L，甘氨酸1.0mg/L，维生素B1 0.75mg/L，维生素B6 1.5mg/L，烟酸1.5mg/L，蔗糖50g/L，琼脂15g/L，激动素KT 1.0mg/L，萘乙酸NAA 0.4mg/L，山梨醇70g/L，生物素0.20mg/L，盐酸吡哆醇1.0mg/L，盐酸硫胺素1.0mg/L，甲基亚硝基脲2.0mg/L，吲哚丁酸2.0mg/L，丙氨酸10mg/L，叶酸10mg/L，调环酸钙2.0mg/L，秋水仙碱2.0mg/L，水解蛋白1.5g/L，吲哚-3-乙酸IAA 0.55mg/L，甲基茉莉酸0.11mg/L，复酞核酸8.5mg/L，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷600mg/L，植物硫化激动素PSK-α0.2mg/L，胰岛素4.0mg/L，赤霉素GA3 1.2mg/L。
所述嫩芽培养基的组成成分在所述愈伤组织培养基基础上添加了吲哚丁酸2.0mg/L和2,4-二氯苯氧乙酸丁酯2.0mg/L。
所述生根培养基的组成成分在所述嫩芽培养基基础上添加了6-苄氨基嘌呤2.0mg/L。
所述雪胆快繁培养基在雪胆快繁方面的应用，具体步骤如下：
(1)雪胆茎预处理：
选取雪胆块茎组织培育的幼苗茎段，即雪胆茎，在4℃环境中冷藏3～5天后，将雪胆茎取出自然恢复至室温，用纯净水冲洗，先在0.05％的升汞水溶液中消毒5～8min，再用70％的酒精消毒20～40s，之后用无菌水冲洗3次，即得雪胆外植体。以上涉及的百分比均为体积百分比。
(2)外植体接种及诱导培养：
将外植体移入到灭菌后的所述愈伤组织培养基中，将温度设定为23±1℃，以蓝光灯为光源，光照强度控制为800Lx，光周期控制为光14h/暗10h，10天左右诱导出愈伤组织。
(3)转移诱导培养：
将步骤(2)得到的愈伤组织转移到嫩芽培养基，温度为27±1℃，以荧光灯为光源，光照强度控制为2500Lx，光周期控制为光14h/暗10h，14天愈伤组织诱导出嫩芽后，将嫩芽从外植体上完整地切下，转移到生根培养基内继续以相同的条件培养至形成雪胆幼苗；
(4)幼苗的驯化与炼苗：
将雪胆幼苗移栽到炼苗基质中，并逐步转移到外部环境中，在幼苗适应外部环境正常生长后，再移栽至普通土壤中正常培养。
所述逐步转移到外部环境中的方法为：将雪胆幼苗移栽到炼苗基质后，从诱导环境中逐天降低温度并逐天增加光照强度，至与外部环境相同时，再培养3天即可移栽至普通土壤中，转移过程的周期根据室外环境不同而调节，转移过程的周期持续15天。
所述炼苗基质的组成成分为：珍珠岩100g、蛭石150g、锯末80g、松树皮80g、水苔50g、花泥15g、泥炭土15g以及钙镁磷钾肥1.5g。