本发明涉及一种生物种质资源的保存方法，尤其涉及一种非洲菊种质资源的保存方法。
背景技术：
非洲菊是菊科大丁草属的多年生宿根常绿草本花卉，为世界五大切花之一，因其花大、花艳、花色全且瓶插寿命长，深受人们欢迎，在我国种植范围广泛。
由于非洲菊大多自交不孕，杂交后代会分裂和变异，遗传信息从亲代传给后代时由于栽培环境如光照、水分、温度、营养等原因会导致非洲菊的品种退化，失去原有的典型性，通常表现为花朵变小、过渡色多、花形紊乱、花秆变细、抗性降低、花期缩短等。
现有技术中，非洲菊的一种常规繁殖方法是采用分株法，但其繁殖系数低，不能满足大规模生产的需要，而且由于培养温度、增殖芽的继代代数以及激素浓度等因素易造成非洲菊种苗发生无性变异。
目前，非洲菊种质资源的保存大多以室内组培和田间栽培保存，室内组培保存的缺陷是继代培养周期较短，保种花费相对较大；而田间栽培保存的缺陷为占地面积多，光、温、水及病虫害控制较难，多年栽培形成土壤板结、盐渍化、病原菌大量积累，导致非洲菊品种失去原有的典型性。
技术实现要素：
基于现有技术的不足，本发明的目的是提供一种非洲菊种质资源的保存方法，能长时间保存非洲菊的种质资源。
具体步骤如下：
(1)花托外植体预处理：
选取直径1～2cm的花蕾，在4℃环境中冷藏3～5天后，将花蕾取出自然恢复至室温，剥去苞片和小花，用纯净水冲洗，先在0.05％的升汞水溶液中消毒5～8min，再用70％的酒精消毒20～40s，之后用无菌水冲洗3次，即得到非洲菊花托外植体。
以上涉及的百分比均为体积百分比。
(2)外植体接种及诱导培养：
将非洲菊花托外植体移入到灭菌后的第一培养基中，将温度设定为23±1℃，以蓝光灯为光源，光照强度控制为400～800Lx，光周期控制为光14h/暗10h，10天左右诱导出愈伤组织。
所述第一培养基的组成成分为：KNO3 800～1300mg/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺800～1200mg/L，KH2PO4 300～450mg/L，CaCl2·2H2O 320～350mg/L，MgSO4·7H2O 180～240mg/L，EDTA 120～180mg/L，FeSO4·7H2O 30～50mg/L，MnSO4·4H2O 50～80mg/L，ZnSO4·7H2O 15～30mg/L，H3BO3 8～10mg/L，KI 5～10mg/L，Na2MoO4·2H2O 1～5mg/L，CoCl2·6H2O 0.2～0.5mg/L，4-碘苯氧乙酸0.15～0.20mg/L，肌醇30～80mg/L，甘氨酸0.5～1.0mg/L，维生素B1 0.5～0.75mg/L，维生素B6 1.0～1.5mg/L，烟酸1.0～1.5mg/L，蔗糖30～50g/L，琼脂10～15g/L，激动素KT 0.5～1.0mg/L，萘乙酸NAA0.3～0.4mg/L，山梨醇50～70g/L，生物素0.15～0.20mg/L，盐酸吡哆醇0.5～1.0mg/L，盐酸硫胺素0.5～1.0mg/L，甲基亚硝基脲1.5～2.0mg/L，吲哚丁酸1.5～2.0mg/L，丙氨酸5～10mg/L，叶酸5～10mg/L，调环酸钙1.5～2.0mg/L，秋水仙碱1.5～2.0mg/L，水解蛋白2.0～2.5g/L。
(3)转移诱导培养：
将步骤(2)得到的愈伤组织转移到第二培养基，温度为27±1℃，以荧光灯为光源，光照强度控制为1800～2500Lx，光周期控制为光14h/暗10h，14天愈伤组织诱导出嫩芽。
所述第二培养基的组成成分在步骤(2)所述第一培养基基础上添加了吲哚丁酸0.5～2.0mg/L和2,4-二氯苯氧乙酸丁酯1.5～2.0mg/L。
(4)种质离体保存：
将嫩芽从非洲菊花托外植体上完整地切下，转移到第三培养基内慢速生长保存，保存环境为：温度为4±1℃，以荧光灯为光源，光照强度控制为300～500Lx，光周期控制为光8h/暗16h。若保存期限超过12个月，则进行继代培养1次，超过24个月，则进行继代培养2次，依次类推。
所述第三培养基的组成成分为：KNO3 800～1300mg/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺800～1200mg/L，KH2PO4 300～450mg/L，CaCl2·2H2O 320～350mg/L，MgSO4·7H2O 180～240mg/L，EDTA 120～180mg/L，FeSO4·7H2O 30～50mg/L，MnSO4·4H2O 50～80mg/L，ZnSO4·7H2O 15～30mg/L，H3BO3 8～10mg/L，KI 5～10mg/L，Na2MoO4·2H2O 1～5mg/L，CoCl2·6H2O 0.2～0.5mg/L，4-碘苯氧乙酸0.15～0.20mg/L，蔗糖30～50g/L，琼脂10～15g/L，山梨醇50～70g/L，二甲基亚砜8～10mg/L、甘油10～15g/L，萘乙酸NAA0.3～0.4mg/L。
(5)恢复培养：
将步骤(4)的嫩芽转移到第四培养基内，温度为27±1℃，以荧光灯为光源，光照强度控制为1800～2500Lx，光周期控制为光14h/暗10h，培养至形成非洲菊幼苗。
所述第四培养基的组成成分在步骤(3)所述第二培养基基础上添加了6-苄氨基嘌呤1.5～2.0mg/L。
(6)幼苗的驯化与炼苗：
将非洲菊幼苗移栽到炼苗基质中，并逐步转移到外部环境中，在幼苗适应外部环境正常生长后，再移栽至普通土壤中正常培养。
所述逐步转移到外部环境中的方法为：将非洲菊幼苗移栽到炼苗基质后，从诱导环境中逐天降低温度并逐天增加光照强度，至与外部环境相同时，再培养2～3天即可移栽至普通土壤中，转移过程的周期根据室外环境不同而调节，转移过程的周期持续10～15天。
所述炼苗基质的组成成分为：珍珠岩、蛭石、锯末、松树皮、水苔、花泥、泥炭土以及钙镁磷钾肥，质量比为1:0.5～1.5:0.2～0.8:0.2～0.8:0.1～0.5:0.05～0.15:0.05～0.15:0.005～0.015，优选质量比为1:1:0.5:0.5:0.3:0.1:0.1:0.01。
本发明涉及的一种非洲菊种质资源的保存方法，具有以下技术效果：
1、本发明显著提高非洲菊种质资源的离体保存效率，恢复培养的平均成活率达到99.5％。
2、诱导愈伤组织阶段用分段培养的方法，先采用蓝光照射再采用荧光照射，二者的结合大大缩短了愈伤组织的愈伤分化时间，提高了愈伤组织的形成数量与效率。
3、本发明优化了种质离体保存培养基配方，使现有技术对接种组织种质的一次保存期限由现有技术的6～8个月提高到12个月以上，并且通过保存期内的继代培养大大提高了非洲菊种质资源的保存时限。
具体实施方式
下面通过具体实施例，进一步对本发明的技术方案进行具体说明。应该理解，下面的实施例只是作为具体说明，而不限制本发明的范围，同时本领域的技术人员根据本发明所做的显而易见的改变和修饰也包含在本发明范围之内。
实施例1
一种非洲菊种质资源的保存方法，具体步骤如下：
(1)花托外植体预处理：
选取直径1～2cm的花蕾，在4℃环境中冷藏3天后，将花蕾取出自然恢复至室温，剥去苞片和小花，用纯净水冲洗，先在0.05％的升汞水溶液中消毒5min，再用70％的酒精消毒30s，之后用无菌水冲洗3次，即得到非洲菊花托外植体。
(2)外植体接种及诱导培养：
将非洲菊花托外植体移入到灭菌后的第一培养基中，将温度设定为23±1℃，以蓝光灯为光源，光照强度控制为600Lx，光周期控制为光14h/暗10h，10天左右诱导出愈伤组织。
所述第一培养基的组成成分为：KNO3 900mg/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺1000mg/L，KH2PO4 360mg/L，CaCl2·2H2O 340mg/L，MgSO4·7H2O 190mg/L，EDTA 150mg/L，FeSO4·7H2O 40mg/L，MnSO4·4H2O 60mg/L，ZnSO4·7H2O 20mg/L，H3BO3 9mg/L，KI 8mg/L，Na2MoO4·2H2O 3mg/L，CoCl2·6H2O 0.3mg/L，4-碘苯氧乙酸0.18mg/L，肌醇50mg/L，甘氨酸0.8mg/L，维生素B1 0.65mg/L，维生素B6 1.3mg/L，烟酸1.1mg/L，蔗糖40g/L，琼脂12g/L，激动素KT 0.8mg/L，萘乙酸NAA0.35mg/L，山梨醇60g/L，生物素0.18mg/L，盐酸吡哆醇0.8mg/L，盐酸硫胺素0.8mg/L，甲基亚硝基脲1.6mg/L，吲哚丁酸1.6mg/L，丙氨8mg/L，叶酸8mg/L，调环酸钙1.7mg/L，秋水仙碱1.8mg/L，水解蛋白2.2g/L。
(3)转移诱导培养：
将步骤(2)得到的愈伤组织转移到第二培养基，温度为27±1℃，以荧光灯为光源，光照强度控制为1800～2500Lx，光周期控制为光14h/暗10h，14天愈伤组织诱导出嫩芽。
所述第二培养基的组成成分在步骤(2)所述第一培养基基础上添加了吲哚丁酸1.5mg/L和2，4-二氯苯氧乙酸丁酯1.8mg/L。
(4)种质离体保存：
将嫩芽从非洲菊花托外植体上完整地切下，转移到第三培养基内慢速生长保存，保存环境为：温度为4±1℃，以荧光灯为光源，光照强度控制为400Lx，光周期控制为光8h/暗16h。保存期限超过12个月，进行继代培养1次。
所述第三培养基的组成成分为：KNO3 900mg/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺1000mg/L，KH2PO4 360mg/L，CaCl2·2H2O 340mg/L，MgSO4·7H2O 190mg/L，EDTA 150mg/L，FeSO4·7H2O 40mg/L，MnSO4·4H2O 60mg/L，ZnSO4·7H2O 20mg/L，H3BO3 9mg/L，KI 8mg/L，Na2MoO4·2H2O 3mg/L，CoCl2·6H2O 0.3mg/L，4-碘苯氧乙酸0.18mg/L，蔗糖40g/L，琼脂12g/L，山梨醇60g/L，二甲基亚砜9mg/L、甘油12g/L，萘乙酸NAA0.35mg/L。
(5)恢复培养：
转移到第四培养基内，温度为27±1℃，以荧光灯为光源，光照强度控制为1800～2500Lx，光周期控制为光14h/暗10h，培养至形成非洲菊幼苗。
所述第四培养基的组成成分在步骤(3)所述第二培养基基础上添加了6-苄氨基嘌呤1.8mg/L。
(6)幼苗的驯化与炼苗：
将非洲菊幼苗移栽到炼苗基质后，从诱导环境中每天降低温度1℃，光照强度每天增加300Lx，至与外部环境相同时，再培养2～3天即可移栽至普通土壤中。
所述炼苗基质的组成成分为：珍珠岩、蛭石、锯末、松树皮、水苔、花泥、泥炭土以及钙镁磷钾肥，其质量比为1:1:0.5:0.5:0.3:0.1:0.1:0.01。
实施例2
一种非洲菊种质资源的保存方法，具体步骤如下：
(1)花托外植体预处理：
选取直径1～2cm的花蕾，在4℃环境中冷藏3天后，将花蕾取出自然恢复至室温，剥去苞片和小花，用纯净水冲洗，先在0.05％的升汞水溶液中消毒5min，再用70％的酒精消毒20s，之后用无菌水冲洗3次，即得到非洲菊花托外植体。
以上涉及的百分比均为体积百分比。
(2)外植体接种及诱导培养：
将非洲菊花托外植体移入到灭菌后的第一培养基中，将温度设定为23±1℃，以蓝光灯为光源，光照强度控制为400Lx，光周期控制为光14h/暗10h，10天左右诱导出愈伤组织。
所述第一培养基的组成成分为：KNO3 800mg/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺800mg/L，KH2PO4 300mg/L，CaCl2·2H2O 320mg/L，MgSO4·7H2O 180mg/L，EDTA 120mg/L，FeSO4·7H2O 30mg/L，MnSO4·4H2O 50mg/L，ZnSO4·7H2O 15mg/L，H3BO3 8mg/L，KI 5mg/L，Na2MoO4·2H2O 1mg/L，CoCl2·6H2O 0.2mg/L，4-碘苯氧乙酸0.15mg/L，肌醇30mg/L，甘氨酸0.5mg/L，维生素B1 0.5mg/L，维生素B6 1.0mg/L，烟酸1.0mg/L，蔗糖30g/L，琼脂10g/L，激动素KT 0.5mg/L，萘乙酸NAA0.3mg/L，山梨醇50g/L，生物素0.15mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，盐酸硫胺素0.5mg/L，甲基亚硝基脲1.5mg/L，吲哚丁酸1.5mg/L，丙氨酸5mg/L，叶酸5mg/L，调环酸钙1.5mg/L，秋水仙碱1.5mg/L，水解蛋白2.0g/L。
(3)转移诱导培养：
将步骤(2)得到的愈伤组织转移到第二培养基，温度为27±1℃，以荧光灯为光源，光照强度控制为1800Lx，光周期控制为光14h/暗10h，14天愈伤组织诱导出嫩芽。
所述第二培养基的组成成分在步骤(2)所述第一培养基基础上添加了吲哚丁酸0.5mg/L和2,4-二氯苯氧乙酸丁酯1.5mg/L。
(4)种质离体保存：
将嫩芽从非洲菊花托外植体上完整地切下，转移到第三培养基内慢速生长保存，保存环境为：温度为4±1℃，以荧光灯为光源，光照强度控制为300～500Lx，光周期控制为光8h/暗16h。
所述第三培养基的组成成分为：KNO3 800mg/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺800mg/L，KH2PO4 300mg/L，CaCl2·2H2O 320mg/L，MgSO4·7H2O 180mg/L，EDTA 120mg/L，FeSO4·7H2O 30mg/L，MnSO4·4H2O 50mg/L，ZnSO4·7H2O 15mg/L，H3BO3 8mg/L，KI 5mg/L，Na2MoO4·2H2O 1mg/L，CoCl2·6H2O 0.2mg/L，4-碘苯氧乙酸0.15mg/L，蔗糖30g/L，琼脂10g/L，山梨醇50g/L，二甲基亚砜8mg/L、甘油10g/L，萘乙酸NAA0.3mg/L。
(5)恢复培养：
转移到第四培养基内，温度为27±1℃，以荧光灯为光源，光照强度控制为1800Lx，光周期控制为光14h/暗10h，培养至形成非洲菊幼苗。
所述第四培养基的组成成分在步骤(3)所述第二培养基基础上添加了6-苄氨基嘌呤1.5mg/L。
(6)幼苗的驯化与炼苗：
将非洲菊幼苗移栽到炼苗基质中，并逐步转移到外部环境中，在幼苗适应外部环境正常生长后，再移栽至普通土壤中正常培养。
所述逐步转移到外部环境中的方法为：将非洲菊幼苗移栽到炼苗基质后，从诱导环境中每天降低温度1.5℃，光照强度每天增加400Lx，至与外部环境相同时，再培养2天即可移栽至普通土壤中。
所述炼苗基质的组成成分为：珍珠岩、蛭石、锯末、松树皮、水苔、花泥、泥炭土以及钙镁磷钾肥，质量比为1:0.5:0.2:0.2:0.1:0.05:0.05:0.005。
实施例3
一种非洲菊种质资源的保存方法，具体步骤如下：
(1)花托外植体预处理：
选取直径2cm的花蕾，在4℃环境中冷藏5天后，将花蕾取出自然恢复至室温，剥去苞片和小花，用纯净水冲洗，先在0.05％的升汞水溶液中消毒8min，再用70％的酒精消毒40s，之后用无菌水冲洗3次，即得到非洲菊花托外植体。
以上涉及的百分比均为体积百分比。
(2)外植体接种及诱导培养：
将非洲菊花托外植体移入到灭菌后的第一培养基中，将温度设定为23±1℃，以蓝光灯为光源，光照强度控制为800Lx，光周期控制为光14h/暗10h，10天左右诱导出愈伤组织。
所述第一培养基的组成成分为：KNO3 1300mg/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺1200mg/L，KH2PO4 450mg/L，CaCl2·2H2O 350mg/L，MgSO4·7H2O 240mg/L，EDTA 180mg/L，FeSO4·7H2O 50mg/L，MnSO4·4H2O 80mg/L，ZnSO4·7H2O 30mg/L，H3BO3 10mg/L，KI 10mg/L，Na2MoO4·2H2O 5mg/L，CoCl2·6H2O 0.5mg/L，4-碘苯氧乙酸0.20mg/L，肌醇80mg/L，甘氨酸1.0mg/L，维生素B1 0.75mg/L，维生素B6 1.5mg/L，烟酸1.5mg/L，蔗糖50g/L，琼脂15g/L，激动素KT 1.0mg/L，萘乙酸NAA 0.4mg/L，山梨醇70g/L，生物素0.20mg/L，盐酸吡哆醇1.0mg/L，盐酸硫胺素1.0mg/L，甲基亚硝基脲2.0mg/L，吲哚丁酸2.0mg/L，丙氨酸10mg/L，叶酸10mg/L，调环酸钙2.0mg/L，秋水仙碱2.0mg/L，水解蛋白2.5g/L。
(3)转移诱导培养：
将步骤(2)得到的愈伤组织转移到第二培养基，温度为27±1℃，以荧光灯为光源，光照强度控制为2500Lx，光周期控制为光14h/暗10h，14天愈伤组织诱导出嫩芽。
所述第二培养基的组成成分在步骤(2)所述第一培养基基础上添加了吲哚丁酸2.0mg/L和2,4-二氯苯氧乙酸丁酯2.0mg/L。
(4)种质离体保存：
将嫩芽从非洲菊花托外植体上完整地切下，转移到第三培养基内慢速生长保存，保存环境为：温度为4±1℃，以荧光灯为光源，光照强度控制为300～500Lx，光周期控制为光8h/暗16h。
所述第三培养基的组成成分为：KNO3 1300mg/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺1200mg/L，KH2PO4 450mg/L，CaCl2·2H2O 350mg/L，MgSO4·7H2O 240mg/L，EDTA 180mg/L，FeSO4·7H2O 50mg/L，MnSO4·4H2O 80mg/L，ZnSO4·7H2O 30mg/L，H3BO3 10mg/L，KI 10mg/L，Na2MoO4·2H2O 5mg/L，CoCl2·6H2O 0.5mg/L，4-碘苯氧乙酸0.20mg/L，蔗糖50g/L，琼脂15g/L，山梨醇70g/L，二甲基亚砜10mg/L、甘油15g/L，萘乙酸NAA 0.4mg/L。
(5)恢复培养：
转移到第四培养基内，温度为27±1℃，以荧光灯为光源，光照强度控制为2500Lx，光周期控制为光14h/暗10h，培养至形成非洲菊幼苗。
所述第四培养基的组成成分在步骤(3)所述第二培养基基础上添加了6-苄氨基嘌呤2.0mg/L。
(6)幼苗的驯化与炼苗：
将非洲菊幼苗移栽到炼苗基质中，并逐步转移到外部环境中，在幼苗适应外部环境正常生长后，再移栽至普通土壤中正常培养。
所述逐步转移到外部环境中的方法为：将非洲菊幼苗移栽到炼苗基质后，从诱导环境中逐天降低温度并逐天增加光照强度，至与外部环境相同时，再培养3天即可移栽至普通土壤中，转移过程的周期根据室外环境不同而调节，转移过程的周期持续15天。
所述炼苗基质的组成成分为：珍珠岩100g、蛭石150g、锯末80g、松树皮80g、水苔50g、花泥15g、泥炭土15g以及钙镁磷钾肥1.5g。