离体诱导百合异源四倍体的方法与流程

本发明属于多倍体育种领域，具体涉及一种离体诱导百合异源四倍体的方法。
背景技术：
：百合属于百合科(Liliaceae)百合属(Lilium)植物，是世界上重要的球根类花卉。种间远缘杂交是培育百合新品种的重要手段。然而大部分远缘杂种，由于减数分裂过程中染色体不能正常的配对和分离，种间杂种往往表现高度的不育；限制了其进一步的改良和百合的渐渗育种。多倍化能解决这一问题，通过有性多倍体(2n配子诱导)和无性多倍化(体细胞染色体加倍)，已成功培育出大量的百合种间杂种，如LA(Longiflorum×Asiatic)、OT(Oriental×Trumpet)和LO(Longiflorum×Oriental)杂种系等(Barba-GonzalezR,LimK-B，VanTuylJM.MolecularCytogeneticsinLiliumBreeding.In:IIIInternationalSymposiumontheGenusLilium1027.2014,129-142)。绝大多数的百合，从播种到开花需要2-3年的时间。目前栽培的品种通过鳞片扦插或组培繁殖形成的小籽球开花也需要2-3年(KhanN.Amolecularcytogeneticstudyofintergenomicrecombinationandintrogressionofchromosomalsegmentsinlilies.PhD-thesis,WageningenUniversityandResearchCentre.2009,2-3)。新铁炮百合与其他的百合品种相比，具有生育期短，早花的特性(即从播种到开花仅需6-8个月)，种球繁育周期短、并具有耐热的特点；但其花色单一，为白色；花型为喇叭型(SatoT,MiyoshiKandOkazakiK.Inductionof2ngametesand4nembryoinLilium(Lilium×formolongihort.)byNitrousOxideGasTreatment).In:XXIIIInternationalEUCARPIASymposium,SectionOrnamentals,ColourfulBreedingandGenetics-PartII855.2009,243-248)。而东方百合杂种系花大，艳丽，花香浓郁，抗灰霉病，但其种球繁育周期较长。因此，进行新铁炮百合和东方百合杂种系间的杂交，是培育生育期短、抗热、花色和花型丰富百合新品种的重要途径。本课题组通过受精前障碍克服和胚拯救技术获得了这两大杂种系间的杂种苗，具体获得杂种材料的方法参见公开号为105123528A的中国专利申请《新铁炮百合远缘杂交早期不同发育阶段胚拯救方法》，经选择后所获得杂种优株‘回归’(已具有品种名登录权)遗传了双亲的优良特性，即具有新铁炮百合的早花特性，直径为1cm左右的组培鳞茎种植8-9个月就能正常开花，且花大，具有淡香。但其配子完全不育，为进一步改良，需要恢复其育性。已有研究表明，秋水仙素、氨磺灵和氟乐灵成功地用于百合属离体染色体加倍(VanTuylJM,MeijerBandVanDienMP.TheuseoforyzalinasanalternativeforcolchicineinvitrochromosomedoublingofLiliumandNerine.In:VIInternationalSymposiumonFlowerBulbs325.1992,625-630；TakamuraT,LimKBandVanTuylJM.EffectofanewcompoundonthemitoticpolyploidizationofLiliumlongiflorumandorientalhybridlilies.In:XXInternationalEucarpiaSymposium,SectionOrnamentals,StrategiesforNewOrnamentals-PartII572.2001,37-42.)。但目前存在加倍过程中污染严重、嵌合体和诱导率低等问题(VanTuylJ.Researchonmitoticandmeioticpolyploidizationinlilybreeding[J].Herbertia.1989,45:97-103；池坚等.东方百合Siberia多倍体诱导及其细胞学鉴定[J].分子植物育种,2008,6(2)：291-296.)。因此，结合百合鳞片不定芽分化特性，创建了秋水仙素离体诱导多倍体的技术体系。该发明对百合远缘杂种育性恢复、遗传改良和短生育期新品种培育具有重要的作用。技术实现要素：建立一套完整、高效的百合远缘杂种离体诱导染色体加倍技术，本发明的目的在于提供一种新铁炮百合远缘杂种离体诱导异源四倍体的方法，具体步骤如下：1)预培养：组培新铁炮百合远缘杂种得到小鳞茎，将小鳞茎的鳞片切片，接种到不定芽诱导培养基上预培养，得到预培养后的鳞片切片；2)秋水仙素溶液配制：将秋水仙素用二甲基亚砜(DMSO)助溶后配制成质量百分含量0.05-0.1％的溶液，高压灭菌，得到秋水仙素溶液；3)多倍体诱导：将1)所述预培养后的鳞片切片清洗后浸泡于2)所述秋水仙素溶液中进行诱导处理，得到诱导后的鳞片切片；4)纯合四倍体的诱导和培养：将3)所述诱导后的鳞片切片清洗后，接种于不定芽诱导培养基中循环继代培养得到再生植株，转入丛生芽生长培养基中培养，得到长大的再生植株；5)鳞茎膨大培养：将4)所述长大的再生植株接种于高糖培养基培养，得到鳞茎膨大植株；6)生根培养：将5)所述鳞茎膨大植株接种到生根培养基上培养，得到生根的鳞茎膨大植株；7)倍性鉴定：鉴定染色体倍性挑选四倍体，至此得到完整的百合异源四倍体。所述的不定芽诱导培养基为现有技术已公开的百合不定芽诱导培养基，优选为：以MS培养基为基本培养基，6-BA浓度为2.0mg/L、NAA浓度为0.1mg/L、蔗糖的质量百分含量为3％、琼脂的质量百分含量为0.7％、pH值为5.8的培养基。所述的丛生芽生长培养基为现有技术已公开的百合丛生芽生长培养基，优选为：以MS培养基为基本培养基，6-BA浓度为1.0mg/L、NAA浓度为0.2mg/L、蔗糖的质量百分含量为3％、琼脂的质量百分含量为0.7％、pH值为5.8的培养基。所述的高糖培养基为现有技术已公开的百合高糖培养基，优选为：以MS培养基为基本培养基，蔗糖的质量百分含量为8％、活性炭浓度为1g/L、琼脂的质量百分含量为0.7％、pH值为5.8的培养基。所述生根培养基为现有技术已公开的百合生根培养基，优选为：以MS培养基为基本培养基，NAA浓度为0.2mg/L，蔗糖的质量百分含量为3％、琼脂的质量百分含量为0.7％、pH值为5.8的培养基。其中，步骤1)所述新铁炮百合远缘杂种，为新铁炮百合远缘杂交后进行胚拯救得到杂交组培苗，具体获得方式参见公开号为105123528A的中国专利申请《新铁炮百合远缘杂交早期不同发育阶段胚拯救方法》。所述新铁炮百合远缘杂种优选为‘回归’(已具有品种名登录权)，该品种具有新铁炮百合的早花特性，直径为1cm左右的组培鳞茎种植8-9个月就能正常开花，且花大，具有淡香。其中，所述秋水仙素溶液优选质量百分含量0.05％。其中，步骤1)所述组培新铁炮百合远缘杂种得到小鳞茎，为在高糖培养基中22±2℃，暗培养至得到直径为1.6-1.8cm的小鳞茎。暗培养时间优选6周。其中，步骤1)所述小鳞茎的鳞片，为剥取小鳞茎外层和中层鳞片。其中，所述切片，为横切成宽5-7mm的切片。其中，步骤1)所述预培养的时间为7-25天，优选7天。其中，步骤2)所述秋水仙素用二甲基亚砜助溶，秋水仙素粉末用质量百分含量2％的二甲基亚砜溶液助溶。其中，步骤2)所述配制成质量百分含量0.05-0.1％的溶液，先配制成质量百分含量1％的母液，存放在棕色瓶4℃保存，使用时稀释母液至使用浓度。其中，步骤2)所述高压灭菌为118℃灭菌18分钟。其中，步骤3)所述诱导处理为在组培室内静置培养。其中，步骤3)所述诱导处理的时间为18-36小时，优选24小时。其中，步骤4)所述循环继代培养，每代培养6周，优选继代3次。其中，步骤4)所述丛生芽生长培养基中培养，培养时间为6周。其中，步骤4)所述高糖培养基培养，培养时间为6周。其中，步骤3)、步骤5)的环境条件为22±2℃暗培养。其中，步骤1)、步骤4)、步骤6)的环境条件为温度22±2℃，光照强度35μmolm-2s-1，光照时间16小时/天。本发明的离体诱导百合异源四倍体的方法，优选为具体步骤如下：1)预培养：组培新铁炮百合远缘杂种得到小鳞茎，将小鳞茎的鳞片切片，接种到不定芽诱导培养基上预培养7天，得到预培养后的鳞片切片；2)秋水仙素溶液配制：将秋水仙素用二甲基亚砜助溶后配制成质量百分含量0.05％的溶液，高压灭菌，得到秋水仙素溶液；3)多倍体诱导：将1)所述预培养后的鳞片切片清洗后浸泡于2)所述秋水仙素溶液中进行诱导处理24小时，得到诱导后的鳞片切片；4)纯合四倍体的诱导和培养：将3)所述诱导后的鳞片切片清洗后，接种于不定芽诱导培养基中循环继代培养得到再生植株，转入丛生芽生长培养基中培养，得到长大的再生植株；5)鳞茎膨大培养：将4)所述长大的再生植株接种于高糖培养基培养，得到鳞茎膨大植株；6)生根培养：将5)所述鳞茎膨大植株接种到生根培养基上培养，得到生根的鳞茎膨大植株；7)倍性鉴定：鉴定染色体倍性挑选四倍体，至此得到完整的百合异源四倍体。本发明还提供所述的离体诱导百合异源四倍体的方法在百合育种中的应用。本发明针对百合鳞片不定芽分化特性，首先在诱导前对材料进行预培养；改进常规的多倍体离体诱导流程，包括用低浓度二甲基亚砜(2％)助溶秋水仙素并高压灭菌，秋水仙素处理后的材料在不定芽诱导培养基上进行3个循环的继代培养，将嵌合体加以分离；之后转接到6-BA浓度降低的生长培养基中，促使丛生芽生长；经过养球和生根培养阶段，获得大量的纯合四倍体。本发明克服一般多倍体离体诱导过程中污染严重、嵌合体和诱导率低的缺陷；诱导方法操作简易，诱导成功率高；获得的四倍体植株经栽培生长正常，倍性稳定；本发明可作为百合远缘杂种育性恢复、遗传改良和异源四倍体新品种培育的重要方法。本发明的有益效果在于：1.本发明以新铁炮百合杂种无菌试管小鳞茎分化不定芽能力较强的外层和中层鳞片基部为材料，鳞片经预培养后，直接浸泡于用2％二甲基亚砜(DMSO)助溶、高压灭菌的秋水仙素溶液中，静置，暗培养。不同于传统秋水仙素直接处理鳞片，秋水仙素无菌水溶解和抽滤灭菌，培养于液体培养基进行摇床震荡培养。此方法可增加秋水仙素的渗透性，提高诱导效果，并降低诱导过程中材料的污染。2.进行预培养同步了细胞有丝分裂，秋水仙素处理后的材料在不定芽诱导培养基上进行3个循环的培养，分离了嵌合体；再经过丛生芽生长(丛生芽生长培养基培养)、养球(高糖培养基培养)和生根培养(生根培养基培养)阶段，获得纯合异源四倍体。3.诱导成功的四倍体植株，经驯化移栽生长正常，为培育早花和种球繁育周期短的新品种创造新种质。附图说明图1从左至右分别是预实验中小鳞茎鳞片切片预培养7天、15天和25天的照片；图2从左至右分别是实施例1中二倍体的流式细胞图、根尖染色体光学显微镜照片及下表皮气孔光学显微镜照片。图3从左至右分别是实施例1中四倍体的流式细胞图、根尖染色体光学显微镜照片及下表皮气孔光学显微镜照片。图4从左至右分别是二倍体鳞片切片增殖生长，高糖培养植株和温室移栽4月龄苗的照片。图5从左至右分别是四倍体鳞片切片增殖生长，高糖培养植株和温室移栽4月龄苗的照片。具体实施方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。预实验以公开号为105123528A的中国专利申请《新铁炮百合远缘杂交早期不同发育阶段胚拯救方法》中的方法选育，品种登录名称为‘回归’，具有新铁炮百合的早花特性，直径为1cm左右的组培鳞茎种植8-9个月就能正常开花，且花大，具有淡香。预实验通过对无菌试管小鳞茎鳞片切片不同预培养时间，不同秋水仙素浓度及不同处理时间三个因素的三个水平设计正交试验(见表1)。表1预培养时间、秋水仙素浓度和处理时间对诱导效果的影响为比较各因素对存活植株数和四倍体诱导率的影响程度，对统计结果进行多变量多因素方差分析，结果如表2所示：鳞片切片预培养时间、秋水仙素浓度与浸泡时间对成活植株数影响较小，不存在显著性差异(p>0.05)，对四倍体诱导率的影响均具有极显著差异(p<0.01)。表2预培养时间、秋水仙素浓度和处理时间对再生存活植株数和四倍体诱导率的影响注：a.R方＝.330(调整R方＝.082)b.R方＝.848(调整R方＝.803).**表示p<0.01差异极显著。进一步对各因素加以多重比较分析，结果如表3所示。各预培养时间(7天，15天和25天)之间存在显著差异，预培养7天所得的诱导率最高。对于秋水仙素浓度，0.00％与0.05％或0.1％之间存在显著性差异，0.05％和0.1％之间差异不显著，考虑到经济效益，选择0.05％秋水仙素为佳。不同秋水仙素处理时间(18h,24h和36h)对四倍体诱导率存在显著差异，以处理24h诱导率最高。表3预培养时间、秋水仙素浓度和处理时间对四倍体诱导率的显著水平比较注：同列数据小写字母表示p<0.05显著水平，相同字母之间表示差异不显著，不同字母之间表示差异显著。综上所述，新铁炮百合远缘杂种无菌鳞片切片异源四倍体诱导的最佳处理组合为：鳞片切片预培养7天、0.05％的秋水仙素处理24h。正交试验筛选的最佳组合正好为正交表中的处理组合2。实施例1一种离体诱导百合异源四倍体的方法本实施例用于说明本发明中通过正交试验筛选出的最佳四倍体诱导组合，即百合鳞片切片预培养7天、0.05％的秋水仙素处理24h。1.材料与方法以公开号为105123528A的中国专利申请《新铁炮百合远缘杂交早期不同发育阶段胚拯救方法》中的方法选育，品种登录名‘回归’。所用的不定芽诱导培养基为：以MS培养基为基本培养基，6-BA浓度为2.0mg/L、NAA浓度为0.1mg/L、蔗糖的质量百分含量为3％、琼脂的质量百分含量为0.7％、pH值为5.8的培养基。所用的丛生芽生长培养基为：以MS培养基为基本培养基，6-BA浓度为1.0mg/L、NAA浓度为0.2mg/L、蔗糖的质量百分含量为3％、琼脂的质量百分含量为0.7％、pH值为5.8的培养基。所用的高糖培养基为：以MS培养基为基本培养基，蔗糖的质量百分含量为8％、活性炭浓度为1g/L、琼脂的质量百分含量为0.7％、pH值为5.8的培养基。所用生根培养基为：以MS培养基为基本培养基，NAA浓度为0.2mg/L，蔗糖的质量百分含量为3％、琼脂的质量百分含量为0.7％、pH值为5.8的培养基。1)预培养：高糖培养基培养新铁炮百合远缘杂种‘回归’得到直径为1.6-1.8cm的无菌百合试管小鳞茎，剥取鳞茎外层和中层鳞片，横切成5-7mm宽的切片，用无菌水清洗2-3次，每次浸泡2min，灭菌滤纸吸干水分，接种到不定芽诱导培养基上预培养7天，得到预培养后的鳞片切片；培养条件：温度为(22±2)℃，光照强度为35μmol·m-2·s-1，光照时间为16小时/天。2)秋水仙素溶液配制：将秋水仙素粉末用质量百分含量2％的二甲基亚砜溶液助溶，以无菌水配制成质量百分含量为1％母液，存放在棕色瓶4℃保存。稀释母液至质量百分含量为0.05％，取50ml至培养瓶，高压灭菌，温度为118℃，时间为18min，得到秋水仙素溶液；3)多倍体诱导：将1)所述预培养后的鳞片切片，无菌水清洗2-3次，每次清洗浸泡2min以去除其上附着的培养基，灭菌滤纸吸干水分，浸泡于质量百分含量为0.05％的秋水仙素溶液中，静置于组培室暗培养24h进行诱导处理，每次处理10块鳞片切片，重复3次。培养条件：温度为(22±2)℃，暗培养(用黑布覆盖)，得到诱导后的鳞片切片；4)纯合四倍体的诱导和培养：将3)所述诱导后的鳞片切片用无菌水清洗2-3次，每次浸泡2min，灭菌滤纸吸干水分，接种于不定芽诱导培养基中循环继代培养，培养条件：温度为(22±2)℃，光照强度为35μmol·m-2·s-1，光照时间为16小时/天。继代增殖培养3次，每次间隔时间为6周得到再生植株，转入丛生芽生长培养基中培养，培养条件：温度为(22±2)℃，光照强度为35μmol·m-2·s-1，光照时间为16小时/天。培养6周得到长大的再生植株；5)鳞茎膨大培养：将4)所述长大的再生植株接种于高糖培养基培养，培养温度为(22±2)℃，暗培养(无灯管照明的状态下)6周，得到鳞茎膨大植株；6)生根培养：将5)所述鳞茎膨大植株接种到生根培养基上培养，培养条件：温度为(22±2)℃，光照强度为35μmol·m-2·s-1，光照时间为16小时/天。7)倍性鉴定：将步骤6)所述生根培养1周的生根的鳞茎膨大植株利用流式细胞分析仪结合根尖染色体计数法鉴定倍性，图2是二倍体的流式细胞图、根尖染色体(染色体数2n＝2x＝24)及下表皮气孔在光学显微镜下的照片。图3是四倍体的流式细胞图、根尖染色体(染色体数2n＝4x＝48)及下表皮气孔在光学显微镜下的照片。统计鳞片秋水仙素浸泡处理31周后再生的存活植株数及四倍体诱导率。统计结果不包含嵌合体和八倍体植株数。图4为二倍体鳞片切片增殖生长，高糖培养植株和温室移栽4月龄苗的照片。图5为四倍体鳞片切片增殖生长，高糖培养植株和温室移栽4月龄苗的照片统计结果显示，存活植株数均值为36株，四倍体诱导率均值为51％。经所述鉴定为四倍体的植株转接至高糖培养基再培养6周。培养温度(22±2)℃，暗培养(无灯管照明的状态下)。将所述高糖培养的试管鳞茎(直径1-2cm)放置于4℃条件下两个月(一般为9周)打破休眠。试管鳞茎炼苗移栽：试管鳞茎在室温条件下炼苗3天，前两天瓶盖关闭，第三天打开，洗去根部附着培养基，质量百分含量0.2％多菌灵浸泡20min，种植于温室，进行种苗正常管理，移栽成活率95％。基生叶表型比较：选取温室栽培4月龄的二倍体和四倍体植株，比较初期基生叶表型差异和下表皮气孔长度。由于四倍体基因组DNA的复制，四倍体基生叶在形态和组织结构表现出明显差异(见表4)，四倍体比二倍体表现出叶长变短，叶宽变长，导致叶型指数变小，叶片肥厚浓绿，叶表明粗糙，气孔变长，株型紧凑。表4杂种苗二倍体和四倍体基生叶表型比较倍性叶长/cm叶宽/cm叶厚/mm叶长/叶宽气孔长/μm二倍体18.81±0.46a2.18±0.06b0.45±0.01b8.71±0.27a69.94±0.51b四倍体17.11±0.39b2.39±0.06a0.58±0.02a7.19±0.17b104.53±0.87a注：每一数值代表温室种植4个月，二倍体和四倍体各测量30株，每株从外到内第7片叶的平均值±标准误，同列数据小写字母表示p<0.05显著水平，不同字母之间表示差异显著。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3