专利名称：普通小麦背景中外源遗传物质的鉴定的制作方法
技术领域：
普通小麦背景中外源遗传物质的鉴定，属于作物遗传育种学领域。
背景技术：
对转移进普通小麦背景中的外源遗传物质进行鉴定，可以对其跟踪、评价其遗传 效应，提高对其选择的准确性和利用效率。近年来，已经建立了形态学标记、细胞学标记、分 子生物学标记和生化标记等多种鉴定外源遗传物质的方法和技术，特别是分子标记和分子 细胞遗传学技术的快速发展，使外源遗传物质的鉴定及外源基因的定位和识别变得更为方 便可靠。
发明内容
(1)形态学鉴定 建立在特定表型性状基础上的形态标记是检测外源遗传物质最简便、最基础的方 法。 一般参照双亲的形态特征，根据后代的表型特点确定是否存在外源基因。目前已在部 分小麦近缘物种山羊草、黑麦、簇毛麦、彭梯卡偃麦草等中找到了其特定染色体的形态标记 性状。但真正可以应用的表型性状较少。
(2)细胞学鉴定 细胞学鉴定是利用小麦与其近缘种在染色体数目、形态、大小和联会行为等方面 的差异进行比较分析。在染色体数目鉴定的基础上，将普通小麦与被测系杂交，观察F1花 粉母细胞减数分裂中期I(PMC MI)染色体构型，可对被测系的细胞学特点作出初步判断。
染色体核型分析主要是对有丝分裂中期细胞的染色体数目、大小、形状、着丝点位 置、臂比和随体有无等进行分析，通过与标准的核型对比，鉴定外源染色体或染色体片段的 存在情况。 一些染色体特殊结构如随体等可作为重要细胞学标记。核型分析对研究生物的 遗传变异、生物的系统演化、物种之间的亲缘关系、某些生物的起源、基因定位等都有重要 的意义，已在许多作物上得到广泛的应用。
(3)生化方法鉴定 随着生化技术的不断改进和完善以及生化遗传学的建立，大量控制蛋白质合成的 基因已被准确地定位在小麦及其近缘物种的染色体和染色体臂上。种子贮藏蛋白和同工酶 是检测小麦中外源物质常用的生化标记。 小麦种子贮藏蛋白主要分为醇溶蛋白(Gliadin)和谷蛋白(Glutenin)两类，它们 能比较准确地反映小麦的基因类型。贮藏蛋白电泳特别是反向高效液相色谱技术和高效毛 细管电泳技术能有效地检测小麦中的外源染色体。 同功酶表达谱是鉴定普通小麦中外源染色体的常用和有效的方法。小麦的7个部 分同源群染色体长、短臂都有特异性同功酶位点被确定，利用不同物种或染色体组在同功 酶位点上的差异以及多态性，可检测不同异源染色体的附加、代换或易位，并初步确定外源 染色体与小麦的部分同源关系。
4
(4)原位杂交鉴定 近年来迅速发展的原位杂交技术使精确识别小麦背景中的外源染色体成为可能。
根据所用探针的不同可将原位杂交分为5类。第一类是用外源种属特异的弥散重复序列作
探针；第二类是用非种属特异的重复序列作探针，在原位杂交中不同物种产生不同的带型，
根据带型的改变检测外源染色体。第三类是用单拷贝或寡拷贝DNA序列作探针，在麦类作
物上的应用才刚刚开始。第四类是基因组DNA作探针的基因组原位杂交(GISH)，它已成为
鉴定异源染色质的主要手段之一。目前已成功地用于鉴定转入小麦背景中的大麦、黑麦、披
碱草、大赖草、偃麦草染色体和染色体片段；第五类是多色原位杂交，它可以同时区分和鉴
别添加到小麦遗传背景中的不同外源染色体，使结果更为简捷直观，它的建立大大推动了
染色体物理图谱的构建，而且也是两个或两个以上物种杂交后代的鉴定及多倍体物种起源
和进化研究的一种重要手段。 (5)分子标记鉴定 近年来随着分子生物学技术的发展，分子标记技术不断得到完善和成熟，相继出 现了限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、简单序列重复(SSR)和扩 增片段长度多态性(AFLP)等多种分子标记技术。这些技术方法可以更加精确可靠地检测 鉴定小麦中渗入的少量外源遗传物质，弥补了染色体显带技术和原位杂交技术只能鉴定较 大片段的外源染色体的缺点。 植物基因组研究进程的不断加快以及小麦分子标记遗传图谱的日趋饱和，使更多 的简单快捷的分子标记不断被开发出来，这将为精确鉴定小麦背景下的外源染色体特别是 小片段易位提供了极大的便利。
具体实施例方式(1)形态学鉴定 建立在特定表型性状基础上的形态标记是检测外源遗传物质最简便、最基础的方 法。 一般参照双亲的形态特征，根据后代的表型特点确定是否存在外源基因。目前已在部 分小麦近缘物种山羊草、黑麦、簇毛麦、彭梯卡偃麦草等中找到了其特定染色体的形态标记 性状。但真正可以应用的表型性状较少。
(2)细胞学鉴定 细胞学鉴定是利用小麦与其近缘种在染色体数目、形态、大小和联会行为等方面 的差异进行比较分析。在染色体数目鉴定的基础上，将普通小麦与被测系杂交，观察F工花 粉母细胞减数分裂中期I(PMC MI)染色体构型，可对被测系的细胞学特点作出初步判断。
染色体核型分析主要是对有丝分裂中期细胞的染色体数目、大小、形状、着丝点位 置、臂比和随体有无等进行分析，通过与标准的核型对比，鉴定外源染色体或染色体片段的 存在情况。 一些染色体特殊结构如随体等可作为重要细胞学标记。核型分析对研究生物的 遗传变异、生物的系统演化、物种之间的亲缘关系、某些生物的起源、基因定位等都有重要 的意义，已在许多作物上得到广泛的应用。 染色体显带技术的发展为鉴定外源染色体或染色体片段提供了行之有效的手段。 自从Caspersson等创造荧光分带技术以来，现已发展了多种染色体分带技术，如C-带、 G-带、9_带、R-带等。C-分带技术在小麦及其亲缘物种的核型分析、染色体组鉴别、外源染
5色质鉴定等方面有着广泛的应用。目前利用c-分带技术已建立起了普通小麦、黑麦、大麦、 簇毛麦、大赖草、鹅观草及披碱草等物种的c-分带核型，并在鉴定小麦的异附加系、代换系
和易位系等方面发挥了重要作用。
(3)生化方法鉴定 随着生化技术的不断改进和完善以及生化遗传学的建立，大量控制蛋白质合成 的基因已被准确地定位在小麦及其近缘物种的染色体和染色体臂上(Payne， 1982， 1984 ; Gale， 1988)。种子贮藏蛋白和同工酶是检测小麦中外源物质常用的生化标记。
小麦种子贮藏蛋白主要分为醇溶蛋白(Gliadin)和谷蛋白(Glutenin)两 类，它们能比较准确地反映小麦的基因类型。贮藏蛋白电泳特别是反向高效液相色谱 (Reversed-phaseHigh-performance Liquid Chromatography简禾尔RP-HP1X)技术禾口高效毛 细管电泳(High-performance C即illary Electrophoresis简称HPCE)技术能有效地检测 小麦中的外源染色体(Tao，1991 ;丁斌等，2003 ;王黎明等，2005)。 同功酶表达谱是鉴定普通小麦中外源染色体的常用和有效的方法(Hart， 1983)。
小麦的7个部分同源群染色体长、短臂都有特异性同功酶位点被确定(Gale， 1988)，利用不
同物种或染色体组在同功酶位点上的差异以及多态性，可检测不同异源染色体的附加、代
换或易位，并初步确定外源染色体与小麦的部分同源关系(高明君，1992 ;滕晓月，1995 ;李
平路等，2003)。 (4)原位杂交鉴定 近年来迅速发展的原位杂交技术使精确识别小麦背景中的外源染色体成为可 能。根据所用探针的不同可将原位杂交分为5类。第一类是用外源种属特异的弥散重复 序列作探针，目前已从黑麦属(Secale) (Bedbrook et al 1980 ;A卯els et al 1981,1986 ; Mcintyre et al 1990 ;Guidet etal 1991)、簇毛麦属(Haynaldia) (Pace et al 1992)、薄 冰草属(Thinopyrum) (Zhang and Dvorakl990)、披减草属(Elymus) (Tsujimoto and Gill 1991)等种属中分离出物种专化的DNA重复序列，并成功地用于导入的外源遗传物质的检 测(L即itan et al，1986;Kim et al，1993;Li etal，1995)。第二类是用非种属特异的重 复序列作探针，在原位杂交中不同物种产生不同的带型，根据带型的改变检测外源染色体 (Biagetti et al， 1999)。第三类是用单拷贝或寡拷贝DNA序列作探针，在麦类作物上的应 用才刚刚开始。第四类是基因组DNA作探针的基因组原位杂交(GISH)，它已成为鉴定异源 染色质的主要手段之一。
(5)分子标记鉴定 近年来随着分子生物学技术的发展，分子标记技术不断得到完善和成熟，相继出
现了限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、简单序列重复(SSR)和
扩增片段长度多态性(AFLP)等多种分子标记技术。这些技术方法可以更加精确可靠地检
测鉴定小麦中渗入的少量外源遗传物质(鲁玉柱，2002 ;毛龙，1994 ;王新望，2001 ;王秀娥，
2001 ;IqbalM. J. ， 1995 ;Sharp et al，1989;Peil et al， 1997 ;万平，2002 ;周兖晨，2001)，
弥补了染色体显带技术和原位杂交技术只能鉴定较大片段的外源染色体的缺点。 植物基因组研究进程的不断加快以及小麦分子标记遗传图谱的日趋饱和，使更多
的简单快捷的分子标记不断被开发出来，这将为精确鉴定小麦背景下的外源染色体特别是
小片段易位提供了极大的便利。
权利要求
普通小麦背景中外源遗传物质的鉴定主要包括(1)形态学鉴定建立在特定表型性状基础上的形态标记是检测外源遗传物质最简便、最基础的方法。一般参照双亲的形态特征，根据后代的表型特点确定是否存在外源基因。目前已在部分小麦近缘物种山羊草、黑麦、簇毛麦、彭梯卡偃麦草等中找到了其特定染色体的形态标记性状。但真正可以应用的表型性状较少。(2)细胞学鉴定细胞学鉴定是利用小麦与其近缘种在染色体数目、形态、大小和联会行为等方面的差异进行比较分析。在染色体数目鉴定的基础上，将普通小麦与被测系杂交，观察F1花粉母细胞减数分裂中期I(PMC MI)染色体构型，可对被测系的细胞学特点作出初步判断。染色体核型分析主要是对有丝分裂中期细胞的染色体数目、大小、形状、着丝点位置、臂比和随体有无等进行分析，通过与标准的核型对比，鉴定外源染色体或染色体片段的存在情况。一些染色体特殊结构如随体等可作为重要细胞学标记。核型分析对研究生物的遗传变异、生物的系统演化、物种之间的亲缘关系、某些生物的起源、基因定位等都有重要的意义，已在许多作物上得到广泛的应用。(3)生化方法鉴定随着生化技术的不断改进和完善以及生化遗传学的建立，大量控制蛋白质合成的基因已被准确地定位在小麦及其近缘物种的染色体和染色体臂上。种子贮藏蛋白和同工酶是检测小麦中外源物质常用的生化标记。小麦种子贮藏蛋白主要分为醇溶蛋白(Gliadin)和谷蛋白(Glutenin)两类，它们能比较准确地反映小麦的基因类型。贮藏蛋白电泳特别是反向高效液相色谱技术和高效毛细管电泳技术能有效地检测小麦中的外源染色体。同功酶表达谱是鉴定普通小麦中外源染色体的常用和有效的方法。小麦的7个部分同源群染色体长、短臂都有特异性同功酶位点被确定，利用不同物种或染色体组在同功酶位点上的差异以及多态性，可检测不同异源染色体的附加、代换或易位，并初步确定外源染色体与小麦的部分同源关系。(4)原位杂交鉴定近年来迅速发展的原位杂交技术使精确识别小麦背景中的外源染色体成为可能。根据所用探针的不同可将原位杂交分为5类。第一类是用外源种属特异的弥散重复序列作探针；第二类是用非种属特异的重复序列作探针，在原位杂交中不同物种产生不同的带型，根据带型的改变检测外源染色体。第三类是用单拷贝或寡拷贝DNA序列作探针，在麦类作物上的应用才刚刚开始。第四类是基因组DNA作探针的基因组原位杂交(GISH)，它已成为鉴定异源染色质的主要手段之一。目前已成功地用于鉴定转入小麦背景中的大麦、黑麦、披碱草、大赖草、偃麦草染色体和染色体片段；第五类是多色原位杂交，它可以同时区分和鉴别添加到小麦遗传背景中的不同外源染色体，使结果更为简捷直观，它的建立大大推动了染色体物理图谱的构建，而且也是两个或两个以上物种杂交后代的鉴定及多倍体物种起源和进化研究的一种重要手段。(5)分子标记鉴定近年来随着分子生物学技术的发展，分子标记技术不断得到完善和成熟，相继出现了限制性片段长度多态性(RFLP)、随机扩增多态性DNA(RAPD)、简单序列重复(SSR)和扩增片段长度多态性(AFLP)等多种分子标记技术。这些技术方法可以更加精确可靠地检测鉴定小麦中渗入的少量外源遗传物质，弥补了染色体显带技术和原位杂交技术只能鉴定较大片段的外源染色体的缺点。植物基因组研究进程的不断加快以及小麦分子标记遗传图谱的日趋饱和，使更多的简单快捷的分子标记不断被开发出来，这将为精确鉴定小麦背景下的外源染色体特别是小片段易位提供了极大的便利。
全文摘要
对转移进普通小麦背景中的外源遗传物质进行鉴定，可以对其跟踪、评价其遗传效应，提高对其选择的准确性和利用效率。近年来，已经建立了形态学标记、细胞学标记、分子生物学标记和生化标记等多种鉴定外源遗传物质的方法和技术，特别是分子标记和分子细胞遗传学技术的快速发展，使外源遗传物质的鉴定及外源基因的定位和识别变得更为方便可靠。
文档编号C12Q1/02GK101760545SQ200810238640
公开日2010年6月30日 申请日期2008年12月19日 优先权日2008年12月19日
发明者李祥 申请人:李祥