向肝脏定向递送遗传物质的方法

专利名称：向肝脏定向递送遗传物质的方法
技术领域：
本发明涉及用气囊导管向活体的靶器官递送遗传物质的方法。
背景技术：
基因治疗是外来遗传物质的胞内递送，其校正了存在的缺陷或提供了细胞新的有益功能。肝脏是基因治疗的重要靶器官，因为其在代谢和血清蛋白的生产中的重要作用。存在大量的已知疾病，其中一些疾病由肝脏特异性基因产物的缺陷所引起，其可以从分泌蛋白的肝脏产物中受益。家族性高胆固醇血症、血友病、Gaucher氏和Fabry氏病正是几个例子。许多这样的疾病可应用基因疗法(Siatskas等人，J.Inherit Metab.Dis.2001，24(Suppl.2)25-41；Barranger等人，Expert Opin.Biol.Then 2001，1(5)857-867；Barranger等人，Neurochem Res.1999，24(5)601-615)。
已经发展了各种方法来使用病毒性和非病毒性的载体向肝脏递送外来的遗传物质。通常，每个方法具有确定的缺陷。上述使用病毒性载体递送遗传物质的尝试已经由于中和宿主免疫应答、由于现有的寄主免疫的毒性、需要将大剂量药物注射到受试者循环中、在治疗期间靶器官内的高压和在体内定向特定细胞类型的困难而复杂化了。
病毒载体的门静脉(Portal injection)注射已经成为试图定向于肝脏的方法。但是，门静脉注射存在几个问题。当将腺病毒基因递送载体注射到大鼠的门静脉时，在肝脏中观察到高水平的转基因表达(Rosefeld等人，Science1991，252431-434)，但是这样的表达是短暂的，并要求反复注射。另外，当在血清阳性的动物的循环系统中注射时，病毒载体可能迅速被预先存在的抗体所中和。重组腺病毒载体全身(systemic)注射的研究已经表明中和宿主免疫应答限制了在反复注射中这种载体的有效性(Yang等人，Proc.Natl.Acad Sci.U.S.A.1994，914407-4411；Kozarsky等人，J.Biol.Chem.1994，26913695-13702)。
在其它情况下，病毒载体的全身或门静脉注射与剂量依赖型毒性相联系。这些毒性既是由于必须注射的相对大量的病毒，又是由于预先接触到普通病毒血清型的环境而预先存在的免疫性。因此，期望即限制递送给受试者的病毒的量，又限制病毒曝露于全身循环系统以及由此的免疫系统的程度。
对于病毒全身递送的基因治疗的另一个挑战是在靶器官内对于适当的细胞的定向治疗。例如，在肝脏中，肝细胞和非肝细胞(包括枯否(氏)细胞(KupfferCells)及其它抗原-呈递细胞)都可能被转染。肝细胞是极好的蛋白生产细胞，可以将表达的蛋白分泌到血清中，并经常是功能丧失性缺陷的部位。所以，其想要与非肝细胞相比，使肝细胞的转染最大化。但是，对于全身给药的病毒基因疗法来说，转染的肝细胞的重要部分是非肝细胞。
在非肝细胞中，转基因的表达可能是负的的结果，例如在抗原-呈递细胞中(包括枯否(氏)细胞、肝窦状上皮细胞(liver sinusoidal endothelial cell))。这样的表达可以产生针对该转基因产物的免疫响应。
已经进行了上述的尝试，使用气囊封闭(balloon occlusion)导管将遗传物质递送到身体的隔离区(美国专利No.5,698,531)。这些方法是针对血管壁内皮细胞的转染的。本发明提供了用于将遗传物质递送到器官的实质细胞中的方法。
已经描述了另一种使用气囊导管将遗传物质递送到靶器官的方法(WO2004/001049)。但是，该方法要求利用在靶器官内的高压。为了足够地提高压力，必须注入大量的药物，并且因为上述原因这些较大的剂量可能是不利的。此外，高压可能冒损害靶器官的危险。

发明内容
因此，本发明的一个目的是提供一种通过静脉脉管系统将病毒基因治疗剂递送到靶器官的方法，其对所述靶器官引流。
本发明的另一个目的是提供一种通过静脉脉管系统将病毒基因治疗剂递送到靶器官的方法，其对所述靶器官引流，不明显增加所述靶器官的所述静脉脉管系统内的压力。
本发明的另一个目的是提供一种通过静脉脉管系统将病毒基因治疗剂递送到靶器官的方法，其对所述靶器官引流，其中所述器官是肝脏，静脉脉管系统是肝静脉、肝静脉分支或下腔静脉。
本发明的另一个目的是提供一种为了表达由所述病毒基因治疗剂编码的蛋白，将病毒基因治疗剂递送到靶器官的方法。
本发明的另一个目的是提供一种为了在肝细胞和非肝细胞中表达由所述病毒基因治疗剂编码的蛋白，将病毒基因治疗剂递送到肝脏的方法，其中表达由所述病毒基因治疗剂编码的蛋白的肝细胞占肝细胞全体加上表达由所述病毒基因的编码蛋白的非肝细胞的分数是至少0.2、至少0.3、至少0.4、至少0.5、至少0.6、至少0.7、至少0.8或至少0.9。
本发明的另一个目的是提供一种为了表达由所述病毒基因治疗剂编码的蛋白，将病毒基因治疗剂递送到靶器官的方法，其中将病毒基因治疗剂递送到对于所述病毒基因治疗剂具有预先存在的免疫性的受试者中。
根据本发明，提供了一种使用气囊导管定向递送遗传物质的方法。在一种方法中，接近在单个肝静脉内使用气囊封闭导管，治疗液通过这样单个目标肝叶的容器经由导管向充气(阻塞)气囊的另一边递送到肝实质中。递送的药物量大到足够充满靶器官的静脉脉管系统，但小到足够防止静脉脉管压力的明显增加或试剂经由侧支循环(collateral circulation)散布到全身。通过复位气囊来封闭不同的脉管，在相同操作的期间连续地治疗多个肝叶。因为治疗是高度定位的，所以可以用不同的药物以相同的操作来治疗单个器官的各种部分，所述不同的药物可能是不相容的。
在另一种方法中，来自整体器官的静脉流出物暂时被接近和远离肝脏静脉流出物的下腔静脉内的气囊导管位置所阻塞，并且基因治疗剂经由充气(阻塞)气囊的间隔内的血管内导管注入。此外，病毒药物量大到足够充满靶器官的脉管系统，但小到足够防止静脉脉管压力的明显增加或试剂经由侧支循环散布到全身。当使用该方法来向分离的肝脏递送病毒基因治疗剂时，实现了非常有效的基因递送。
在另一个实施方案中，本发明的方法也可以在病毒给药之前包括一个“冲洗”步骤。冲洗使用生理学上适当的溶液，例如生理盐水，在病毒给药之前充满或部分充满分离的器官或器官的部分来减少或除去预先存在的抗病毒载体的抗体，其否则可能降低基因递送载体对于转换或浸染靶细胞的能力。
在另一个实施方案中，当肝脏是靶器官时，在病毒给药之前的冲洗步骤可能增加感染的肝细胞的数目和比例。在另一个优选实施方案中，在病毒给药之前的冲洗步骤增加了在对于病毒载体给药预先存在免疫性的动物中感染的肝细胞的数目和比例。
在另一个实施方案中，本发明的方法可以包括在靶器官中病毒基因治疗剂的延长滞留或停留时间。延长停留时间可能增加在没有增加与该瞬时方法有关的急性毒性均动物中转染的肝细胞的数目和比例。
本发明另外的目的和优点将部分地在随后的说明书中部分地阐明，部分地将从说明书中显而易见，或可从本发明的实施中得到。将依靠尤其在附加权利要求中所指出的部分和组合来实现和获得本发明的目的和优点。
应当理解，上述的一般性说明及其后的详细说明都仅仅是示范性的和说明性的，并不限制本发明，如所要求的。
附图，将其并入本发明并并构成说明书的一部分，阐述了本发明的几个实施方案，并与说明书一起起解释本发明原理的作用。


图1图解了封闭肝静脉(3)的气囊导管(4)。导管通过颈静脉(5)插入，经过上腔静脉(1)、心脏(2)，并进入肝静脉(3)内。
图2图解了在兔子模型中通过肝静脉的病毒气囊导管给药的荧光斑点影像。虚线表示腔静脉和四个主要的肝静脉。可见导管向下通过上腔静脉进入右侧的尾叶内，在那里封闭气球，使造影剂膨胀，阻断从静脉中流出。可见包含造影剂的注射液突出了该叶的静脉分支(虚线的圈)。仅在病毒注射之前记录影像，并说明选择的肝静脉的气囊介导的封闭的明显性。
图3图解了在肝静脉内气囊导管(4)的荧光影像(HV区)。在下腔静脉内使第二个气囊(6)膨胀(IVC区)。
图4图解了用于分离肝脏静脉排出物的双气囊技术。一个气囊(7)经由在通过颈静脉(5)插入之后的上腔静脉(1)向肝脏前进。第二个封闭的气囊(8)通过下腔静脉(18)插入。第一个气囊(7)封闭了位于肝静脉(3、10、11)上方的一部分下腔静脉，第二个气囊(8)封闭了位于肝静脉(3、10、11)下方的一部分下腔静脉(18)。第三导管(9)用于灌输药剂。
图5图解了另一个双气囊技术。气囊(12、13)用于封闭，管腔可延伸通过一个或两个气囊(12、13)的以便治疗剂可以通过一个或两个导管头(14、15)上的孔注入。
图6图解了在给药1.5×1012vp/kg的Ad2-βgal之后，使用气囊导管和首次用于Ad2实验的兔子，β-半乳糖苷酶表达的分布作为3ml(A、B、C)、8ml(D、E、F)或20ml(G、H、I)的注射量的函数(function)。由免疫组织化学处理计算的表达用2个注射的动物典型的显微照片以10X显示注射的肝叶(肝叶1)和未注射的肝叶(肝叶4)(A、B、D、E、G、H)。细菌β-半乳糖苷酶在每个肝叶的3个核心中的表达(C、F、&I)如示意图所示；注射的肝叶用阴影表示。号码表示在β-半乳糖苷酶/mg蛋白的相对光单位的表达。为简单起见，肝叶是有限的。注意注射的肝叶(肝叶1)为如图2所示的限定的肝叶。
图7图解了在对首次用Ad2实验的兔子(A、C、E)和用包含抗-Ad2抗体的人类血清被动免疫的兔子(B、D、F)，进行包含全身给药8ml量的1.5×1012vp/kg的Ad2-βgal之后，β-半乳糖苷酶表达的分布。2-3个注射的动物典型的显微照片以10X和40X显示β-半乳糖苷酶在肝叶1中表达的免疫化学定位。由ELISA测定的示意图显示了首次用于实验的(E)和被动免疫(F)的兔子的β-半乳糖苷酶表达的分布(因为这是全身给药，不可能区分肺叶)。
图8图解了在对首次用于实验的兔子(A-E)和对被动免疫Ad2的兔子(F-J)使用气囊导管和8ml量给药1.5×1012vp/kg的Ad2-βgal之后，β-半乳糖苷酶表达的分布。由免疫组织化学处理计算的用3个注射的兔子典型的显微照片以10X和40X显示注射的肝叶(肝叶1；A、C、F、H)和未注射的肝叶的表达(肝叶4；B、D、G、I)。由ELISA测定的在每个肝叶中的表达如图所示；注射的肝叶用阴影表示。数字表示在来自每一肝叶的3个组织核心中pgβ-半乳糖苷醜酶/μg蛋白的平均表达。
图9定量表示了在递送根据本发明的方法的病毒基因治疗剂之后，表达转基因的肝细胞和非肝细胞的数目。在每个肝叶的每1mm2区域上β-半乳糖苷酶阳性的肝细胞(填满的条)和非肝细胞(空白的条)数目的变化量，所述肝叶按照局部(A、B和C)或全身(D和E)以相同量(8ml)递送相同数量的病毒(1.5×1012vp/kg的Ad2-βgal)到首次用于实验的兔子(A和D)或用包含抗-Ad2抗体的人血清被动免疫的兔子(B、C和E)。在(C)中的动物注射肝叶在8ml病毒给药之前立即用20ml的生理盐水冲洗。括号内的数字表示在每个给定肝叶中全部β-半乳糖阳性细胞中β-半乳糖阳性肝细胞的分数。肝叶号数1和4相应于图6-8中所示的肝叶(A、B、C&E、N＝30块，D；N＝45块)。
图10阐述了在向三只自然首次接受实验的兔子，使用气囊导管介导的经由局部给药肝脏的总量8ml 5×1012滴度的AAV2DC 190HAGAL病毒之后人α-半乳糖苷酶在84天内的表达。在全部84天期间，在三只兔子的两只中发现表达，在第三只兔子中在第7天和第14天之间开始，直到84天期间的其余天。
图11A图解了感染的肝细胞分数，其为在根据本发明的方法用4分钟的接触时间将8ml量的Ad2βgal病毒(1.5×1012vp/kg)的局部的导管介导递送到首次接受实验的兔子中，表达转基因的肝细胞相对于表达转基因的所有细胞的比例。用两个注射的肝叶和一个未注射的肝叶组成的三部分来测定β-半乳糖苷酶阳性的肝细胞和非肝细胞数目的变化量。每个条带表示一个肝细胞部分分析中肝细胞的分数[转染的肝细胞/(转染的肝细胞+转染的非肝细胞)]。条带8-20和8-22表示用4分钟停留时间处理的兔子，而条带4、5和1表示根据在前的实验使用除停留时间之外相同的方法，用1分钟停留时间处理的兔子。
图11B图解了在使用气囊导管向兔子给药1.5×1012vp/kg的Ad2-βgal，并用1)4分钟的接触时间(8-20和8-22)和与在前的实验其他方面相同条件；2)1分钟接触时间(4、5和1)之后，通过ELISA测定的β-半乳糖苷酶表达的分布。在四个肝叶、肺、肾和脾中测定表达。从每个测定表达的肝叶中取三个组织核心；它们在肝叶中近端的、中间的和远端的达到肝叶的入口肝静脉进入静脉腔之内的程度。RCP、RCM、RCD分别指右侧的肝叶(注射的肝叶)，近端、中间和远端。RLP、RLM、RLD分别指右侧中间的肝叶，近端、中间和远端。MP、MM、MD分别指左侧中间的肝叶，近端、中间和远端。LP、LM、LD分别指左侧的肝叶，近端、中间和远端。
具体实施例方式
现在详细参考本发明现有的实施方案，其中的实例结合附图进行阐述。只要可能，在提到相同或类似部分的附图各处使用相同的参考数字。
除非另有说明，本发明的实施使用分子生物学(包括重组DNA技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规方法，所述方法都属于本领域。这些技术在文献中有充分地阐述，例如，分子克隆A Laboratory Manual，第二版(Sambrook等人，1989)；分子生物学中的现有技术(F.M.Ausubel等人，eds.，1987)；低聚核苷酸合成(MJ.Gait，ed.，1984)；动物细胞培养(R.I.Freshney，ed.，1987)；酶学中的方法(Academic Press，Inc)；实验免疫学手册(D.M.Wei & CC.Blackwell，eds)；哺乳动物细胞基因递送载体(J.M.Miller& M.P.Calos，eds.，1987)；PCR聚合酶链式反应(Mullis等人，eds.，1994)；免疫学中的现有技术(J.E.Coligan等人，eds.，1991)；抗体实验指南(E.Harlow和D.Lane eds.(1988))和PCR2应用方法(M.J.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor eds.(1995))。
术语“转基因”指引入组织或器官的细胞中并能够在适当的条件下表达的多聚核苷酸，或相反地给细胞带来有益特性。基于想要治疗的效果来选择转基因。其可编码例如激素、酶、受体或其它需要的蛋白质。其还可以编码小干扰RNA(siRNA)或反义RNA以便减少或除去内源或外源给予基因的表达。例如，在家族性高胆甾醇血症的治疗中，可使用编码LDL受体的转基因(Kobayashi等人，J.Biol.Chem.2716852-6860)。
术语“转染”可互换地以术语“基因递送”和“转导”使用，指转基因的胞内导入。“转染效率”指受转染的细胞所接受的转基因的相对数量。实际上，转染效率是通过转染之后的报道基因产物表达的量来估算的此处所用的基因递送、基因传送等是关于将外源多聚核苷酸(有时称为“转基因”)导入寄主细胞的术语。导入的多聚核苷酸在寄主细胞中可为稳定的或瞬时的。稳定的维持一般要求包含和宿主细胞相容的复制原点或整合进宿主细胞的复制子，例如染色体外的复制子或核或线粒体染色体中。如现有技术和此处所描述的，已知一些病毒载体能够调节基因递送到哺乳动物细胞中。
将外来的多聚核苷酸插入病毒载体中来经由本发明的方法递送到寄主中。已知许多病毒载体，包括已经为了基因治疗目的而研究的每个的许多种和许多个。最通常使用的病毒载体包括来源于腺病毒、腺相关病毒(AAV)和逆转录病毒，包括慢病毒，例如人类免疫缺陷性病毒(HIV)。
术语“病毒”指能将DNA或RNA转运到细胞的试剂，其为必要的活的胞内生命体但为非细胞性质，由DNA或RNA和蛋白质外壳组成。病毒不包括裸DNA、裸RNA、没有蛋白质外壳的质粒DNA或没有蛋白质外壳的RNA。适用于本发明的方法的病毒包括例如腺病毒、腺相关病毒、甲病毒、杆状病毒、hepadenaviruses、杆状病毒、痘病毒、疱疹病毒、逆转录病毒、慢病毒、正粘液病毒、乳多空病毒、副粘液病毒和细小病毒。另外，可能用到由任何这些病毒组合的杂种病毒。这些包括腺病毒载体、腺病毒相关病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体和质粒载体。病毒的典型种包括HSV(单纯疱疹病毒)、AAV(腺相关病毒)、HIV(人类免疫缺陷性病毒)、BIV(牛类免疫缺陷性病毒)和MLV(鼠科的白血病病毒)。
在利用本发明的方法选择病毒来递送给特定的哺乳动物中，特定病毒的特有的血清型可根据想到要治疗的哺乳动物来选择。血清型是从在这样的哺乳动物中分离的和/或可能对于治疗的特定靶哺乳动物的特定靶器官具有增强的趋向性的血清型中被选择出来的。
替代地，在利用本发明的方法来选择病毒用于递送给特定哺乳动物中，可选择在特定种类的哺乳动物中不被分离出的血清型。
腺病毒是具有大约36kb的基因组的非包被的、核DNA病毒，其通过对经典遗传学和分子生物学的研究已经被很好地表征了(Hurwitz，M.S.，腺病毒病毒学，第三版，Fields等人，eds.，Raven Press，New York，1996；Hitt，M.M.等人，腺病毒载体，人类基因疗法的发展，Friedman，T.ed.，Cold SpringHarbor Laboratory Press，New York 1999)。根据病毒蛋白质的两个暂时分类的世代，将病毒基因区分为早期(称为E1-E4)和晚期(称为L1-L5)转录单元。这些时期的定界线是病毒DNA复制。基于包括红血球的血凝集作用、致癌性、DNA和蛋白质的氨基酸组成和同源性以及抗原性的关系，人类腺病毒被分成许多血清型(大约47种，因此编号并分为6组A、B、C、D、E和F)。
重组腺病毒载体具有用于基因运载工具的几个优点，包括对分裂和非分裂细胞的趋向，最小化发病潜在性，具有复制到高滴度来制备载体库的能力和传送大的插入物的潜在性(Berkner，K.L.，Curr.Top.Micro.Immunol.15839-66，1992；Jolly，D.，Cancer Gene Therapy 151-64 1994)。缺失各种腺病毒基因序列的腺病毒载体，例如假腺病毒载体(PAVs)和部分缺失的腺病毒(称为″DeAd″)，被设计成能利用腺病毒的可取的使其成为适当的载体的特点来将核苷酸递送到受体细胞。
特别地，假腺病毒载体(PAVs)，亦称“假腺病毒”或小腺病毒载体，是来源于包含载体基因组复制和包装所需要的最小顺式作用核苷酸序列，并可包含一个或多个转基因的腺病毒基因组的腺病毒载体(参见美国专利No.5,882,877，其涉及假腺病毒载体(PAV)和用于生产PAV的方法，作为参考并入此处)。PAVs被没计成能利用腺病毒的可取的使其成为基因递送的适当载体的特点。腺病毒载体通常可以由对于病毒生长非必需的缺失区域携带最多8kb大小的插入物，最大承载量可以借助于包含最多病毒编码序列的缺失的腺病毒载体，包括PAVs来实现。参见Gregory等人的美国专利No.5,882,877；Kochanek等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 935731-5736，1996；Parks等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9313565-13570，1996；Lieber等人，J.Virol.708944-8960，1996；Fisher等人，Virology 21711-22，1996；美国专利No.5,670,488；PCT公开号WO96/33280，1996年10月24日公开；PCT公开号WO96/40955，1996年12月19日公开；PCT公开号WO97/25446，1997年7月19日公开；PCT公开号WO95/29993，1995年11月9日公开；PCT公开号WO97/00326，1997年1月3日公开；Morral等人，Hum.Gene Ther.102709-2716，1998。可容纳达到大约36kb的外源核酸的这种PAVs是有益的，因为该载体的承载能力最优化的，寄主对载体或有复制能力的病毒的世代的免疫应答的潜力减小了。PAV载体包含5′颠倒末端重复(ITR)和包含复制原点和PAV基因组包装所需要的顺式作用核苷酸序列的3′ITR核苷酸序列，并能容纳含有适当的调节元件例如启动子、增强子等的一个或多个转基因。
另外，部分缺失腺病毒载体提供了部分缺失腺病毒(称为“DeAd”)载体，其中从载体上删除了病毒复制所需要的大部分腺病毒早期基因，并置于在条件启动子控制下的生产细胞染色体。置于生产细胞中的可删除腺病毒基因可包括E1A/E1B、E2、E4(仅ORF6和ORF6/7必须被放入细胞)、pIX和pIVa2。E3也可以从载体上删除，但因为它不是载体生产所需要的，所以可从生产细胞中省略。通常在主要晚期启动子(MLP)控制下的腺病毒后期基因存在于载体中，但MLP可能被条件启动子所替代。
适合用于PAV或DeAd病毒载体和生产细胞系的条件启动子包括具有下列特征的启动子在未诱导状态下低基础表达，以便细胞毒素或抑制细胞生长的腺病毒基因不在对细胞有害的水平上表达；在诱导状态下高水平表达，以便产生足够数量的病毒蛋白来维持载体复制和装配。优选的适合用于DeAd载体和生产细胞系的条件启动子包括二聚物聚合基因操纵系统、基于免疫抑制的试剂FK506和雷帕霉素、蜕皮激素基因操纵系统和四环素基因操纵系统。对本发明有用还有Abruzzese等人，Hum.Gene Ther.1999 101499-507所描述的GeneSwitchTM技术[Valentis，Inc.，Woodlands，TX]，将其所公开的内容作为参考并入此处。进一步在WO99/57296中描述了部分缺失腺病毒表达系统，将其所公开的内容作为参考并入此处。
腺病毒相关病毒(AAV)是单链人类DNA细小病毒，其基因组具有4.6kb大小。AAV基因组包含两个主要基因rep基因，其编码rep蛋白(Rep76、Rep68、Rep52和Rep40)和cap基因，其编码AAV的复制、拯救、转录和整合，而cap蛋白形成AAV病毒颗粒。
AAV起源于它的依靠腺病毒或其它辅助病毒(例如疱疹病毒)的名称来提供重要的基因产物以使AAV进行有效感染，即在寄主细胞中的自然增殖。在没有辅助病毒的情况下，AAV作为前病毒整合进宿主细胞的染色体中，直到其被用辅助病毒(通常是腺病毒)重复侵染的宿主细胞拯救为止(Muzyczka，Curr.Top.Micro.Immunol.15897-127，1992)。
对AAV作为基因递送载体发生兴趣是由于它在生物学上的几个独特性质。在AAV基因组的两端是被称为颠倒末端重复(ITR)的核苷酸序列，其包含病毒复制、拯救、包装和整合所需要的顺式作用核苷酸序列。在转运中由rep蛋白所介导的ITR的整合功能使AAV基因组在没有辅助病毒的情况下，在感染之后整合到细胞染色体中。该病毒的这个独特的性质与AAV在基因递送中的应用相关，因为其允许将包含目的基因的重组AAV整合进细胞基因组。所以，对于基因递送的许多目标来说理想的稳定遗传转化可通过rAAV载体来实现。此外，AAV的结合部位已经确定，并已经定位于人类的19号染色体上(Kotin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.872211-2215，1990)。结合部位的可预测性减少了随机插入到细胞基因组内的危险，所述随机插入可能活化或钝化宿主基因或断开编码序列，结果能限制AAV整合载体的使用，所以，对于基因递送的许多目标来说理想的稳定遗传转化可通过rAAV载体来实现。此外，AAV的结合部位已经确定，并已经定位于人类的19号染色体上(Kotin等人，Proc.Natl.Acad.Sci.872211-2215，1990)。结合部位的可预测性减少了随机插入到细胞基因组内的危险，所述随机插入可能活化或钝化宿主基因或断开编码序列，结果能限制AAV整合载体的使用，设计rAAV载体的该基因的去除可导致改变的整合模式，其在rAAV载体中被观察到(Ponnazhagan等人，Hum Gene Ther.8275-284，1997)。
将AAV用于基因递送还存在其它的好处。AAV的寄主范围很宽。而且，与逆转录病毒不同，AAV可感染静态的和分裂的细胞。另外，AAV与人类疾病无关，避免了逆转录病毒衍生基因递送载体所带来的许多担心。
产生重组rAAV载体的标准方法要求一系列胞内事件的协调用包含由AAV ITR序列位于侧面的目的转基因的rAAV载体基因组来转染宿主细胞，由编码转运中所需AAV rep和cap蛋白的基因的质粒来转染宿主细胞，以及用提供转运中所需非AAV辅助功能的辅助病毒来感染转染细胞(Muzyczka，N.，Curr.Top.Micro.Immunol.15897-129，1992)。腺病毒(或其它辅助病毒)蛋白活化AAV rep基因的转录，然后rep蛋白活化AAV cap基因的转录。然后cap蛋白利用ITR序列来将rAAV基因组包装入rAAV颗粒中。所以，包装的效率部分地由足够量的结构蛋白的可用性和在rAAV载体基因组中所需的所有顺式作用包装序列的可及性所决定。
逆转录病毒载体是基因递送的通用工具(Miller，Nature(1992)357455-460)。逆转录病毒载体将未重排的单拷贝基因递送入大量啮齿类、灵长类和人类体细胞中的能力使其很适合向细胞递送基因。
逆转录病毒是RNA病毒，其中病毒基因组是RNA。当用逆转录病毒感染宿主细胞时，基因组RNA反向转录到DNA中间体内，所述DNA中间体非常高效地整合入感染细胞的染色体DNA中。该整合的DNA中间体被认为是一种前病毒。前病毒的转录和装配到有感染力的病毒中发生在存在适当的辅助病毒或在包含在没有同时产生污染的辅助病毒的条件下使包装能够进行的适当序列的细胞系的情况下。如果用于包装的序列是由用适当载体共转染所提供的，则辅助病毒不是生产重组逆转录病毒所需的。
逆转录病毒基因组和前病毒DNA具有三个基因gag、pol和env，在其侧面有两个长末端重复(LTR)序列。gag基因编码固有的结构(基质、衣壳和核衣壳)蛋白；pol基因编码RNA指导的DNA聚合酶(逆转录酶)并且env基因编码病毒包膜糖蛋白。5′和3′LTR用于促进病毒RNA的转录和多腺苷酸化。LTR包含病毒复制所必需的全部其它顺式作用序列。慢病毒具有包括vit、vpr、tat、rev、vpu、nef和vpx(在HIV-1、HIV-2和/或SIV中)的附加基因。邻近5′LTR的是基因组逆转录所必需的序列(tRNA引物结合位点)和用于将病毒RNA有效壳体化到颗粒所必需的序列(Psi位点)。如果壳体化(或逆转录病毒RNA包装到感染性病毒颗粒内)所必需的序列从病毒基因组中缺失，则导致妨碍基因组RNA壳体化的顺式缺陷。但是，产生的突变体仍能指导所有病毒颗粒蛋白的合成。
慢病毒是复杂的逆转录病毒，除了通用的逆转录病毒基因gag、pol和env之外，其包含其它具有调节或结构上的功能的基因。高度的复杂性使慢病毒能够在潜伏感染期间调节其生活周期。典型的慢病毒是人类免疫缺陷性病毒(HIV)，AIDS的病原。在体内，HIV可以感染极少分裂的末端分化细胞，例如淋巴细胞和巨噬细胞。在体外，HIV可感染单核细胞起源的巨噬细胞(MDM)的原代培养物以及用阿非迪霉素或γ射线照射处理的细胞周期停止的HeLa-Cd4或T淋巴样细胞。细胞的感染取决于通过靶细胞核孔的HIVpreintegrate复合物活化的核输入。这是通过靶细胞的核输入结构与复合物中多重、部分多余、分子的决定子相互作用来实现的。鉴定决定子包括gag基质(MA)蛋白中的有功能的核定位信号(NLS)、karyophilic病毒颗粒相关蛋白、vpr和gag MA蛋白的C-末端磷酸酪氨酸残基。例如美国专利6,013,516和美国专利5,994,136中描述了逆转录病毒在基因治疗中的应用，其所公开的内容因此并入此处作为参考。
关于适用于本发明的方法的病毒的附加信息可以在许多病毒学教科书中找到(Friedman，Theodore；The Development of Human Gene Therapy，Cold Sprng Harbor Laboratory Press，1998)。
本发明的方法所使用的病毒载体包含表达盒，其含有调控元件，例如启动子和增强子，可操作地与选择的转基因相连。用于选择的病毒载体中的适当的启动子和增强子在现有技术中广泛存在。在优选的实施方案中，调控元件包含启动子和增强子元件的组合，优选其能在肝脏中指导转基因的表达，例如在PCT US 00/31444中所描述的，其公开的内容作为参考并入此处。其也包含组成型的或高表达启动子和一个或多个肝脏特异性增强子元件的组合。
强组成型启动子可选自由以下启动子组成的组CMV启动子、截短的CMV启动子、人血清白蛋白启动子和α-1-抗胰蛋白酶启动子。在其它的实施方案中，启动子是截短的CMV启动子，其对于已知的翻译阻遏子的结合位点已经被删除了。肝脏特有的增强子元件可选自由以下增强子组成的组人血清白蛋白(HSA)增强子、人凝血酶原(HPrT)增强子、α-1-微球蛋白增强子和intronic醛缩酶增强子。一个或多个这些肝脏特有的增强子元件可与启动子组合使用。在表达盒的一个优选实施方案中，一个或多个HSA增强子与选自由CMV启动子或HSA启动子组成的组的启动子组合使用。在另一个优选实施方案中，一个或多个选自由人凝血酶原(HPrT)增强子和α-1-微球蛋白(A1MB)增强子组成的组的增强子与CMV启动子组合使用。在又一个优选实施方案中，增强子元件选自由HPrT增强子和A1MB增强子组成的组，并与α-1-抗胰蛋白酶启动子组合使用。
本发明提供了一种将病毒基因治疗的试剂递送到哺乳动物受试者选择的器官，以便表达由病毒基因治疗剂编码的蛋白的方法。本方法包括以下步骤在引流器官或器官的部分的静脉脉管系统内放置一个或多个导管；至少一个导管具有一个或多个膨胀的可扩大的构件；在通过使一个或多个膨胀的可扩大的构件膨胀来在引流器官或器官的部分的静脉脉管系统内通过封闭液体的流动来分离器官或器官的部分；在分离的器官或器官的分离的部分中用导致静脉脉管压力与正常静脉压相比升高不超过40％的量来递送病毒基因治疗剂；并使基因治疗剂在脉管系统的离体部分内保留一段足够的时间以使治疗上有效量的试剂来转染。该方法也选择性地包含在递送病毒基因治疗剂之前冲洗静脉脉管系统来去除抗病毒抗体的步骤。
在本发明的方法中，将病毒基因治疗剂以足以充满引流分离的器官或器官的分离的部分的静脉脉管系统的量来递送，而不将在所述静脉脉管系统内的压力提高到明显高于该分离的器官或器官的分离的部分的正常静脉压。至于肝脏，在分离的器官或器官的分离的部分内正常静脉压按楔形肝脏静脉压(WHVP)来调节。通过将气囊导管插入到肝静脉中，并膨胀气囊导管来封闭肝脏静脉来测定WHVP。在封闭的静脉中的压力是由在气囊导管顶部尖端的压力传感器来测定的，并且该测得压力等于WHVP。人类受试验者中WHVP的典型值是40到140mm生理盐水。较高值可能存在于肝病、脉管病或心脏病的患者。
在本发明的方法中，将病毒基因治疗剂递送到引流分离的器官或器官的分离的部分的静脉脉管系统中。对于递送到整个器官，其对本领域技术人员来说，引流器官的静脉脉系统显然是指引流整个器官的静脉脉管系统。对于肝脏，引流肝脏的静脉脉管系统是指肝静脉、右或左肝静脉、小叶下静脉、中央静脉和窦状隙。门静脉不被认为是引流肝脏的静脉脉管系统的一部分。此外，对于肝脏，根据本发明的方法，引流器官的静脉脉管系统的一部分可能是封闭的来分隔出器官的一部分。本领域技术人员将认识到根据本发明的方法引流器官和分离器官的部分的静脉脉管系统的部分，可能通过用一个导管注入射线照片造影剂来进行鉴定，所述导管用于递送病毒治疗试剂。通过注入等于可用于相同的分离的器官或器官的分离的部分的病毒治疗剂的量的造影剂，离体部分将通过荧光镜透视检查来识别。对于肝脏，注入到封闭肝静脉或肝静脉的封闭部分的造影剂将在荧光检查下显示将被分隔的肝脏部分。
对于本发明的目的，当注入到分离的器官或器官的分离的部分时，可选择导致分离的器官或器官的分离的部分的静脉压与分离的器官或器官的分离的部分的正常静脉压相比升高10％、20％、30％或40％的注射量。再对于肝脏，引流肝脏的静脉脉管系统的正常静脉压是由WHVP来调控的。对于100mm生理盐水的WHVP，选择的注射量导致WHVP升高到不超过10mm生理盐水(0.75mm Hg)、不超过20mm生理盐水(1.5mm Hg)、不超过30mm生理盐水(2.25mm Hg)或不超过40mm生理盐水(3.0mm Hg)。可选择注射量等于治疗的靶器官或靶器官部分的量的1-5％、5-10％、10-20％、20-30％或30-40％。
在本发明的方法中，可将病毒基因治疗剂递送给对于病毒预先存在免疫性的哺乳动物受试者，例如人类。可通过受试者的血清中病毒治疗剂的一部分的抗体的存在或通过识别对于病毒基因治疗剂的细胞免疫反应来辨别预先存在的免疫性。抗体可能直接对应于病毒上或其内部包含的蛋白，或对应于在病毒内包含的DNA或RNA。用于在受试者的血清中鉴定抗体的各种方法包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫试验(RIA)或凝集试验。鉴定细胞免疫反应的方法包括混合淋巴细胞反应和细胞介导淋巴细胞溶解试验。用于识别抗体或测定细胞免疫反应的这些方法在一般的免疫学教科书中进行了描述(Kuby，Janis；Immunology，3rdEdition，1997；Roitt等人，Immunology，6thed.，2001，Mosby)。
在本发明的方法中，将病毒基因治疗剂递送到引流器官或器官的部分的分离静脉脉管系统中以便在器官的靶细胞中表达由病毒基因治疗剂编码的蛋白。因为器官是由各种细胞类型组成的，所以该发明提供了使在靶实质细胞中与在非靶细胞中表达的比例达到最大值的方法。表达病毒编码蛋白的细胞被定义为已经被本发明的方法的病毒治疗剂所感染，并随后产生由病毒治疗剂编码的蛋白的那些细胞。
对于肝脏，靶实质细胞是肝细胞，非靶细胞是非肝细胞。非肝细胞包括脉管内皮细胞、枯否(氏)细胞和支持的基质细胞。因此，在本发明的方法中，表达由病毒基因治疗剂编码的蛋白的肝细胞与表达由病毒基因治疗剂编码的蛋白的非肝细胞的比例将被最大化。该比例可能是至少0.2、至少0.3、至少0.4、至少0.5、至少0.6、至少0.7、至少0.8或至少0.9。
在本发明的实施方案中，使用小量的病毒基因治疗剂转染单个肝叶。将气囊封闭的导管(4)通过颈静脉(5)插入，经由上腔静脉(1)前进，并进入想要到达的肝静脉(3)，如图1所示。在血管内经导管注射转染因子之前短时间内，将导管上的气囊(17)膨胀来阻挡静脉流出物，从而将注入的溶液限定在进入分离的靶肝叶的实质细胞中的范围内。本领域技术人员认识到通过使用经由除了颈部静脉的许多解剖学部位的静脉脉管系统可以实行相同的方法。例如，也可使用股静脉。
在本发明的另一个实施方案中，转染单个肝叶。气囊封闭(4)导管被放置在所选择的肝脏静脉的腔管内。第二封闭气囊(6)位于下腔静脉的肝脏部分来阻挡肝脏的静脉流出物，如图3所示。在转染因子经导管注射之前，气囊(4、6)在下腔静脉和肝静脉之内膨胀来阻挡静脉流出物，从而将注入的溶液限制在进入分离的靶肝叶的实质细胞中。
在本发明的又一个实施方案中，以单次注射将转染因子递送到整个肝脏。如图4所示，通过使用在下腔静脉(18)中膨胀的两个分离的双内腔气囊导管(7、8)，在上腔和下腔(阻挡)肝脏静脉流出物来分离肝脏。然后将转染剂经由位于气囊之间的血管内的导管(9)注入，并经肝静脉以逆行的方式流入整个肝实质中。如图4所示，血管内的导管(9)可与气囊封闭导管(15)之一相结合，降低必须配置的导管的数目。在本发明的所有实施方案中，将气囊调整到每个患者脉管的大小以保证在过程中防止损伤靶器官脉管流出物的堵塞。本发明的方法包括在基因治疗的过程中病毒基因治疗剂的应用，但是，该方法同样适用于化学疗法或其它药物因子、干细胞或图象照影物质的治疗剂注射，其要求诊断或治疗的溶液在可控压力下定向递送到分离的器官中。
本发明的方法也可包括在病毒给药之前的一个“冲洗”步骤。冲洗使用生理学上适当的溶液，例如生理盐水，来在病毒给药之前充满或部分地充满分离的器官或器官的部分。对于理论没有限制地，冲洗溶液稀释了器官的血液和生理性液体以致使流体组分和病毒之间的潜在的相互作用减到最低程度。通过将这些相互作用减到最低程度，增加了整个器官的转染。在优选的实施方案中，当肝脏是靶器官时，在病毒给药之前的冲洗步骤可以增加转染的肝细胞的数目和比例。在另一个优选的实施方案中，在病毒给药之前的冲洗步骤增加了在对于给药的病毒载体具有预先存在的免疫性的动物中转染的肝细胞的数目和比例。
本发明的方法也可包括病毒基因治疗剂的停留时间的变化。停留时间是在把病毒基因治疗剂注入到靶器官之后和在封闭气囊放气之前的时间从而恢复了通过靶器官的正常血流。停留时间可为最小限度的，其中注入病毒基因治疗剂然后立即恢复。停留时间可被延长，其中允许病毒基因治疗剂在靶器官内停留一段时间，而不会使与该方法有关的急性毒性增加到超过2等毒性。这段时间取决于在事件中的特定靶器官，并可能由本领域技术人员容易地确定。延长的停留时间可能是至少两分钟、至少三分钟、至少四分钟、至少五分钟或更长。能够具有停留时间是本发明的一个特色，其可能是由于递送过程的逆行性。因为该方法经由逆行流动递送载体，所以靶器官可能被封闭以便允许病毒与器官组织保持经常的联系。对于在现有技术中使用的顺行递送方法，这样的停留时间通常是不可能的。在这些顺行方法中，正常血流不可能被安全地封闭。
也可在病毒基因治疗载体给药之前或伴随给药来给予动物免疫抑制试剂，以便最小化或减少对于，例如，病毒载体或转基因产物的免疫反应的可能性。例如，试剂可能用于抑制细胞毒性淋巴细胞，其可识别任何表达的病毒壳体蛋白，并因此可以除去转导细胞。在器官移植领域通常使用的免疫抑制试剂很可能是适合于与本方法结合使用的免疫抑制试剂。这样的试剂可单独使用或与其它这样的试剂结合使用。这些免疫抑制试剂可包括被用来诱导和/或被用来维持的试剂。典型的试剂包括环孢霉素(Neoral，Sandimmune)，强的松(Novo Prednisone，Apo Prednisone)，硫唑嘌呤(Imuran)，他克莫司或FK506(Prograf)，麦考酚酸吗乙酯(mycophenolatemofetil)(CellCept)，西罗莫司(sirolimus)(Rapamune)，OKT3(Muromorab CO3，Orthoclone)，ATGAM & Thymoglobulin。但是，可使用实现免疫抑制的任何临床上批准的试剂。在现有技术中通常应用有效的免疫抑制剂方案。因此，适当的方案和剂量取决于在事件中的特定靶器官，并可能由本领域技术人员容易地确定。
本发明的方法也可包括各种特定的实施方案的组合。例如，在病毒递送之前器官的冲洗可与延长的保留时间组合应用。或者在病毒递送之前器官的冲洗可与免疫抑制方案组合应用。或者在病毒递送之前器官的冲洗可与选择的对于治疗的哺乳动物具有增强的定向的血清型的应用相组合。或者在病毒递送之前器官的冲洗可与延长的保留时间和免疫抑制方案组合应用。所述的例子是用来说明，而不是限制本发明。
编码当存在于靶器官或者当分泌到血流中时有用的分子的转基因适合用于本方法。这样的分子可包括蛋白和激素。典型的蛋白包括下列的溶酶体存储病症缺陷蛋白表1


*包含CNS其它的典型蛋白是治疗哺乳动物，包括人类中的其它疾病例如阿尔茨海默氏病的蛋白。在这样的方法中，转基因编码metalloendopeptidase。metalloendopeptidase可以是，例如淀粉状-β降解酶neprilysin(EC3.4.24.11；序列登录号，例如P08473(SWISS-PROT))、胰岛素-降解酶insulysin(EC 3.4.24.56；序列登录号，例如P14735(SWISS-PROT))或甲拌磷寡肽酶(EC 3.4.24.15；序列登录号，例如P52888(SWISS-PROT))。
另外，该转基因可编码选自由胰岛素生长因子-1(IGF-1)、钙结合蛋白D28、细小白蛋白、HIF1-α、SIRT-2、VEGF、SMN-1、SMN-2、GDNF和CNTF(睫状神经营养性因子)。这样的蛋白可能适合于利用经过随着分泌到血流中的调节作用的该方法来治疗肌萎缩性侧索硬化(ALS)。ALS是累进的、致死性神经肌肉的疾病，其与脊椎和脑干运动神经的退化有关。该疾病的发展可以导致肢体、中轴和呼吸肌的退化。在小鼠和大鼠中超氧化物歧化酶-1(SOD1)基因突变体的过表达概括了人类中ALS的临床和病理学的特征。在该模型中在延迟症状中的化合物活性已经被证明了其对于ALS患者所预测的临床功效，因此是该疾病的治疗上的相应模型。以前已经描述了这样的小鼠模型Tu等人(1996)P.N.A.S.933155-3160；Kaspar等人(2003)Science 301839-842；Roaul等人(2005)Nat.Med.11(4)423-428和Ralph等人(2005)Nat.Med.11(4)429-433。
在另一个实施例中，转基因可能编码血友病缺陷蛋白，例如因子VIII或因子IX。所述的例子是用来说明，而不是限制本发明。
下列典型的例子是用来说明，而不是限制本发明。典型的方法在兔子中施行，其也可以在其它哺乳动物例如非人灵长类和人类受试者中以临床上可行的参数来成功地施行。
实施例1导管介导的腺病毒基因治疗载体向兔子肝脏递送对于每个试验，都使用每个大约4千克重量的新西兰白兔(Millbrook农场，Amherst，MA)。使用的腺病毒载体Ad2βgal具有血清型2的骨架，并删除了E1，但保留了E3和E4区。表达盒由巨细胞病毒(CMV)近早期启动子和增强子、核定位β-半乳糖苷酶的cDNA和SV40多腺苷酸信号组成(Armentano，D.等人(1997).J.Virol.712408-2416)。给每个兔子注射1.5×1012病毒颗粒/千克(颗粒∶有感染力的单位之比＝10∶1)的Ad2βgal病毒。
如下利用本发明的方法的实施方案将腺病毒基因治疗载体递送到兔子的肝脏中。为了进入兔子的血管系统，通过从下颌弓开始并延伸到尾部的中线切口，随后以钝器解剖暴露于右侧的颈外静脉的肌肉组织来暴露颈静脉。将血管导管注射针插入暴露的颈静脉中，并将导线插入注射针中。在荧光检查的指导下，导线通过上腔静脉和心脏前进，并进入到肝脏静脉循环中。除去血管导管注射针，将气囊封闭导管置于导线之上，并插入到颈静脉中。在荧光检查的指导下，导管沿导线前进到肝静脉。去除导线，并注入少量的含有非离子造影剂的生理盐水来证实适当导管的定位。然后用造影剂使封闭气球膨胀，再一次通过注射小量对照介质来确定其位置。在肝静脉内封闭气囊的膨胀阻塞了引流肝脏右叶的肝静脉，如图1所示。然后将病毒溶液按大约1ml/秒的速率逆行注入到选择的肝叶中，随后注射小量(1ml)的PBS来将保留在导管系统中的任何病毒洗到肝叶中。允许病毒在组织中停留大约一分钟，在此期间防止其回流到注射管中。根据停留时间，由注射器回吸，按与注射速率近似相等的速率回收代表注射量的体积。然后将封闭气囊放气，并去除导管。实现止血。并使用适当的材料闭合切口。
使用上述的递送方法，在兔子中计算了包含相同总数的病毒颗粒(1.5×1012病毒颗粒/千克的Ad2β半乳糖苷酶载体)的几个剂量(3、8和20ml)来测定在每个剂量中由腺病毒载体介导的相关肝细胞的转导。通常的兔子肝叶估计大约是20g，其用来设置了对于病毒制剂的递送量20ml的上限。预期该上限能将病毒制剂分散到遍及注射的肝叶。根据该假设，也选择小量的3ml和8ml来达到病毒制剂在注射的肝叶中的不完全分布。三天后处理之后，杀死兔子。测定β-半乳糖苷酶在肝脏、肾、肺和脾中的表达。
表达的特点在于使用AMPGD(β-半乳糖苷酶的chemiluminogenic底物，3-{4-Methoxyspiro[1，2-dioxetane-3，29-三环(3.3.1.13，7癸醛]苯基β-D吡喃半乳糖苷(galactopyranoside))使用基于荧光的试验来获得相对表达水平。在荧光试验中，使用Janke和Kunkel Ultra-Turrax T25均质器将100到200mg的组织匀化在2X量的1X溶解缓冲液(Tropix Galacto-Light PlusKit，Tropix)中。匀浆物经过两轮冻融，随后在48℃水浴中热失活内源的β-半乳糖苷酶1小时。将样品在4℃下以14,000rpm离心10min，并将上清液递送到干净的1.5ml Eppendorf试管。使用Micro BCA蛋白分析试剂盒(Pierce)测定每个样品的蛋白质浓度，并使用BioRad EIA底片读取器来读取在570nm处的吸光度。使用Tropix Galacto-Light Plus Kit通过厂家的说明书来测定每个样品的β-半乳糖苷酶活性，并使用Tropix TR717微板光度计和WinGlow软件读取。
组织样品的免疫组织化学处理通常如下进行。将组织的四毫米切片在福尔马林-锌溶液中过夜固定，在PBS中漂清，嵌入石蜡中并切片。在Hemo-D，100％、95％、70％和50％的乙醇，重蒸馏水和PBS中逐次清洗来对切片去蜡(deparaffinize)。用3％过氧化氢的甲醇溶液除去内源的过氧化物活性，然后在水中再水合。在含5％羊血清的PBS中的封闭切面。切片与鼠抗-β-半乳糖苷酶一起在4℃下孵化过夜，在PBS中冲洗两次，然后在37℃下与亲合纯化的过氧化物酶标记的羊抗鼠IgG一起孵化一小时，然后在PBS中冲洗两次，在pH7.5的0.5mMTris-HCl中冲洗一次。使用液体DAB底物-色原体系(DAKO)通过厂家的说明书检测过氧化物酶标记，然后将切片甲基绿复染色。
表达β半乳糖苷酶的细胞数量的测定通常如下进行。使用MetaMorph软件来鉴别和测定被Ad2β-gal感染的肝细胞和非肝细胞的细胞核。β-半乳糖苷酶的免疫组织化学处理检测的显色时间对于确保与被感染细胞的MetaMorph检测相容来说是保持不变的。将每个肝脏部分扫描进Metamorph，并从每个肝脏部分挑选五个区域(每个1mm2)来进行MetaMorph分析。使用颜色定阈值来辨别代表阳性β-半乳糖苷酶细胞核的褐色DAB(3，3′-二氨基联苯胺)信号与非感染细胞的蓝绿色细胞核。颜色定阈值和所有后面的MetaMorph分类都通过从样品肝脏部分的细胞核的初步经验分析所优化，随后由人确认每个分类。
为了将细胞核分成肝细胞、非肝细胞或未知对象，使用MetaMorph来测定所有β-半乳糖苷酶阳性细胞核的“总面积”和“椭圆的形状因子”。总面积(TA)定义为满足颜色阀值的给定β-半乳糖苷酶阳性细胞核的所有邻近的像素的总和。椭圆的形状因子(EFF)定义为给定β-半乳糖苷酶阳性细胞核的长度除以其宽度。例如，完美的圆形的EFF是1.0，而椭圆的EFF通常大于1.25。
单一肝细胞的细胞核是大致的球形，产生EFF≤1.25和TA＝16-18的像素。双倍肝细胞的细胞核表现为两个间距小的球形，其(组织结构上地)histologically不能被MetaMorph分析，并且所产生的EFF通常大于1.5，具有TA＞18的像素。β-半乳糖苷酶阳性细胞核的非肝细胞主要来源于肝脏巨噬细胞(Kupffer细胞)和内皮细胞，并产生EFF＞1.25和TA＞6并且≤18。
由于在截面内给定细胞核的定位与定向，一些β-半乳糖苷酶阳性细胞核被分类为未知对象因为其不能精确地被区分为肝细胞或非肝细胞。未知对象被认为代表按其各自群体比例的肝细胞和非肝细胞，并不包括任何数量上的分析。未知受试者具有TA等于1但是≤6，和EFF为任意值，或TA＞6但是＜16并且EFF≤1.25。收集从兔子肝脏的四个主要叶的每个叶的近端、中间和远端的部分的五个区域(每个1mm2)，用于MetaMorph分析。
在用3ml药剂注射来治疗的兔子中，在注射的肝叶中β-半乳糖苷酶的表达是在20-300×106RLU/mg组织的范围内，其具有相对于注射部位远端的更多的表达。在未注射肝叶的表达的范围为1-12×106RLU/mg组织的范围内，其不符合近端-远端表达模式。在肾、肺和脾中的表达基本上是不可探测的，在注射的肝叶中的β-半乳糖苷酶表达细胞的免疫组织化学定位表示表达的细胞组织分布主要限于围绕中央静脉的区域，其是病毒制剂的递送路线。主要限于围绕中央静脉的区域，其是病毒制剂的递送路线。大多数的表达细胞是肝实质细胞。在非注射的肝叶中，β-半乳糖苷酶表达细胞是免疫定位主要地围绕肝门三联征的区域。
在用8ml制剂注射治疗的兔子的肝脏中β-半乳糖苷酶的表达明显地高于由3ml制剂注射得到的表达。在注射的肝叶中β-半乳糖苷酶的表达是在300-600×106RLU/mg组织的范围内，而在非注射的肝叶中的表达是在100-300×106RLU/mg组织的范围内。如用3ml注射剂量所示，在注射的肝叶的相对于注射位点的近端到远端方向的表达增加。在非注射的肝叶中，不符合近端-远端表达模式。在肾、肺和脾中的表达基本上是不可探测的，在注射的肝叶中的β-半乳糖苷酶表达细胞的免疫组织化学定位表示基本上均匀样品的表达遍及肝叶；大多数的表达细胞是肝实质细胞。如根据免疫组织化学的定位来测定的，对于肝脏结构来说，β-半乳糖苷酶的表达在非注射的肝叶中也是一样的。
在用20ml制剂注射治疗的兔子中，β-半乳糖苷酶在注射的肝叶中的表达大约是随着表达中相似的近端到远端的梯度的8ml量所获得表达的一半。在非注射的肝叶中β-半乳糖苷酶的表达是均匀分布的，并且比注射的肝叶中测定的表达低大约10倍。在注射的肝叶中的β-半乳糖苷酶表达细胞的免疫组织化学定位表示基本上均匀样品的表达遍及肝叶；大多数的表达细胞是肝实质细胞。在肾、肺和脾中的表达基本上不可探测的。
图6说明使用3、8和20ml注射量的表达分布。在免疫组织化学处理上，8ml量看来似乎在注射的肝叶(叶1)中(图6D)和非注射的肝叶(叶4)中(图6E)都产生了最大数量的表达细胞。这些定性结果被在从每个肝叶中除去的3个组织核心中的β-半乳糖苷酶蛋白水平的定量测定所证实。图6C、6F和6I示意地显示了在四个主要肝叶的每个中根据三个位置(从腔静脉到肝静脉的入口的近端、中间和远端)所决定的平均表达水平。从四个肝叶的每个表达β-半乳糖苷酶的值的总和证明8ml注射量比3ml注射量高～40％，比20ml注射量高～60％。由此分析，选择8ml量，所有后来的实验，局部的(导管)和全身的注射，都使用8ml注射量。
除全体表达之外，图6也说明了由不同的注射量引起的表达的不同分布。因此，例如，对于3ml注射量，在注射的肝叶中的表达细胞(图6A)主要限于围绕静脉的区域，而围绕肝门三联征或在非注射的肝叶中定位着相对很少的表达细胞(图6B)。与定量结果一起，在非注射的肝叶中显示较少表达的结果(图6C)表明病毒的初始分布限于围绕注射的肝静脉的接近区域。
与由3ml注射量得到的结果相反，图6也表明8ml注射量实现了病毒制剂的明显更广分布。因此，图6D显示表达细胞遍及肝脏腺泡，而不局限于肝静脉周围的区域，而图6E显示一些注射病毒已经感染了非注射的肝叶。在图6F中证实并量化了这些结果，其表现了在注射的肝叶(肝叶1)和非注射的肝叶(肝叶2、3和4)中显著的表达。这些数据是与遍及注射的肝叶的病毒制剂的初始分布相一致的，并进入非注射的肝叶的肝门和静脉循环内，其可随后再分布并感染非注射的肝叶。
预计初始病毒制剂的分配大大超出注射的肝叶的20ml注射量，在注射的肝叶(图6G)和未注射的肝叶(图6H)中产生分布广泛的但仅有较少的(与8ml量相比)表达细胞。这些定性结果被β-半乳糖苷酶的定量所证实(图6I)，并且是与注射病毒制剂很好地进入门脉循环之内的方案相一致的。
实施例2在首次用于实验的兔子中局部与全身给药的比较为了确定病毒载体的局部递送与全身递送相比是否带来了优点，将Ad2βgal病毒递送给兔子，通过1)使用如实施例1中所描述的气囊导管介导的递送来进行局部递送，或2)使用静脉注射进行全身递送。不依赖于递送路线，将1.5×1012病毒颗粒/kg的Ad2βgal病毒注射给每只兔子。
根据下列方案来进行病毒载体的全身递送。使用对耳朵安全的20-号血管导管注射针进入服镇静剂的兔子的末端耳静脉，并缠上纱布和医用绷带。路厄锁定冲洗附于导管上，以及苯海拉明；1mg/kg，给药IV以控制可能的过敏反应。将包含Ad2βgal病毒的8ml量的生理盐水以大约1ml/秒的速率注射到耳静脉中。使用实施例1所述的气囊导管-介导的递送来向肝脏的局部递送Ad2βgal病毒。
如下评估多种方法的毒性。在给予病毒之前从每个兔子收集血液，并在给予病毒之后的第一、二和三天收集血液。细胞计数的差别(白和红细胞、血红蛋白、血细胞容积计(hematocrit)、平均红细胞容积、红细胞平均血红蛋白量、具核的红细胞数、分节的(segmented)嗜异性粒细胞淋巴细胞(兔子的中性粒细胞)、单核细胞、嗜酸性细胞、嗜碱粒细胞、血小板)，可以实施血清的化学模式(profile)(碱性磷酸酶、丙氨酸氨基转移酶、天冬氨酸氨基转移酶、肌酸酶、白蛋白、总蛋白、球蛋白、总的和直接胆红素、BUN、肌酸、胆固醇、葡萄糖、钙、磷酸、碳酸氢盐、氯化物、钾和钠)。
分析治疗的兔子的肝脏的β-半乳糖苷酶的表达。如实施例1所述确定在兔子肝脏匀浆物中细菌β-半乳糖苷酶表达的数量，或使用市场上可买到的ELISA试剂盒(Roche)使用厂家的说明书来确定其数量。如实施例1所述进行组织样品的免疫组织化学处理。进行形态学来确定肝脏中的表达模式，确定了肝细胞与非肝细胞的转染比例。
图7A和7C显示了在这些动物中Ad2βgal的全身给药导致对于肝脏结构表达的相对均匀分布，并且大部分转换细胞是肝细胞，如细胞核β-半乳糖苷酶染色高亮显示了其圆核。转换细胞的均匀性实质上在全部肝叶中相同(未显示数据)，并且在图7E中显示的定量数据证实了该评价，即如ELISA所测定的，全部肝叶显示了近似相等的β-半乳糖苷酶表达。
使用相同病毒剂量和注射量(8ml)的局部递送方法，图8A表明在注射的肝叶(肝叶1)中产生的表达细胞散布在腺泡中，按照在实施例1(图6)中早期量的评价研究。在高倍放大(图8C)下，在注射的肝叶中表达细胞核定位β-半乳糖苷酶的大多数细胞是肝细胞。与注射的肝叶相比，图6B显示了在非注射肝叶(肝叶4)中表达细胞的相对数目非常少。在注射的肝叶中，在非注射肝叶中的表达细胞主要是肝细胞，并在腺泡内均匀分布。
在首次接受实验的动物中这些定性的发现得到图6E所示的β-半乳糖苷酶的定量测定的支持，其显示了在注射的肝叶中比在非注射肝叶中明显大的全面表达。如用量评价试验所示(图6)，所有的非注射肝叶都被转换到近似相同的程度。
图9A表明了在首次接受实验的的兔子中使用气囊导管经由肝静脉路线的局部的、导管介导的递送导致在注射的肝叶中比在非注射的肝叶中受感染细胞多2到3倍；在注射的肝叶和非注射的肝叶中被认为是肝细胞的表达细胞的比例实质上在注射的肝叶和非注射的肝叶中是相同的(～0.7)。
图9D表明了在首次接受实验的动物中的全身递送导致在全体表达细胞中与局部递送相比2到3倍的降低(图9A)。肝叶1和4的评价(注意没有用全身递送的“注射的”或“未注射的”肝叶)，产生了实质上相同数量的表达细胞。表达细胞的肝细胞分数的评价在注射的肝叶(0.63)和非注射的肝叶(0.69)中实质上是相同的，并且大致等于在局部递送之后所得到的分数(～0.71；图9A)。
综合起来，该数据表明腺病毒的局部、导管介导的递送相对于全身递送带来了优点。使用肝静脉途径的局部递送与使用全身途径递送(图7E和9D)相比，导致2-3倍更多的表达(图8E和9A)。
由通过局部(气囊导管)和全身途径递送的Ad2-βgal所产生的毒性较少。在外科手术(初始期间)之前，腺病毒注射或生理盐水假注射后一、两和三天，将采自兔子的血样进行血细胞计数和血清化学分析。
在用病毒处理的动物中24小时内出现轻的但统计上有显著意义的淋巴细胞减少(与初始期间相比减少50-60％)。在用病毒处理的动物中24小时内出现轻的但统计上有显著意义的血小板减少(与初始期间相比减少50％)。在用病毒处理或经受假的外科手术(用生理盐水局部注射)的动物中24小时内出现轻的但统计上有显著意义的嗜异染性(与初始期间相比增加100-200％)。
在用病毒处理或经受假的外科手术(用生理盐水局部注射)的动物中24小时内很明显有统计上有显著意义的血清肌酸激酶水平的升高(与初始期间相比增加100-1000％)。在病毒给药或假的外科手术后三天内所有的血细胞计数和血清化学分析都恢复正常。
对由病毒或未感染动物的局部或全身递送所感染的动物的肝脏部分进行苏木素伊红染色的组织病理学评价，显示没有一致的肝细胞的变化可与任何特异疗法有关。
实施例3在被动免疫的兔子中局部与全身给药的比较把腺病毒载体的局部、导管-介导的递送与具有抗病毒免疫性的动物的全身性注射相比较，来检验在该情况下局部注射是否与全身注射相比带来了优点。为达到这个目的，在被动免疫了存储的已知抗腺病毒型2滴度(抗Ad2)的人血清的兔子体内重复实施例2中的试验。
在病毒给药的前一天，使用对耳朵安全的20-号血管导管注射针进入服镇静剂的兔子的末端耳静脉，并缠上纱布和医用绷带。路厄锁定冲洗附于导管上，并静脉给药苯海拉明(1mg/kg)以控制可能的过敏反应。然后以0.1ml/秒的速度注射四十毫升的包含抗-Ad2抗体的存储人血清(Valley Biomedical，Winchester，VA)。该存储人血清具有抗-Ad2滴度(总滴度＝12,800，中和滴度＝3,200)是通常的人抗-Ad2滴度的近似十倍(未发表数据)。因此，将该递送药剂稀释到总体兔子循环(大约为350-400ml)中，预计会使其最后的抗-Ad2滴度接近通常的人类滴度。当Ad2βgal给药时，在所有动物中实际测定的抗-Ad2滴度为抗Ad21,600的总滴度和400的中和滴度。
通过ELISA来测定存储的人血清和兔子血清中的抗-Ad2抗体滴度。向包被有热失活腺病毒2型的96孔平板的孔中加入连续稀释的血清。用辣根过氧化酶-共轭羊抗兔子免疫球蛋白G，IgM和IgA来检测结合的病毒特异性抗体。然后通过与比色分析的底物30分钟培养来检测兔子抗Ad2抗体。抗病毒滴度定义为产生OD490≥0.1的最大血清稀释度的倒数。
根据抑制Ad2-βgal对易感染的细胞系的转导的能力来测定存储的人血清中的腺病毒中和抗体滴度。将HeLa细胞(ATTC)置于96孔组织培养平板的平底处，并在5％CO2大气中37℃下孵化过夜。将血清样品在DMEM中从1∶25连续烯释到1∶6400，将Ad2-βgal(50MOI)加入血清稀释物中，并在37℃中培养1小时，然后将其转入平板的细胞中，并继续培养3天。在第三天，采集并溶解细胞。用商业上可得到的AMPGD/β-半乳糖苷酶检验试剂盒测定溶解产物的底物转化。血清样品的中和抗体滴度定义为相对于负对照(人免疫球蛋白-衰竭的血清)测得的相对发光值减少≥50％的稀释度的倒数。所有兔子中在病毒给药时的抗-Ad2总滴度为1∶1600；中和滴度为1∶400。此滴度实质上与人类通常的抗-Ad2滴度相同。
在被动免疫后一天，通过以下方式来递送Ad2βgal病毒1)用静脉注射全身递送，或2)用例1和例2所述的气囊导管-介导的递送向肝脏局部递送。除非说明，所用材料与方法应与例1和例2中所用的相似。与递送途径无关，每只兔子都应注射1.5×1012病毒粒子/千克的ad2βgal病毒。
向被动免疫的兔子全身给药Ad2βgal导致一致的与肝脏结构有关的β-半乳糖苷酶的表达，与中央静脉或肝门三联征周围表达细胞的表现浓度无关(图7B和7D)。但是，与对首次接受实验的的动物全身给药相同剂量的病毒相比(图7A和7C)，向预先存在抗-Ad2抗体的兔子中全身给药导致减少的表达，即β-半乳糖苷酶总数减少～2倍(图7F)。
对于根据被动免疫转染的细胞种类(肝细胞与非肝细胞相比较)，图9E表明与向首次接受实验的的动物全身递送(253±166肝细胞/区域)(图9D)相比，向被动免疫的兔子进行全身递送导致被感染肝细胞的数目下降10倍(18.0±14肝细胞/区域)。但是，在抗-Ad2抗体存在的情况下(被动免疫)，与向首次接受实验的的动物全身递送(147±82非肝细胞/区域)(图9D)相比，全身递送导致被感染的非肝细胞的数目仅有极小的下降(124±47非肝细胞/区域)(图9E)。这些数据因而与得到的定性和定量表达的数据(图7)一致，其也显示了由于被动免疫的在表达上2-3倍的下降。因此，按照病毒全身给药，抗-Ad2抗体的最大的引人注目的效果是受感染肝细胞的比例从在首次接受实验的的动物中所有受感染细胞的66％下降到在被动免疫动物中所有受感染细胞的14％。因此，在抗载体抗体存在的情况下全身递送导致减少的表达，其中大部分表达细胞是非肝细胞，例如窦状上皮细胞、Kupffer细胞(图9E)。在被动免疫动物中仅有～15％的表达细胞确定为肝细胞。
被动免疫动物中Ad2βgal的局部递送导致β-半乳糖苷酶表达细胞在注射的肝叶中相似的分布(图8F)，如接受Ad2βgal的首次接受实验的的动物所表现的(图8A)。在首次接受实验的的兔子(图8E)和被动免疫的兔子(图8J)之间局部、导管声-介导的给药暗示抗Ad2抗体的存在导致肝脏β-半乳糖苷酶表现总量大约减少5-10倍。
除了在被动免疫动物中β半乳糖苷酶表现总量的下降之外，与在用局部、导管介导递送腺病毒载体的首次接受实验的的动物中的比例相比，其表达β-半乳糖苷酶的细胞类型的比例也有所改变。表达细胞的比例可确定为在注射的肝叶中的肝细胞从首次接受实验的的动物中的0.72下降到被动免疫动物中的0.45(图9A和9B)。更显著的是存在于未注射的肝叶中的差异，其中由于被动免疫，该比例由0.70减少到0.09(图9A和9B)。
总之，由ELISA(图7和图8)和Metamorph(图9)分析来测定的在局部和全身递送之后在被动免疫动物中的肝脏所有区域的所有β-半乳糖苷酶的表达总量实质上是相同的。但是，重要的是，按照局部递送，确定为肝细胞的β-半乳糖苷酶表达细胞的分数增加～7倍。这暗示在被动免疫动物中按照全身递送的所有β-半乳糖苷酶表达的主要部分起源于非肝细胞，并且该论点可由定性的免疫组织化学处理(图8G和8I)和定量的Metamorph数据(图9E)所支持。并且，尽管抗Ad2抗体在总的感染和表达上存在副作用，但局部递送可优先锁定肝细胞，即基因治疗所要求的靶细胞。因此，向免疫的兔子全身递送产生～14％确定为肝细胞的表示细胞，局部递送在注射的肝叶中产生～45％确定为肝细胞的表示细胞，在非注射的肝叶中产生～10％。在非注射的肝叶中表达肝细胞的低百分数是与病毒和分布在未注射的肝叶中的抗病毒抗体的较大程度的相互作用相一致的。
对于被动免疫动物来说，这些结果显然表明局部递送提供了与全身递送相比明显的优点。在对被动免疫动物进行局部递送之后，转基因在肝细胞中的表达与在非肝细胞中的比例明显高于在对被动免疫动物进行全身递送之后的比例。因此，很明显在向预先存在免疫性的动物给药病毒基因治疗剂时，该方法提供了优点。
实施例4向被动免疫的用生理盐水预先冲洗的兔子肝脏中导管介导的腺病毒基因治疗载体的递送增加“冲洗”步骤来评阶腺病毒载体的局部、导管介导的递送，其中仅仅在病毒给药之前经由导管注入20ml的生理盐水。这是在具有抗Ad2病毒免疫性的动物中实施的，用来检验用生理盐水预先冲洗肝脏与没有预先冲洗步骤的递送相比是否会带来优点。
为了完成此操作，用已知抗-腺病毒型2滴度的储存人血清(抗-Ad2)对兔子进行被动免疫，如例3所述。被动免疫一天后，在下列步骤的附加步骤之前如例1和2所述进行气囊导管联-介导的递送方法。在输送Ad2βgal之前，立即将20ml生理盐水经由导管递送。
与接受局部导管-介导递送处理而未用盐水冲洗的被动免疫接种的动物相比，将生理盐水冲洗加入到在被动免疫的动物中Ad2βgal的局部、导管介导递送中增加了表达转基因的数目和表达β-半乳糖苷酶的肝细胞的比例。在被动免疫并用生理盐水预先冲洗的动物中，与未用生理盐水预先冲洗的动物相比，表达的肝细胞的数目增加大约5倍(图9B和9C)。可确定为肝细胞的表达细胞的比例也增加，并为0.68(图9C)，相比之下，被动免疫并未用生理盐水预先冲洗的动物中为0.45(图9B)，而在非免疫动物中为0.71(图9A)。更明显的是在非注射的肝叶中的差别，其中由于在被动免疫的动物中，生理盐水预先冲洗可确定为肝细胞的表达细胞的比例从0.09增加到0.40(图9B和9C)。对于被动免疫的动物来说，很明显除了局部导管-间接递送病毒载体，生理盐水预先冲洗在对病毒载体预先存在免疫性的动物提供了重要的优势。在被动免疫的动物中，通过生理盐水预先冲洗，表达细胞的总数和表达转基因的肝细胞的分数都明显高于没有用生理盐水冲洗的动物。因此，很明显当将病毒基因治疗剂给予预先存在免疫性的动物时，本方法的这一实施方案提供了优势。
实施例5给兔子肝脏导管介导递送腺相关病毒基因治疗载体在每个实验中，使用每只大约在4公斤重量的新西兰白兔(MillbrookFarms，Amherst，MA)。使用腺相关病毒，AAV2/8DC 190HAGAL(AAV2/8)，包括AAV8血清型的壳体区和AAV2血清型的颠倒末端重复。表达盒包括两个α-1微球蛋白增强子，一个α-1-抗胰蛋白酶启动子和人α-半乳糖苷酶A转基因。如实施例1-3所述用气囊导管-介导的递送法将AAV2/8病毒的1.25×1011或1.25×1012DNA酶抵抗粒子(drp)/kg(总量8ml)局部递送至肝脏。除非说明，使用的材料与方法与实施例1-3中所使用的相似。
用如前所述的专为测定人α-半乳糖苷酶A使用的酶联免疫吸附测定法来测定动物血清中的人α-半乳糖苷酶A(AGAL)的表达[Ziegler等人，(1999)。Hum Gene Ther.Jul1；10(10)1667-82]。
在用1.25×1011drp/千克的AAV2/8病毒处理的兔子中，其血清中的AGAL表达从3-31ng AGAL/ml血清变动。在用1.25×1012DNA酶抵抗粒子(drp)/千克的AAV2/8处理的兔子中，其血清中的AGAL表达从15-132ng AGAL/ml血清变动。
实施例6在向兔子肝脏的导管介导的递送腺病毒相关病毒基因治疗载体之后AGAL表达的时间过程使用大约每只4千克重量的新西兰白兔(Millbrook Farms，Amherst，MA)。使用腺相关病毒，AAV2DC190HAGAL(AAV2/2)，包括壳体区和AAV2血清型的颠倒末端重复。表达盒包括两个α-1微球蛋白增强子，一个α-1-抗胰蛋白酶启动子，和人α-半乳糖苷酶A转基因。如实施例1-3所述用气囊导管-介导的递送将总量为8毫升的AAV病毒的5×1012DNA酶抵抗粒子(drp)局部递送到肝脏。除非说明，使用的材料与方法与实施例1-3中所使用的相似。
用如前所述的专为测定人α-半乳糖苷酶A使用的酶联免疫吸附测定法来测定动物血清中的人α-半乳糖苷酶A(AGAL)的表达[Ziegler等人，(1999)。Hum Gene Ther.Jul 1；10(10)1667-82]。在84天之内测定AGAL的表达。
同时随着时间用ELISA测定处理的兔子的血清中的抗-AGAL抗体滴度。将连续稀释的血清加到包被纯化的重组人α-半乳糖苷酶A的96孔平板的孔中。用辣根过氧化酶-共轭羊抗兔子免疫球蛋白G、IgM和IgA检测到结合人α-半乳糖苷酶A的特有抗体。然后使用比色分析的底物30分钟培养来检测兔子抗Ad2抗体。抗病毒滴度定义为产生OD490≥0.1的最大血清稀释度的倒数。
如图10所示，在整个84天时间过程中，兔子血清中都存在着AGAL的表达。在整个84天时间里在兔子血清中均检测不到抗AGAL抗体。递送AAV2引起的毒性不强，与Ad2-βgal递送引起的毒性实际上大体相似。
实施例7导管介导的腺病毒基因治疗载体向兔子肝脏中的递送并延长其停留时间使用每只体重大约4公斤的新西兰白兔(Millbrook Farms，Amherst，MA)。使用实施例1所述的腺病毒载体Ad2βgal。给每只白兔按每千克1.5×1012病毒颗粒的剂量注射Ad2βgal病毒。
除了病毒在组织中的停留时间大约为四分钟而非一分钟，使用实施例1-3中所述的方法将腺病毒基因治疗载体递送到兔子肝脏中其总注射量为8毫升。
注射三天后，对接受处理的兔子的肝脏进行β-半乳糖苷酶表达的分析。用市场上可买到的ELISA试剂盒(Roche)按厂家的说明书定量测定在兔子肝脏匀浆物中细菌β-半乳糖苷酶的表达，如实施例1所述对组织样品进行免疫组织化学处理。如实施例1所述进行形态学分析来确定肝脏的表达模式和肝脏的肝细胞与肝脏的非肝细胞的转染比例。对于每只兔子，取注射的肝叶的三个部分和未注射的肝叶的三个部分进行分析，得出肝细胞分数[感染的肝细胞/(感染的肝细胞+感染的非肝细胞)]。
如图11A所示，与上述应用一分钟停留时间的研究相比，延长的停留时间明显提高了在注射的和未注射的肝叶中确定为肝细胞的感染的细胞的比例。以4分钟停留时间用腺病毒载体处理的兔子在注射的肝叶中具有肝细胞分数大约0.75-0.90，在未注射的肝叶中具有肝细胞分数大约0.70-0.90(参见图11A所示8-20与8-22的条带)。相比之下，使用相同递送方法以1分钟停留时间用腺病毒载体处理的兔子在注射的肝叶中具有肝细胞分数大约0.6-0.75，在未注射的肝叶中具有肝细胞分数大约0.30-0.70(参见图11A所示4，5和1的条带)。有趣的是，如图11B所示，增加的停留时间看起来并未提高β-半乳糖苷酶的整体表达水平。
实施例8用流出物阻断的肝叶的递送如实施例1所述，肝叶的递送方法只限递送到封闭气囊远侧的储存器官的一部分。为了更好地将储存器官从体循环中隔离出来，所有肝静脉的流出物阻断可由在肝脏的腔静脉中植入的气囊导管(6)覆盖肝脏静脉口的方法来实现。
为了实行该方法，将股静脉从股内前廉进入经由纵向的皮肤切口从大腿沟向下延伸。直接解剖肌肉筋膜来暴露神经血管束。将股静脉从缔合的动脉和神经中小心地分解出来。分离并结扎出一端1-2cm长的股静脉。在接近结扎的位置，将一个7French插管器套插入股静脉。利用荧光检查的引导，将导线放入下腔静脉。将5Fench 14毫米乘4厘米的气囊导管由导线上穿过套植入腔静脉的肝脏部分。套的外径比兔子的股静脉大，因此该方法很难在不产生脉管伤害的情况下在兔子模型中重复。在以人类为受试者中不期望出现这种并发症。
对导管内腔进行肝素化处理。在经由植入肝静脉的气囊封闭的气囊导管注射转染试剂前膨胀气囊。伴随气囊的膨胀，将少量射线照相造影剂从导引器套注入以确保受阻隔的气囊流入下腔静脉。然后将8ml的转染试剂从血管内的导管注入一个单独隔离出来的肝叶。然后立即将导管和套撤除并进行止血处理。如图3所示，浓的射线照相造影剂在隔离出来的肝叶上着色，而更稀的造影剂经由门静脉在肝脏的剩余部分进行逆向的再循环。
实施例9靶整体-器官的递送为了将基因治疗剂通过一次注射递送到整个肝脏上，通过使用肝脏静脉流的上端或下端的下腔静脉中的气囊膨胀将肝脏隔离出来。然后在气囊之间注入转染试剂溶液，溶液经由肝静脉逆向流至整个肝脏实质。此方法的一种方案见于图4。在这个方案中，气囊封闭的气囊(7、8)自上通过颈静脉(5)到右心房和最大肝静脉(most superior hepatic vein)(11)之间的下腔静脉(16)位置，自下由股静脉最大肾静脉(most superior renal vein)(19)和最小肝静脉(3)之间的下腔静脉(16)位置。将一根在靠近顶端有多个边孔的4French辫形导管由相对的股静脉前进放入两个闭塞气囊之间的下腔静脉。在通过辫形导线导管注射基因治疗溶液前将气囊膨胀以迅速隔离肝脏。
在此方法的另一实施方案中，气囊封闭的气囊可经由两个分离双内腔气囊导管(12、13)递送，如图5所示。
实施例10使用局部、导管介导向对AAV8改变天然免疫力的恒河猴递送AAV8.DC19OhAGA的预测研究使用局部、导管介导经由肝静脉的基于腺相关病毒(AAV)血清型8的包含凝血酶原增强子/人白蛋白启动子(DC190)驱动的人α半乳糖苷酶(hAGA)基因的载体，对人α-半乳糖苷酶基因进行转移和表达的效果是通过对AAV8具有大范围天然免疫力的恒河猴而测定的。
将由于局部递送的hAGA的表达与经由周边静脉的全身递送所获得的表达相比较。将测定循环α-半乳糖苷酶的水平和持续时间、细胞因子的产生和抗AAV8和抗α半乳糖苷酶抗体的存在。也将确定该转基因的组织分布。
很可能在AAV8.DC190hAGA给药之前和随着AAV8.DC190hAGA给药来对动物给予免疫抑制剂，以便减少或消除细胞毒性淋巴细胞识别病毒壳体蛋白而除去转化细胞的可能性。在器官移植领域常用的免疫抑制试剂可单独使用或与其它试剂结合使用。这样的免疫抑制试剂可包括被用来诱导和/或被用来维持的试剂。这些试剂可包括环孢霉素(Neoral，Sandimmune)，强的松(Novo Prednisone，Apo Prednisone)，硫唑嘌呤(Imuran)，他克莫司或FK506(Prograf)，麦考酚酸吗乙酯，mycophenolate mofetil(CellCept)，西罗莫司sirolimus(Rapamune)，OKT3(Muromorab CO3，Orthoclone)，ATGAM & Thymoglobulin。免疫抑制剂体系可能至少包含CELLCEPT口服悬浮液和Rapamune口服液。CELLCEPT口服悬浮液(MMF)将通过鼻管灌食法以大约12.5mg/kg的剂量每天两次来给药。Rapamune口服溶液将通过鼻管灌食法以大约2mg/kg的剂量来给药。这些被认为是适合于恒河猴的最大的合理估计量。
使用由局部、导管介导的途径和全身途径来单一静脉注入AAV8.DC190hAGA。预测大约2×1013病毒颗粒/kg的AAV8.DC 19OhAGA的剂量水平足以评价AAV8.DC190hAGA的药物动力学和药效学性颐。剂量水平的选择是根据来源于上述在兔子中进行的研究和由其他的研究者用相关材料在恒河猴中进行的研究的信息。
用抗AAV8抗体筛选猴子来确定对AAV8载体的天然免疫力的存在或缺失。AAV8最初分离自猴子，这就是为什么选择该血清型用于研究的原因。分离自想要处理的哺乳动物的血清型的应用可以在提高靶气管的转导上提供优势。这样的提高理论上是由这样的血清型引起的，因为根据病毒分离自哺乳动物的事实，该血清型对于哺乳动物的靶器官可能具有提高的向性。具有大范围的天然免疫力的猴子的应用也将考虑到评价在用对于选择的病毒载体具有预先存在的免疫性的哺乳动物中的本方法。
使用在实施例1和4中所描述的本发明的方法来处理经由局部、导管介导递送而接受病毒的猴子。总之，猴子通过如实施例4所述的具有附加的冲洗步骤的导管介导的方法来接受病毒。该冲洗步骤在理论上稀释了存在于靶肝叶中的任何抗病毒抗体，其在理论上提高了病毒基因转染，特别是肝细胞转导的效率。另外，该病毒的停留时间从如实施例1和4所述的1分钟增加到停留时间不超过4分钟。停留时间的增加在理论上提高了病毒基因转染，特别是肝细胞转导的效率。
研究持续时间估计是365天。在贯穿研究过程的各个预定时间点从全部动物处收集评价转基因表达、抗体水平、血清化学和血液学参数的血样。
上述研究评价了经由最初从猴子分离的血清型递送的治疗性转基因的基因转移和表达的效果。其将评价哺乳动物中对于血清型预先存在的免疫性的自然分布范围的的效果和表达。该研究的递送方法利用在病毒给药之前的器官的冲洗步骤和病毒的延长的停留时间。抑制免抑反应也属于本研究方案的一部分。在理论上使用本方法的转基因的效果和表达将产生等于甚至大于在基于兔子的模型中已经观察到的靶器官转导。在理论上使用本方法的转基因的效果和表达也将产生等于甚至大于在利用病毒载体顺行递送的哺乳动物中基于其它导管的系统中已经观察到的靶器官转导。
因为疾病可感染各种器官或组织，显而易见地是希望在身体的各种部位应用本发明的方法。本发明可用来处理各种器官或组织，包括肝脏、肾、心脏、肺、骨骼肌、胃或肠。
根据说明书中引用的教导和参考，可更充分地理解本说明书，在本文中将其全部引入作为参考。在说明书中的实施方案提供了对本发明实施方案的阐述，并不应当理解为限制本发明的范围。本领域技术人员认识到许多其它的实施方案也包括在要求的发明中，其意味着说明书和实施例认为仅是示范性的，本发明的真实范围和精神由下述权利要求来表述。
通过考虑对本文中公开的本发明的说明和实施，本发明的其它实施方案对本领域技术人员来说是显而易见的。其意味着说明书和实施例被认为仅仅是示范性的，本发明的真实范围和精神由下述权利要求来表述。
权利要求
1.一种用于向哺乳动物受试者的选定器官递送病毒基因治疗剂以便表达由该病毒基因治疗剂编码的蛋白的方法，包括a.在引流器官的静脉脉管系统中植入一个或多个导管；至少一个导管具有一个或多个膨胀可扩大的构件；b.通过使一个或多个该膨胀可扩大的构件膨胀，来封闭引流该器官或该器官的部分的静脉脉管系统内的液体流动以分离器官或器官的部分；c.以一定体积递送病毒基因治疗剂，该体积导致在分离的器官或器官的分离体的部分中，脉管压力与正常静脉压相比升高不超过40％；d.允许基因治疗剂在分离的器官或器官的分离的部分保持一段时间，该时间足够使治疗有效量的该试剂转导。
2.权利要求1的方法，其中的哺乳动物受试者为人类。
3.权利要求1的方法，其中所述的静脉脉管系统为肝静脉、分支肝静脉或下腔静脉。
4.权利要求1的方法，其中肝细胞在肝细胞加上非肝细胞之中的分数是至少0.2，其中所述的肝细胞和非肝细胞位于分离的器官或器官的分离的部分，并表达由病毒基因治疗剂编码的蛋白。
5.权利要求1的方法，其中肝细胞在肝细胞加上非肝细胞之中的分数是至少0.3，其中所述的肝细胞和非肝细胞位于分离的器官或器官的分离的部分，并表达由病毒基因治疗剂编码的蛋白。
6.权利要求1的方法，其中肝细胞在肝细胞加上非肝细胞之中的分数是至少0.4，其中所述的肝细胞和非肝细胞位于分离的器官或器官的分离的部分，并表达由病毒基因治疗剂编码的蛋白。
7.权利要求1的方法，其中肝细胞在肝细胞加上非肝细胞之中的分数是至少0.5，其中所述的肝细胞和非肝细胞位于分离的器官或器官的分离的部分，并表达由病毒基因治疗剂编码的蛋白。
8.权利要求1的方法，其中肝细胞在肝细胞加上非肝细胞之中的分数是至少0.6，其中所述的肝细胞和非肝细胞位于分离的器官或器官的分离的部分，并表达由病毒基因治疗剂编码的蛋白。
9.权利要求1的方法，其中在病毒给药之前用溶液冲洗该器官。
10.权利要求1的方法，其中脉管压力与分离的器官或器官的分离的部分的正常静脉压相比升高不超过30％。
11.权利要求1的方法，其中脉管压力与分离的器官或器官的分离的部分的正常静脉压相比升高不超过20％。
12.权利要求1的方法，其中脉管压力与分离的器官或器官的分离的部分的正常静脉压相比升高不超过10％。
13.权利要求1的方法，其中导管是气囊封闭导管。
14.权利要求1的方法，其中基因治疗剂通过血管内的导管来递送。
15.权利要求1的方法，其中基因治疗剂通过经皮的注射针来递送。
16.权利要求1的方法，其中基因治疗剂包括腺病毒载体。
17.权利要求1的方法，其中基因治疗剂包括腺相关病毒载体。
18.权利要求1的方法，其中基因治疗剂包括慢病毒载体。
19.权利要求1的方法，其中基因治疗剂包括逆转录病毒载体。
20.权利要求1的方法，其中基因治疗剂包括疱疹病毒载体。
21.权利要求1的方法，其中基因治疗剂包括α病毒载体。
22.权利要求1的方法，其中基因治疗剂包括杆状病毒载体。
23.权利要求1的方法，其中基因治疗剂包括杂合病毒载体。
24.权利要求1的方法，其中器官是肝脏。
25.权利要求1的方法，其中器官是肾脏。
26.权利要求24的方法，其中在病毒给药之前用溶液冲洗肝脏。
27.权利要求26的方法，其中该溶液是生理盐水。
28.权利要求7的方法，其中在病毒给药之前用溶液冲洗该器官。
29.权利要求28的方法，其中该器官是肝脏，该溶液是生理盐水。
30.权利要求1的方法，其中延长了停留时间，并将肝细胞在肝细胞加上非肝细胞之中的分数增加到至少0.8，其中所述的肝细胞和非肝细胞位于分离的器官或器官的分离的部分，并表达由病毒基因治疗剂编码的蛋白。
31.权利要求1的方法，其中在病毒给药之前用溶液冲洗该器官，其中延长了步骤d)，并且这样的延长将肝细胞在肝细胞加上非肝细胞之中的分数增加到至少0.8，其中所述的肝细胞和非肝细胞位于分离的器官或器官的分离的部分，并表达由病毒基因治疗剂编码的蛋白。
32.权利要求1的方法，其中步骤d)从大约1分钟到大约4分钟长。
全文摘要
本发明提供了用于增强向哺乳动物受试者靶器官的脉管系统中递送各种药物，例如基因治疗剂的方法。公开了在肝脏整体或单个肝叶中定向基因治疗的方法。公开的方法依靠以最低限度侵入的导管为基础的步骤，其中分离出靶器官，并用基因治疗剂局部治疗。本方法提供了更有效的、组织的局部转染，并非常适合于受试者中的基因治疗。
文档编号A61F2/958GK101068575SQ200580041379
公开日2007年11月7日 申请日期2005年12月1日 优先权日2004年12月1日
发明者R·K·朔伊伦, B·L·霍奇斯 申请人:建新公司