专利名称：递送遗传物质的组合物的制作方法
递送遗传物质的组合物发明领域
本发明涉及递送核酸或遗传物质的组合物。具体地，本发明涉及装载有遗传物质的外来体及其生产方法。
发明背景
核酸在基因治疗中常规地用于替换非功能基因[1]以及经由RNA干扰(RNAi)效应分子诸如miRNAs[2]、shRNAs[3]和siRNAs[4]中和致病突变。因为裸DNA和RNA由于迅速的清除[5]，核酸酶W]，缺乏器官特异性分布以及低效率的细胞摄取而难以在体内递送，专门的基因递送运载体通常被用于递送。
病毒载体和阳离子脂质体处于递送运载体技术的最前沿，并且已经相对成功，其中这些递送运载体中的许多已经处于临床试验[7]。尽管有这些成功，但是仍然存在限制许多应用的重大局限，其中最重要的是对大部分病毒载体的免疫识别[8，9，10]和对病毒诸如慢病毒(Ientiviruses)的诱变整合[11]；以及对脂质体的炎症毒性和迅速清除[12，13， 14，15]。通过先天免疫系统的识别导致急性炎症应答，其可能需要使用免疫抑制策略以克服潜在地将患者暴露于不需要的(unwarranted)机会感染风险的现有策略[16，17，18]的摄取和再给药问题。针对递送运载体产生的抗体也显著地降低了随后给药时的转基因表达 [19]。
现有策略的固有风险和局限性一般将它们限定于危及生命的疾病，其治疗益处明显重于风险，诸如重度联合免疫缺陷症[20]；限定于特殊环境中的疾病，诸如免疫豁免部位如眼睛[1]；或基因疫苗[21]。然而，对于慢性且使人虚弱但不危及生命的遗传性疾病， 诸如肌强直性营养不良，更低风险概况和维持矫正基因治疗数十年而不是几年的能力对于治疗干预是必需的。这类疾病潜在地不能接受的风险的实例是上面所讨论的免疫抑制策略，该免疫抑制策略中突出的是健康患者在最近的类风湿性关节炎的AAV基因治疗试验中的死亡，这是由于对象摄取了试验管理者未知的免疫抑制剂[22]所引起的机会感染。随着显示具有遗传成分的疾病——包括肥胖、心脏病和精神病——数目的增加，非常有可能改变易感性基因用于优先遗传解决办法(preemptive genetic solution)，但仅在风险被进一步降低并且获得长期可持续性的情况下。因此，为了将基因治疗的应用扩大到致命疾病之外，有必要开发能够避免免疫识别和炎症同时保留良好递送功效的技术。
一种解决办法在于使用基因递送的外来体。外来体是内吞(胞吞)起源的小的膜结合小泡(30-100nm)，其在多泡体与质膜融合后被释放到胞外环境中。已经描述了许多免疫细胞，包括B细胞、T细胞和树突细胞(DCs)的外来体生产。源自B淋巴细胞和成熟DCs 的外来体表达MHC-II、MHC-I、⑶86和ICAM-I [23，24]，并且已经被用于在实验模型和临床试验中诱导特异性抗肿瘤T细胞毒反应和抗肿瘤免疫性[24，25]。外来体介导的基因递送的潜能已经显示有将鼠mRNAs和miRNAs递送至人肥大细胞[26]，并且已经证实神经胶质瘤衍生的外来体[27]将外源DNA质粒产生的mRNAs转移至异种细胞，但是外源DNA、siRNAs 和其它修饰寡核苷酸的装载和递送至今还没有证实。
发明概述
本发明人已经成功地将外来体装载有外源遗传物质，尤其是外源质粒DNA、SiRNA 和修饰寡核苷酸。因此，本发明涉及将外来体装载有外源遗传物质的方法，装载有这样的外源遗传物质的外来体，以及其在基因治疗和基因沉默的核酸递送中的应用。
本发明人还已经成功地将靶向部分引入外来体，以使外来体可靶向所选组织。因此本发明涉及在其表面表达有靶向部分的外来体，和包含外来体跨膜蛋白质和靶向部分的融合蛋白，以及编码这种融合蛋白的核酸构建物。外来体可被装载有外源遗传物质，并且被用于递送基因治疗和基因沉默的核酸。
根据本发明的一方面，提供包含外来体的组合物，其中外来体被装载有外源遗传物质。
在另一方面，本发明提供包括含有遗传物质的外来体的组合物，其中外来体源自未成熟的树突细胞，其用于体内递送遗传物质的方法。
在另一实施方式中，本发明提供将外来体装载上遗传物质的方法，其包括提供外来体的组合物，以及通过电穿孔将外来体装载有遗传物质。
在另一实施方式中，本发明提供将外来体装载上遗传物质的方法，其包括提供外来体的组合物；以及利用阳离子脂质体转染剂，通过转染将外来体装载上核酸。
根据本发明的另一方面，提供了包含外来体的组合物，其中所述外来体包括在所述外来体表面上表达的靶向部分。
在另一方面，本发明提供包括外来体跨膜蛋白质和异种靶向肽的多肽，其中所述靶向肽结合到待靶向细胞表面上存在的部分，并且其中当所述多肽存在于外来体中时，所述靶向肽存在于外来体的表面上。
在另一实施方式中，本发明提供编码多肽的多核苷酸，其中所述构建物包括编码 5’外来体跨膜信号序列——例如与编码本发明多肽的多核苷酸可操作地连接的内质网靶向信号肽——的多核苷酸。
在另一实施方式中，本发明提供将外来体靶向所选组织或细胞类型的方法，其包括用根据本发明的多核苷酸构建物转染宿主细胞，在所述宿主细胞中表达构建物，以及从构建物已经在其中表达的宿主细胞中获得外来体。
图1.来自未成熟树突细胞的外来体的表征(a)用2%醋酸双氧铀染色的外来体 (负染色的外来体)的电子显微图；(b)用抗-Lamp2——外来体中存在的膜蛋白——探测的外来体的蛋白质印迹；(c)从5种不同的纯化中纯化的树突细胞外来体在PBS中的动态光散射大小测量
图2.树突细胞的转染(a)修饰Lamp-2b用以转染到树突细胞中。(SP =信号肽； TP =靶向肽；TM =跨膜；CT =胞质尾区)；(b)使用抗-FLAG或抗-Lamp2在未转染的树突细胞(CTRL)或转染有pLamp2b-FLAG(FLAG-Lamp2b)的细胞以及从这些细胞中收获的外来体中的蛋白质印迹；(c)利用对MSP和RVG序列特异的引物，用pLamp2b-MSP、-RVG或没有东西转染的树突细胞的qRT_PCR;(d)在外来体拉下试验(pull down assay)中，在正常外来体和FLAG外来体与抗-FLAG珠或抗-AGOl珠(非结合对照)温育后使用抗-Lampl的蛋白质印迹；(e)纯化的MSP-外来体的动态光散射尺寸测量。
图3.质粒和外来体的电穿孔，随后进行DNase保护试验(a)在外来体和 pEGFP-NAD质粒的不同处理后DNase保护试验。线性DNA通过用EcoRI切割pEGFP-NAD制备。 (Pre =在加入质粒前预电穿孔的外来体)(b)通过DNase对在不同电穿孔设定(setting) 下的环状质粒的DNase降解进行比较(c)pEGFP-NAD用不同转染试剂转染后的DNase保护试验(d)外来体用转染试剂1-3和pEGFP-NAD转染后的DNase保护试验(参见材料和方法)。
图4.外来体介导的pEGFP-NAD向细胞的递送(a) DNase处理后，相比单独的质粒，Neuro2A细胞用野生型外来体和用pEGFP-NAD转染的表达RVG_Lamp2b的外来体 (RVG-外来体)的转染。(b和c)相比单独的转染试剂，eGFP在用正常外来体、RVG-外来体或MSP-外来体转染后折叠变化的qRT-PCR定量。
图5.借助外来体介导的siRNA递送，GAPDH的击倒(knowdown) (a, b)施加到具有正常或修饰的外来体的Neuro2A(a)和C2C12(b)细胞上的Cy5_标记的GAPDH siRNA的代表性图像。未电穿孔的外来体和siRNA作为对照加入。(c，d)在用单独的SiRNA(SiRNA)， siRNA 与 Iipofectamine 2000 (Invitrogen) (siRNA+LP)，正常外来体(Exosomes)，MSP 夕卜来体(MSP exos)和RVG外来体(RVG exos)转染后2天收获的Neuro2A细胞和C2C12细胞中 GAPDH水平的qPCR。Γρ < 0. 05) (e, f)类似转染后GAPDH水平的代表性蛋白质印迹。
图6.借助外来体介导的siRNA递送，亲环蛋白B的击倒(a，b)在用单独的 siRNA(siRNA)， siRNA 与 Iipofectamine 2000(Invitrogen)(siRNA+LP),正常外来体 (Exosomes)，MSP 外来体(MSP exos)和 RVG 外来体(RVG exos)转染后 2 天收获的 Neuro2A 细胞和C2C12细胞中亲环蛋白B水平的qPCR。Γρ < 0. 05) (c,d)类似转染后亲环蛋白B水平的代表性蛋白质印迹。
图7.用外来体电穿孔后Cy3和Cy5标记的siRNA的保留a，荧光与siRNA质量线性相关。b和c，在b，3yg siRNA与例如3 μ g的RVG-外来体在χ轴所示设定下在200 μ 1 缓冲液中电穿孔；c，3 μ gsiRNA与例如3 μ g的RVG-外来体在400V 125 μ F下在χ轴所示体积的缓冲液中电穿孔之后保留的标记siRNA的绝对质量。所有试验都进行两次。
图8.用正常外来体的2’ -OMe寡核苷酸和吗啉代核苷酸(morpholinos)的递送 在Cy3-标记的(a) 2’-0Me寡核苷酸或(b)用或没用外来体的PMO转染后M小时C2C12细胞的荧光成像。
图9.用靶向外来体的siRNA体内递送导致CNS-特异的基因击倒a，b，c, d，在静脉注射150 μ g裸GAPDH siRNA或包封在未修饰的外来体、MSP-外来体或RVG-外来体中的siRNA之后3天小鼠的纹状体、中脑、皮层、四头肌、脾、肝、肾和心中的GAPDH qPCR，其相对于未处理的对照标准化(100% )。e，从未处理小鼠或者在第1天和第8天静脉注射空RVG-外来体两次然后在第25天将该小鼠处死(3次注射)之前的在第22天静脉注射 RVG-外来体包囊的GAPDH siRNA(150 μ g)小鼠的纹状体、皮层和中脑中提取的RNA的GAPDH qPCR。f,g,在处死前第6天和第3天在2个单独的时机用RVG-外来体包囊的siRNA (150 μ g) 注射的小鼠的GAPDH qPCR和代表性蛋白质印迹。小鼠在处死前3天静脉注射150 μ g包囊在150 μ g RVG-外来体中两种BACE-IsiRNAs的每一种，并且皮层部分用i，BACE-lqPCR，h， BACE-I蛋白质印迹和j，β -淀粉样蛋白1-42ELISA进行分析。所有qPCR被标准化成18S RNA水平。*表示相对于未处理的对照ρ <0.05。3只小鼠在各样品组中都被注射并且所有的误差条反映了标准偏差(n = 3)。
发明详述
本发明涉及外来体，及它们作为基因递送载体的应用。外来体是内吞起源的小的膜结合小泡，其在多泡体与质膜融合后被释放到胞外环境中。因此，本申请涉及包括这样的外来体的组合物。一般地，外来体直径在30和IOOnm之间并且可包括高达200nm类似起源的膜颗粒。如本文所用，外来体指从多泡体中分泌的内体起源的纳米颗粒。
外来体由许多不同种类的细胞——包括免疫细胞诸如B淋巴细胞、T淋巴细胞、树突细胞(DCs)和大部分细胞产生。外来体也由例如神经胶质瘤细胞、血小板、网状细胞、神经元、肠上皮细胞和肿瘤细胞产生。根据本发明使用的外来体可衍生自任何合适的细胞，包括上面所确定的细胞。也已经从生理流体诸如血浆、尿、羊膜液和恶性渗出液分离出外来体。
在本发明优选的方面，外来体衍生自DCs，优选地未成熟DCs。产生自未成熟DCs 的外来体不表达MHC-II、MHC-I或⑶86。由此，这样的外来体不刺激幼稚T细胞至有效程度，并且不能在混合淋巴细胞反应中诱导应答。因此，产生自未成熟树突细胞的外来体对于在遗传物质递送中应用——尤其体内应用，例如基因治疗来说是理想的候选者。
因此，根据本发明的第一方面，提供衍生自树突细胞的外来体以用于遗传物质的体内递送。
在本发明的可选方面，外来体可获自任何自体患者衍生的干细胞、异种单元型匹配的干细胞或异种干细胞，从而减少或避免外来体被递送到其中的患者中的免疫应答的产生。任何产生外来体的细胞可用于该特定目的。
如上所概述，外来体由许多不同种类的细胞产生并且也已经从生理流体分离。因此，根据本发明，外来体可获自如上讨论的任何合适的细胞类型，或者通过从生理流体分离获得。一般地，本发明的方法包括从细胞培养基或组织上清液分离外来体。
产生自细胞的外来体可通过任何合适的方法从培养基中收集。一般地，外来体可通过离心、过滤或这些方法的组合从细胞培养物或组织中制备。例如，外来体可通过差速离心制备其是低速(< 20000g)离心以沉淀(pellet)较大颗粒，接着高速(> IOOOOOg)离心以沉淀(pellet)外来体，用适当的滤器(例如，0. 22μπι过滤器)大小过滤(粒度过滤， size filtration)；梯度超速离心(例如，使用蔗糖梯度)或这些方法的组合。
根据本发明，外来体被装载有外源遗传物质。具体地，根据本发明，外来体被制备， 然后装载有要递送的期望遗传物质。
要递送的合适遗传物质包括外源DNA质粒和siRNA。合适的遗传物质也包括修饰的寡核苷酸和其他RNA干扰效应部分诸如miRNA和shRNA。根据本发明的一方面，装载到外来体中的遗传物质不是与外来体典型相关的遗传物质，例如，核酸优选地不是在其从细胞中产生后并入外来体的mRNA或miRNA。具体地，本发明涉及将遗传物质装载到已经与细胞分离的外来体制备物中的能力。因此，外源遗传物质指包括与不与外来体常规相连的核酸在内的遗传物质。在特别优选的实施方式中，核酸物质是质粒DNA或其它核酸，诸如siRNA 和修饰的寡核苷酸，其在外来体中一般找不到。
掺入外来体中的核酸可以是单链的或双链的。单链核酸包括具有磷酸二酯、 2’ 0-甲基、2’甲氧基-乙基、氨基磷酸酯、甲基膦酸酯和/或硫代磷酸酯主链化学的那些。一般地，双链核酸——包括例如质粒DNA和小的干涉RNAs (siRNAs)被引入。
要被装载到外来体中的遗传物质根据意图要递送到其中的细胞上的遗传物质的期望效果以及要实现该效果的机理进行选择。例如，核酸在基因治疗中可能是有用的，例如为了在细胞或细胞组中表达期望基因。这样的核酸一般为质粒DNA或病毒载体的形式， 其编码期望的基因并且可操作地连接到合适的调节序列诸如启动子、增强子等，从而一旦其被递送至待处理细胞，质粒DNA就被表达。容许基因治疗的疾病的实例包括血友病 B (Factor IX)、囊性纤维化(CTFR)和脊髓性肌萎缩(SMN-1)。
核酸也可被用于例如赋予免疫性(immunisation)以表达一种或多种针对其期望产生免疫应答的抗原。因此，要装载到外来体中的核酸可编码一种或多种针对其期望产生免疫应答的抗原，包括但不限于肿瘤抗原、来自病原体诸如病毒、细菌或真菌病原体的抗原。
核酸也可用于基因沉默。这种基因沉默可用于治疗以阻断异常基因表达，或者用于动物模型研究以产生单个或更多个基因敲除。一般地，这样的核酸以siRNAs形式提供。 例如，包括siRNAs的RNAi分子可用于在肌肉细胞中击倒具有多个CUG重复的DMPK，用于治疗肌强直性营养不良。在其他实例中，表达减少引起亨廷顿病(Huntington's disease) 的突变体亨廷顿基因(htt)的shRNA质粒可用神经元特异性外来体进行递送。其它靶基因包括用于治疗阿尔茨海默病(Alzheimer's disease)的BACE-1。一些癌基因也可用siRNA 或shRNAs靶向，诸如ras、c-myc和VEGFR-2。脑靶向siRNA装载的外来体可能在阿尔茨海默病的BACE-I沉默中，在帕金森病(Parkinson’ s disease)的α-突触核蛋白沉默中，在亨廷顿病的htt沉默中，以及在用于治疗中风以减少缺血性损伤的神经元胱天蛋白酶-3沉默中特别有用。
可以使用包括2’ -O-Me化合物和PNA的反义修饰的寡核苷酸。例如，这样的寡核苷酸可以被设计为诱导外显子跳跃，例如突变体肌养蛋白基因可以被递送到肌肉细胞，用于治疗杜兴肌营养不良(Ducherme Muscular Dystrophy)；抑制发夹环的反义寡核苷酸例如用于治疗肌强直性营养不良；以及反式剪接寡核苷酸例如用于治疗脊髓性肌萎缩。
外源遗传物质可通过许多不同的技术导入外来体。在本发明特别优选的实施方式中，外来体通过电穿孔或使用转染试剂进行装载。本发明人已经确定，尽管外来体尺寸小， 但是仍可能使用电穿孔将外来体装载有外源遗传物质。鉴于外来体相比细胞小的尺寸，这是令人惊讶的。外推细胞电穿孔所用的电压以将外来体的尺寸考虑在内表明，过高的电压对于外来体的电穿孔来说将是必须的。然而，令人惊讶地，本发明人已经确定，采用电穿孔以将外来体装载有质粒DNA和siRNA是可能的。一般的电压在20V/cm到lOOOV/cm的范围内，诸如20V/cm到100V/cm,其中电容一般在25 μ F禾口 250 μ F之间，诸如在25 μ F禾口 125 μ F 之间。
在本发明的可选方面，本发明人也已经确定利用转染试剂装载外来体是可能的。 尽管外来体尺寸小，但是传统的转染试剂可用于转染具有遗传物质的外来体。根据本发明使用的优选转染试剂包括阳离子脂质体。
靴向
本发明还涉及外来体靶向期望的细胞类型或组织。该靶向通过在外来体表面表达与在待靶向细胞表面上表达的细胞表面部分相结合的靶向部分来实现。一般地，靶向部分是肽，其被表达为具有一般在外来体表面上表达的跨膜蛋白的融合蛋白。
更具体地，外来体可通过在其表面表达靶向部分诸如肽而靶向特定细胞类型或组织。合适的肽是与细胞表面部分结合的那些，诸如在待靶向的细胞的细胞表面上见到的受体或其配体。合适的靶向部分的实例是短肽、scFv和完整的蛋白质，只要靶向部分可被表达在外来体的表面上并且不干扰膜蛋白插入外来体。一般地，靶向肽与跨膜外来体蛋白是异源的。肽靶向部分一般地长度可小于100个氨基酸，例如长度小于50个氨基酸，长度小于30个氨基酸，至10、5或3个氨基酸的最小长度。
靶向部分可以被选择以靶向特定的组织类型例如诸如肌肉、脑、肝、胰和肺，或靶向患病的组织诸如肿瘤。在本发明特别优选的实施方式中，外来体靶向脑组织。
靶向部分的具体实例包括肌肉特异性肽，其通过噬菌体展示发现，[33]靶向骨骼肌；狂犬病病毒糖蛋白的四个氨基酸片段，其与乙酰胆碱受体结合[36]；或者靶向其受体以靶向神经元的神经生长因子片段[37]；以及胰泌素肽，其与胰泌素受体结合，可用于靶向胆和胰上皮细胞[38]。作为可选方案，免疫球蛋白和其衍生物，包括scFv抗体片段，也可被表达为融合蛋白以靶向特异性抗原诸如VEGFR，用于癌基因治疗。作为可选方案，受体的天然配体可被表达为融合蛋白以赋予特异性诸如结合NGFR的NGF，以及赋予神经元特异性靶向。
肽靶向部分通过使其表达为具有外来体跨膜蛋白的融合蛋白而表达在外来体表面上。已知许多蛋白质与外来体结合；也就是说，它们在其形成时被并入外来体。根据本发明使用的优选蛋白质是作为跨膜蛋白的那些。实例包括但不限于Lamp-l、Lamp-2、⑶13、 CD86、阀蛋白、突触融合蛋白-3、CD2、CD36、CD40、CD40L、CD41a、CD44、CD45、ICAM-1、整联蛋白 α 4、LiCAM、LFA-l、Mac-l α 禾口 β、Vti—IA 禾口 B、CD3 ε 禾口 ζ、CD9、CD18、CD37、CD53、 CD63、CD81、CD82、CXCR4、FcR、GluR2/3、HLA-DM(MHC II)、免疫球蛋白、MHC-I 或 MHC-II 成分、TCRi3和四旋蛋白(四跨膜蛋白，tetraspanin)。在本发明特别优选的实施方式中，跨膜蛋白选自Lamp-1、Lamp-2、⑶13、⑶86、阀蛋白、突触融合蛋白-3。在特别优选的实施方式中，跨膜蛋白是Lamp-2。Lamp-2的序列被列于SEQ ID No 1中。
下面的部分涉及本发明所有肽的一般特征，并且具体地涉及包括在本发明多肽中的氨基酸序列的变异、改变、修饰或衍生。应当理解，如本文所述的多肽的这种变异、改变、 修饰或衍生以下列要求为条件多肽保留任何进一步需要的活性或特征，如本公开后续部分具体说明的。
本发明多肽的变体可通过特定水平的氨基酸同一性限定，这在本公开后续部分中有更详细的描述。氨基酸同一性可采用任何合适的算法计算。例如，PILEUP和BLAST算法可被用于计算同源性或比对序列(line up sequence)(诸如确定相当的或相应的序列(一般在其默认设置下)，例如在 Altschul S. F. (1993) J Mol Evol 36 =290-300 ；Altschul, S, F et al(1990)J Mol Biol 215 :403-10中所述。进行BLAST分析的软件通过美国国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information) (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/)公共得到。这种算法包括首先通过在询问序列中确定长度W的短字符来确定高得分序列对(HSI^s)，所述长度W的短字符当与数据库序列中相同长度的字符比对时匹配或满足一些正值阈得分Τ。T被称为相邻字符得分阈(Altschul等人，同上)。这些初始相邻字符命中(hit)充当启动搜索的种子以寻找包含它们的HSI^s。字符命中沿着各个序列两个方向延伸直至累积比对得分能增加。在下列时候字符命中在各方向的延伸停止累积比对得分从其最大所达到的值下降的量为X ；累计得分由于一个或多个负得分残基比对而回到零或以下；或者达到任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定了比对的灵敏度和速度。BLAST程序采用默认值字符长度(W)为11 ；BL0SUM62得分矩阵(参见HenikofT 和 Henikoff (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :10915-10919)比对(B)为 50，期望值(E) 为10，M = 5，N = 4和两条链的比较。
BLAST算法进行两序列之间相似性的统计分析；参见例如Karlin和 Altschul (1993)Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :5873_5787。BLAST 算法所提供的相似性的一个量度是最小加和概率(P(N))，其提供了两个多核苷酸或氨基酸序列间的匹配可偶然发生的概率指示。例如，如果是下列情况，一个序列被认为与另一序列相似在比较第一序列与第二序列时最小加和概率小于约1，优选地小于约0. 1，更优选地小于约0. 01以及最优选地小于约0.001。可选地，UWGCG程序包提供BESTFIT程序，其可用于计算同源性(例如在其默认设置下使用)(Devereux 等人(1984)Nucleic Acids Research 12,387-395)
应当理解，本发明多肽的变体也包括置换变体。置换变体优选地涉及一个或多个氨基酸用相同数目的氨基酸置换和进行保守氨基酸置换。例如，氨基酸可用具有相似性质的可选氨基酸——例如另一碱性氨基酸、另一酸性氨基酸、另一中性氨基酸、另一带电荷氨基酸、另一亲水性氨基酸、另一疏水性氨基酸、另一极性氨基酸、另一芳族氨基酸或另一脂肪族氨基酸——置换。可用于选择合适取代基的20种主要氨基酸的一些性质如下
权利要求
1.组合物，其包括外来体，其中所述外来体被装载有外源遗传物质。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述外来体衍生自树突细胞。
3.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述外源遗传物质是编码治疗蛋白或免疫原的DNA质粒。
4.根据权利要求1或2所述的组合物，其中所述外源遗传物质是siRNA。
5.根据权利要求3所述的组合物，其中所述质粒编码用于基因治疗方法的治疗蛋白。
6.根据权利要求3所述的组合物，其中所述质粒编码免疫原，用于产生对免疫原免疫应答的方法。
7.根据前述权利要求任一项所述的组合物，其中所述外来体包括在所述外来体表面上表达的靶向部分。
8.根据权利要求7所述的组合物，其中所述靶向部分包括与待靶向的细胞上存在的部分结合的肽。
9.根据权利要求8所述的组合物，其中所述外来体包括外来体跨膜蛋白，其已经被修饰以并入肽靶向部分。
10.根据权利要求9所述的组合物，其中所述外来体跨膜蛋白选自Lamp-l、Lamp-2、 ⑶13、⑶86、阀蛋白、突触融合蛋白-3。
11.根据权利要求4所述的组合物，其中所述外来体跨膜蛋白是Lamp-2b。
12.组合物，其包括含有遗传物质的外来体，其中所述外来体衍生自未成熟的树突细胞，用于体内递送遗传物质的方法。
13.在非人动物模型中基因沉默的方法，其包括给所述动物施用根据权利要求4所述的外来体，其中所述siRNA相对于待沉默的基因定向。
14.将外来体装载有遗传物质的方法，其包括提供外来体的组合物，并且通过电穿孔用遗传物质装载所述外来体。
15.根据权利要求14的方法，其中所述电穿孔在20v/cm至lOOv/cm之间的电压下进行。
16.将外来体装载有遗传物质的方法，其包括提供外来体的组合物，并且采用阳离子脂质体转染试剂通过转染用核酸装载所述外来体。
17.根据权利要求14至16任一项所述的方法，其中所述外来体衍生自树突细胞。
全文摘要
本发明涉及装载有遗传物质的外来体及其生产方法，以及这种外来体用于体内递送遗传物质的应用，具体地涉及这种外来体在基因治疗或基因沉默的方法中的应用。
文档编号A61K48/00GK102497887SQ201080026864
公开日2012年6月13日 申请日期2010年4月15日 优先权日2009年4月17日
发明者L·奥瓦瑞兹, M·伍德, Y·赛奥 申请人:Isis创新公司