专利名称：Qtl的精细定位的制作方法
技术领域：
QTL的精细定位，属于分子生物学领域。
背景技术：
遗传背景的干扰和分离群体大小是影响QTL定位精度的两个重要因素。QTL定位中常用的分离群体，如F2、 BQ、 RIL、 DH等一般被称为初级群体。利用初级群体进行的QTL定位称为初级定位。这类群体内除了目标性状发生分离外还存在较广泛的背景遗传因子的随机分离，用于QTL定位时很难排除遗传背景对QTL效应的干扰，而且限于费用和工作量，实际所用群体较小，因此，初级定位的精度通常不高，而且无论怎样增加标记密度、减少环境噪音或改进统计方法，都不能使定位的精度达到很高，具体表现在(1)估计出的QTL位置的置信区间一般都在10cM以上(Alpert & Tanksley， 1996)，不能确定检测到的QTL中是只包含一个主效QTL还是包含多个微效QTLs(Yano & Sasaki, 1997)，不能将数量性状确切地分解成单个的孟德尔因子。(2)对表型效应贡献较少的QTL常不能被准确鉴定出来，使得对QTL的数目估计偏低，而对每个QTL的效应估计偏高，这种趋势随群体縮小变得更加明显(Hyne et al. ，1995)。 (3)同一性状在不同环境下定位结果不一致(Paterson et al.，1988， 1990)。为了更精确地了解数量性状的遗传基础并实现QTL的克隆，在初级定位的基础上，还须对QTL进行高分辨率(亚厘摩水平)的精细定位，为此需要构建特殊的群体。
发明内容
1、导入系及其构建 导入系(Introgression line, IL)，又称染色体片段代换系(Chromosomalsegment substitutionline， CSSL)，含有特定基因时又称近等基因系(Nearisogenic line，NIL)。导入系一般是通过多代回交和自交并利用分子标记辅助选择(Marker-assisted selection,MAS)的手段使供体亲本染色体片段导入到受体亲本中建成的。由于导入系遗传背景与受体亲本大体相同，只有少数供体亲本导入片段的差异，因而，导入系和受体亲本的任何表现型差异均由导入片段引起的，这为遗传分析和功能鉴定提供了良好的研究材料，提高了基因定位的准确性。 构建导入系时，分子标记辅助选择一般多从低代开始，但也可以从高代开始。Kuboet al(2002)以籼粳稻材料互为受体亲本，用低代(从BC^开始)和高代(从BC^开始)标记辅助选择的方法同时构建了两套导入系。进一步比较发现，两套导入系中受体亲本所占基因组比例没有显著差异，但高代标记辅助选择的次数少，工作量小，选择效率高。
2、单个QTL的精细定位 单个QTL的精细定位必须使用含有该QTL的导入系或近等基因系(QTL-NIL)。 一个理想的导入系应该是，除了目标基因所在的染色体片段完整的来自供体亲本之外，基因组其余部分全部与受体亲本相同，这样在导入系与受体亲本的杂交后代中，仅在代换片段上存在基因分离，因而QTL定位分析只局限在很窄的染色体区段上，消除了遗传背景的干
3扰，从遗传和统计两方面保证了 QTL定位的精确性。
3、全基因组QTL的精细定位 要实现全基因组QTL的精细定位，首先必须构建一套覆盖整个基因组的重叠导入 系，也就是在轮回亲本的遗传背景中建立供体亲本的"基因文库"。 一套理想的重叠导入系 应该是每个导入系仅含一个代换片段且代换片段首尾相接、相互重叠。应用重叠导入系对 某一数量性状进行QTL的精细定位，首先要经过多点、多年的重复试验鉴定出目标性状与 轮回亲本有显著差异的导入系，然后采用代换作图法(Paterson et al. ， 1990)，比较目标 性状在重叠导入系中的差别，若差异不显著，则说明它们所带的QTL是相同的，且位于它们 的重叠区内；若差异显著，则说明它们所带的QTL是不同的，分别位于各自的非重叠区。QTL 代换作图的结果需进一步经导入系与受体亲本之间或导入系之间的分离群体来验证。需要 指出的是，可能有的导入系与轮回亲本间没有显著的表型差异，但与其它导入系杂交时却 表现出效应，这说明它实际上含有QTL，只是单独存在时不起作用，而必须与某个(些)QTL 共同存在时才表现出表型效应(上位性效应)。应用重叠导入系，Paterson et al. (1990) 将控制番茄固形物含量、果实重量性状的QTL定位到一个3cM的区间，并认为控制这两个性 状的QTL是紧密连锁而不是一因多效。Eshed & Zamir(1995)将原先在回交分离群体中定 位的1个果实重量的QTL分解为3个紧密连锁的QTLs。 重叠代换系的构建则必须借助完整的DNA标记连锁图谱，且一般从低代即开始进 行标记辅助选择。对于一个全长为1500cM的基因组来说，假设要求每个代换片段长为10cM 且相邻片段首尾相接，没有重叠，则需要建立150个导入系才能覆盖整个基因组。这只是一 个理论下限，实际情况要复杂得多。要建立一套理想的重叠代换系在实践上还是很困难的。
具体实施例方式
1、导入系及其构建 导入系(Introgression line, IL)，又称染色体片段代换系(Chromosomal segment substitutionline， CSSL)，含有特定基因时又称近等基因系(Near isogenic line，NIL)。导入系一般是通过多代回交和自交并利用分子标记辅助选择 (Marker-assisted selection,MAS)的手段使供体亲本染色体片段导入到受体亲本中建成 的。由于导入系遗传背景与受体亲本大体相同，只有少数供体亲本导入片段的差异，因而， 导入系和受体亲本的任何表现型差异均由导入片段引起的，这为遗传分析和功能鉴定提供 了良好的研究材料，提高了基因定位的准确性。 构建导入系时，分子标记辅助选择一般多从低代开始，但也可以从高代开始。Kubo et al(2002)以籼粳稻材料互为受体亲本，用低代(从BC^开始)和高代(从BC^开始) 标记辅助选择的方法同时构建了两套导入系。进一步比较发现，两套导入系中受体亲本所 占基因组比例没有显著差异，但高代标记辅助选择的次数少，工作量小，选择效率高。
2、单个QTL的精细定位 单个QTL的精细定位必须使用含有该QTL的导入系或近等基因系(QTL-NIL)。 一 个理想的导入系应该是，除了目标基因所在的染色体片段完整的来自供体亲本之外，基因 组其余部分全部与受体亲本相同，这样在导入系与受体亲本的杂交后代中，仅在代换片段 上存在基因分离，因而QTL定位分析只局限在很窄的染色体区段上，消除了遗传背景的干扰，从遗传和统计两方面保证了 QTL定位的精确性。 精细定位目标QTL的程序是(l)将导入系与受体亲本杂交，建立仅在导入片段上 发生基因分离的&群体。(2)调查&群体中各单株的目标性状值。(3)筛选导入系与受体 亲本之间的多态性分子标记。(4)用筛选出的标记测定&各单株的标记基因型。(5)联合 表现型数据和标记基因型数据进行分析，估计出目标QTL与标记间的连锁距离。在QTL初 级定位中所用的定位方法均可用于精细定位中的数据分析。由于精细定位的精度要达到亚 厘摩水平(< lcM)，因此，为了检测到重组基因型，F2群体必须非常大(通常> 1000)。
建立单个QTL的导入系或近等基因系时， 一般先对目标QTL进行初级定位，然后 在回交过程中对其所在区域进行标记辅助选择(Alpert et al. ，1995 ;Yano et al. ，1997 ; Yamamoto et al. ， 1998)。因此，初级定位的准确性直接影响到标记辅助选择的可靠性。这 种建立目标QTL导入系的方法一般只适用于一些效应较大的QTL，因为只有效应较大的QTL 才能被较准确地定位。另外，导入系只对定位一个目标QTL有效，不能用于定位同一性状的 其它QTLs及其它性状的QTLs，所以培育不同目标QTL的导入系需要花费很长时间。而且由 于回交代数有限和连锁累赘的作用，构建的导入系往往含有目标区段之外的其它染色体片 段，这增加了在非目标区段检测到假阳性标记的机会。
3、全基因组QTL的精细定位 要实现全基因组QTL的精细定位，首先必须构建一套覆盖整个基因组的重叠导入 系，也就是在轮回亲本的遗传背景中建立供体亲本的"基因文库"。 一套理想的重叠导入系 应该是每个导入系仅含一个代换片段且代换片段首尾相接、相互重叠。应用重叠导入系对 某一数量性状进行QTL的精细定位，首先要经过多点、多年的重复试验鉴定出目标性状与 轮回亲本有显著差异的导入系，然后采用代换作图法(Paterson et al. ， 1990)，比较目标 性状在重叠导入系中的差别，若差异不显著，则说明它们所带的QTL是相同的，且位于它们 的重叠区内；若差异显著，则说明它们所带的QTL是不同的，分别位于各自的非重叠区。QTL 代换作图的结果需进一步经导入系与受体亲本之间或导入系之间的分离群体来验证。需要 指出的是，可能有的导入系与轮回亲本间没有显著的表型差异，但与其它导入系杂交时却 表现出效应，这说明它实际上含有QTL，只是单独存在时不起作用，而必须与某个(些)QTL 共同存在时才表现出表型效应(上位性效应)。应用重叠导入系，Paterson et al. (1990) 将控制番茄固形物含量、果实重量性状的QTL定位到一个3cM的区间，并认为控制这两个性 状的QTL是紧密连锁而不是一因多效。Eshed & Zamir(1995)将原先在回交分离群体中定 位的1个果实重量的QTL分解为3个紧密连锁的QTLs。 重叠代换系的构建则必须借助完整的DNA标记连锁图谱，且一般从低代即开始进 行标记辅助选择。对于一个全长为1500cM的基因组来说，假设要求每个代换片段长为10cM 且相邻片段首尾相接，没有重叠，则需要建立150个导入系才能覆盖整个基因组。这只是一 个理论下限，实际情况要复杂得多。要建立一套理想的重叠代换系在实践上还是很困难的。
权利要求
导入系及其构建导入系(Introgression line，IL)，又称染色体片段代换系(Chromosomal segment substitutionline，CSSL)，含有特定基因时又称近等基因系(Near isogenic line，NIL)，导入系一般是通过多代回交和自交并利用分子标记辅助选择(Marker-assisted selection，MAS)的手段使供体亲本染色体片段导入到受体亲本中建成的，由于导入系遗传背景与受体亲本大体相同，只有少数供体亲本导入片段的差异，因而，导入系和受体亲本的任何表现型差异均由导入片段引起的，这为遗传分析和功能鉴定提供了良好的研究材料，提高了基因定位的准确性，构建导入系时，分子标记辅助选择一般多从低代开始，但也可以从高代开始，Kubo et al(2002)以籼粳稻材料互为受体亲本，用低代(从BC1F1开始)和高代(从BC3F1开始)标记辅助选择的方法同时构建了两套导入系，进一步比较发现，两套导入系中受体亲本所占基因组比例没有显著差异，但高代标记辅助选择的次数少，工作量小，选择效率高。
2. 单个QTL的精细定位单个QTL的精细定位必须使用含有该QTL的导入系或近等基因系(QTL-NIL)， 一个理想的导入系应该是，除了目标基因所在的染色体片段完整的来自供体亲本之外，基因组其余部分全部与受体亲本相同，这样在导入系与受体亲本的杂交后代中，仅在代换片段上存在基因分离，因而QTL定位分析只局限在很窄的染色体区段上，消除了遗传背景的干扰，从遗传和统计两方面保证了 QTL定位的精确性。
3. 全基因组QTL的精细定位要实现全基因组QTL的精细定位，首先必须构建一套覆盖整个基因组的重叠导入系，也就是在轮回亲本的遗传背景中建立供体亲本的"基因文库"， 一套理想的重叠导入系应该是每个导入系仅含一个代换片段且代换片段首尾相接、相互重叠，应用重叠导入系对某一数量性状进行QTL的精细定位，首先要经过多点、多年的重复试验鉴定出目标性状与轮回亲本有显著差异的导入系，然后采用代换作图法(Paterson et al. ， 1990)，比较目标性状在重叠导入系中的差别，若差异不显著，则说明它们所带的QTL是相同的，且位于它们的重叠区内；若差异显著，则说明它们所带的QTL是不同的，分别位于各自的非重叠区，QTL代换作图的结果需进一步经导入系与受体亲本之间或导入系之间的分离群体来验证，需要指出的是，可能有的导入系与轮回亲本间没有显著的表型差异，但与其它导入系杂交时却表现出效应，这说明它实际上含有QTL，只是单独存在时不起作用，而必须与某个(些)QTL共同存在时才表现出表型效应(上位性效应)，应用重叠导入系，Paterson et al. (1990)将控制番茄固形物含量、果实重量性状的QTL定位到一个3cM的区间，并认为控制这两个性状的QTL是紧密连锁而不是一因多效。Eshed&Zamir(1995)将原先在回交分离群体中定位的1个果实重量的QTL分解为3个紧密连锁的QTLs，重叠代换系的构建则必须借助完整的DNA标记连锁图谱，且一般从低代即开始进行标记辅助选择，对于一个全长为1500cM的基因组来说，假设要求每个代换片段长为10cM且相邻片段首尾相接，没有重叠，则需要建立150个导入系才能覆盖整个基因组，这只是一个理论下限，实际情况要复杂得多，要建立一套理想的重叠代换系在实践上还是很困难的。
全文摘要
遗传背景的干扰和分离群体大小是影响QTL定位精度的两个重要因素。QTL定位中常用的分离群体，如F2、BC1、RIL、DH等一般被称为初级群体。这类群体内除了目标性状发生分离外还存在较广泛的背景遗传因子的随机分离，用于QTL定位时很难排除遗传背景对QTL效应的干扰，而且限于费用和工作量，实际所用群体较小，因此，初级定位的精度通常不高，而且无论怎样增加标记密度、减少环境噪音或改进统计方法，都不能使定位的精度达到很高，为了更精确地了解数量性状的遗传基础并实现QTL的克隆，在初级定位的基础上，还须对QTL进行高分辨率(亚厘摩水平)的精细定位，为此需要构建特殊的群体。
文档编号C12Q1/68GK101760542SQ20081023863
公开日2010年6月30日 申请日期2008年12月19日 优先权日2008年12月19日
发明者李祥 申请人:李祥