专利名称：一粒小麦抗白粉病基因Mlm2033的分子标记及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子遗传学领域，涉及小麦抗白粉病基因Mlm2033的分子标记及其应用。
背景技术：
小麦是全球最主要的粮食作物，在中国也是仅次水稻的第二大粮食作物。目前，世 界小麦毎年的产量约为6. 2亿吨，提供了人类所需的1/5能量，小麦的生产关乎着人类生存。普通小麦是ー个异源六倍体物种，含有A、B、D三个不同的染色体组，与小麦基因组具有同源或部分同源的野生种及原始种中蕴含了丰富的基因资源。利用小麦种质资源中优异的等位变异是实现小麦稳产、增产的关键因素。小麦白粉病是由子囊菌纲中高度专性寄生的禾谷白粉菌小麦专化型Blumeriagraminis f. sp. tritici侵染而引起的一种气传病。它引起的小麦白粉病是由ー种严重的小麦叶部病害。病菌侵染小麦后，吸收植株营养，使小麦植株的光合能力下降甚至完全丧失，最终导致成穗数、穗粒数和千粒重下降，能够导致小麦产量损失5% 34%，严重时能达到45%甚至绝收。在众多的的小麦白粉病防治措施中，培育和推广抗病品种最为经济有效并且环保。当前生产上抗白粉病利用的主要是质量抗性基因。但是，由于白粉病质量抗性具有小种专化性，病原菌的无毒基因与抗性基因进行协同进化，在生产上大面积推广使用单ー抗病品种很容易导致产生新的毒性小种，从而使所携帯的抗病基因丧失其抗性。从小麦种质资源中发掘与利用新的抗白粉基因是小麦遗传学家和育种家们的一个长期目标与挑战。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供小麦抗白粉病基因Mlm2033的分子标记。本发明的另一目的是提供该小麦抗白粉病基因Mlm2033的分子标记应用。本发明的目的可通过如下技术方案实现小麦抗白粉病基因Mlm2033的分子标记，所述的分子标记MAG5827 ；所述的分子标记MAG5827 左端引物序列为SEQ ID NO. 1，右端引物序列为SEQ ID NO. 2，扩增产物为282bp，此分子标记来自一粒小麦TA20337AL染色体，为共显性分子标记，利用Mapmaker Macintosh V 2. 0测得与Mlm2033基因的遗传距离为0. 4cM。所述的分子标记在小麦种质资源中抗白粉病基因的鉴定和转移中的应用。一粒小麦抗白粉病基因Mlm2033的分子标记方法，用以下的任意ー对分子标记引物PCR扩增待检小麦基因组DNA，并检测扩增产物分子标记MAG5827
左端引物序列为SEQ ID NO. 1，右端引物序列为SEQ ID NO. 2 ；如果用引物MAG5827能够扩增出282bp的扩增片段，则标志着待检小麦存在抗白粉病基因Mlm2033。ー种筛选抗白粉病小麦的方法，其特征在于用权利要求I所述的引物对之ー扩增待检小麦基因组DNA，如果用引物MAG5827能够扩增出282bp的扩增片段，则标志该待检小麦为存在抗白粉病Mlm2033的抗白粉病小麦。上述小麦抗白粉病基因Mlm2033的分子标记可通过以下方法获得( 一)TA2033与M389F2代的创建与表型鉴定
(I)栽培一粒小麦TA2033 (3)与栽培一粒小麦M389 (早)进行杂交得到杂种F1,
F1自交产生F2群体。(2)F2代群体单株种植于穴盘，放置温室，白天22度14小时，晚上18度10小吋。一叶一心期接种白粉病，接种7天后进行抗性调查。鉴定结果见表I。(3)F2代单株调查后将感病植株移苗大田，自交所得种子为F3家系。每个F3家系中选择18粒进行子代测验。(4)通过对F2进行遗传分析，推定抗病种质中携带的抗病基因的个数。( ニ)多态性分子标记筛选(5)将6株抗病F2单株的叶片等量混合成抗池，6株感病F2单株的叶片等量混合成感池。用SDS法(Ma and Sorrells, 1995)提取抗病亲本TA2033、感病亲本M389、抗池和感池的DNA,应用简单重复序列标记SSR与BSA (Bulk segregant analysis)结合的方法进行多态性筛选。(6)首先利用37对SSR引物对TA2033、M389、抗池和感池进行多态性筛选。PCR 反应体积为 25 微升，其中 IOXbuffer 2. 5 微升，25mM MgC121. 5 微升，2. 5mMdNTPs 2微升，Taq酶(5单位/微升)0. 2微升，10 y M引物(F/R)各0. 5微升，模板DNA20纳克，加水至25微升；SSR反应体系为DNA 94°C预变性3min后，94°C变性lmin，50_65°C (视引物而定)退火lmin，72°C延伸lmin，循环35次，最后72°C延伸IOmin ； 在PCR扩增仪上进行PCR扩增，扩增产物在8 %非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，然后在紫外透射仪上照相，记录结果选择在亲本间和F2代群体的R、S池间扩增出相同有多态型的引物，与Mlm2033连锁的候选分子标记I对；(三)分子标记获得(7)分子标记的开发，上述标记ZMG132被定位于小麦7AL，由于小麦的第七群与短柄草的第一群有宏观共线性，利用短柄草对应的区段捜索小麦EST并开发标记，其中根据EST CJ579028转化的标记，MAG5827的PCR产物在抗感亲本及抗感池中有一致的多态。(8)根据连锁交换规律，利用扩增获得的纯和感病家系各单株的基因型资料与抗性鉴定获得的抗性资料构建I对分子标记与Mlm2033基因的连锁图，所用软件为MapmakerMacintosh V 2. 0，获得了与Mlm2033紧密连锁的分子标记MAG5827，利用MapmakerMacintosh V 2. 0测得与Mlm2033基因的遗传距离分别为0. 4cM ；
(四)抗谱的获得(9)利用本实验室全部 的15个白粉病生理小种分别接种抗病材料TA2033，记录抗病材料TA2033对不同生理小种的抗病表现。(五)向普通小麦的转移(10)利用获得的分子标记，通过先将抗病基因Mlm2033导入到四倍体中，再导入到普通小麦获得携帯有Mlm2033的普通小麦品种(简称为桥梁亲本法)。有益效果本发明在一粒小麦中发现了ー个抗白粉病基因Mlm2033，Mlm2033优异的抗病表现使得其在抗白粉病育种中有重要的价值。获得了与其紧密连锁的分子标记MAG5827。利用获得的分子标记，通过桥梁亲本法将Mlm2033转移到推广品种扬麦158中，成功获得了携带有Mlm2033的抗病扬麦158。I、在一粒小麦中鉴定了ー个抗白粉病基因Mlm2033。2、对Mlm2033的抗谱进行測定，结果显示Mlm2033抗本实验室全部15个白粉病生理小种，具有优异的抗性，是白粉病育种中优良的抗病基因。3、获得了与小麦抗白粉病基因Mlm2033紧密连锁的分子标记MAG5827。MAG5827与基因的遗传距离为0. 4cM,同时也是共显性分子标记，能够帮助该基因向推广品种中转移以及与其它抗病基因聚合。4、鉴定方便。分子标记具有检测方便、扩增稳定、简便等优点。用标记MAG5827检测小麦抗白粉病基因Mlm2033，可以确定Mlm2033的存在与否以及存在状态，并预测白粉病抗性，进而加快转移Mlm2033的利用。5、本发明提出了利用一粒小麦种质资源中抗白粉病基因的方法利用分子标记筛选，通过桥梁亲本法将Mlm2033导入到六倍体小麦中；利用该方法成功获得了抗白粉病的扬麦158。
图I分子标记扩增带型MAG5827扩增带型，其中I，2，3，4分别为抗病品种TA2033、感病品种M389、抗池和感池，M :pUC19/MspI，箭头所指为282bp特异扩增条带；图2MAG5827与小麦抗白粉病基因Mlm2033的遗传连锁图，左边为标记间的图距，箭头所指方向为端粒方向。
具体实施例方式实施例I( 一)TA2033与M389F2代的创建与表型鉴定( 一 ) TA2033与M389F2代的创建与表型鉴定(I)栽培一粒小麦TA2033 (3)与栽培一粒小麦M389 (早)进行杂交得到杂种F1,
F1自交产生F2群体。(2)F2代群体单株种植于穴盘，放置温室，白天22度14小时，晚上18度10小吋。一叶一心期接种白粉病，接种7天后进行抗性调查。鉴定结果见表I。
表IBgt 19 接种后 M389 X TA2033F2 群体 0058](3)F2代单株调查后将感病植株移苗大田，自交所得种子为F3家系。每个F3家系中选择18粒进行子代测验。验证感病单株是否为纯和感病家系。(4)通过对ろ进行遗传分析，发现抗病种质TA2033中携帯有ー个显性抗病基因。( ニ)多态性分子标记筛选(I)将6株抗病F2单株的叶片等量混合成抗池，6株感病F2单株的叶片等量混合成感池。用SDS法(Ma and Sorrells, 1995)提取抗病亲本TA2033、感病亲本M389、抗池和感池的DNA,应用简单重复序列标记SSR与BSA (Bulk segregant analysis)结合的方法进行多态性筛选。(2)首先利用 37 对 SSR 引物(bare =Song QJ, Shi JR, Singh S，Fickus Eff,Costa JM, Lewis J, Gill BS, Ward R, Cregan PB (2005) Development and mappingof microsatellite (SSR)markers in wheat.Theor Appl Genet 110 :550-560 ;gwm :Roder MS, Korzun V, Wendehake K, Plaschke J, Tixer MH, Leroy P, Ganal MW(1998)Amicrosatellite map of wheat. Genetics 149 :2007-2023；wmc ffheat MicrosatelliteConsortium(http://wheat, pw. usda. gov) ；cfa, gpw :Sourdille，s lab(http://wheat.pw.usda.gov) ；cfd Guyomarc> h H, Sourdille P, Charmet G, Edwards KJ, BernardM(2002)Characterization of polymorphic microsate丄Iite markers from Aegilopstauschn and transferaoility to the D—genome of bread wheat. Theor Appl Genet104 :1164-1172 ；gdm Pestsova E, Ganal MW, Rflder MS (2000) Isolation and mappingof microsatel丄ite markers speciffc for the D genome of bread wheat. Genome 43:689-697)对TA2033、M389、抗池和感池进行多态性筛选。PCR 反应体积为 25 微升，其中 IOXbuffer 2. 5 微升，25mM MgC121. 5 微升，2. 5mMdNTPs 2微升，Taq酶(5单位/微升)0. 2微升，10 y M引物(F/R)各0. 5微升，模板DNA 20纳克，加水至25微升；SSR反应体系为DNA 94°C预变性3min后，94°C变性lmin，50_65°C (视引物而定)退火lmin，72°C延伸展lmin，循环35次，最后72°C延伸IOmin ；其中SSR标记ZMG132在抗感亲本与抗感池之间检测到了一致多态。(三)分子标记的开发(3)分子标记的开发，根据 Singriin 的定位结果(Singriin C, Hsam SLK, ZellerFJ, Wenzel Lr, Mohler V(2004)Localization of a novel recessive powdery mildewresistance gene from common wheat line RD30in the terminal region of chromosome7AL. Theor Appl Genet 109 :210-214)，ZMG132被定位于7AL。由于小麦的第七群与短柄草的第一群有宏观共线性，利用短柄草对应的区段捜索小麦EST并开发标记，其中根据ESTCJ579028转化的标记，MAG5827的PCR产物在抗感亲本及抗感池中有一致的多态(图I)。(4)根据连锁交换规律，利用扩增获得的纯和感病家系各单株的基因型资料与抗性鉴定获得的抗性资料构建I对分子标记与Mlm2033基因的连锁图，所用软件为MapmakerMacintosh V 2. 0，获得了与Mlm2033紧密连锁的分子标记MAG5827，利用MapmakerMacintosh V 2. 0测得与Mlm2033基因的遗传距离分别为0. 4cM(图2)；(四)抗谱的获得(5)利用本实验室全部的15个白粉病生理小种分别接种抗病材料TA2033，结果发现TA2033对15个生理小种表现抗病，是优良的抗病基因。(五)向普通小麦的转移
(6)利用获得的分子标记，通过先将抗病基因Mlm2033导入到四倍体中，再导入到普通小麦获得携帯有Mlm2033的普通小麦品种(简称为桥梁亲本法)。利用上述策略，成功获得了携带有Mlm2033的抗病扬麦158。小麦种质资源中蕴含丰富的基因资源，利用这些基因资源对于小麦具有重要作用。本发明通过将抗病种质TA2033与感病品种杂交，通过遗传分析确定抗病材料中携帯有ー个显性的抗病基因，通过分子标记筛选，并构建分离群体，发现抗病基因位于小麦7AL染色体上，通过构建分离群体同时利用分子标记的方法构建了抗病基因Mlm2033的遗传连锁图。抗谱测试发现Mlm2033具有优异的白粉病抗性，是小麦抗白粉病育种的优良抗源。利用分子标记MAG5827，通过桥梁亲本法成功将抗白粉病基因Mlm2033导入到推广品种扬麦158中。在传统育种的方法中，由于不知道抗病材料的遗传及其连锁的分子标记，每代转移都需要抗性鉴定，费时费力，因此，已知与Mlm2033紧密连锁的分子标记，可以简便快捷的筛选含有Mlm2033的植株，分子标记MAG5827的应用，可以大大节省抗病材料的筛选时间和劳力，并加强预测的准确性。
权利要求
1.一粒小麦抗白粉病基因Mlm2033的分子标记，其特征在于所述的分子标记MAG5827 ； 所述的分子标记MAG5827 左端引物序列为SEQ ID NO. 1， 右端引物序列为SEQ ID NO. 2， 扩增产物为282bp，此分子标记来自一粒小麦TA20337AL染色体，为共显性分子标记，利用Mapmaker Macintosh V 2. 0测得与Mlm2033基因的遗传距离为0. 4cM。
2.权利要求I所述的分子标记在小麦野生种质资源中抗白粉病基因的鉴定和转移中的应用。
3.—粒小麦抗白粉病基因Mlm2033的分子标记方法,其特征在于用以下的ー对分子标记引物PCR扩增待检小麦基因组DNA，并检测扩增产物 分子标记MAG5827 左端引物序列为SEQ ID NO. 1， 右端引物序列为SEQ ID NO. 2 ； 如果用引物MAG5827能够扩增出282bp的扩增片段，则标志着待检小麦存在抗白粉病基因 Mlm2033。
4.ー种筛选抗白粉病小麦的方法,其特征在于用权利要求I所述的引物对之ー扩增待检小麦基因组DNA，如果用引物MAG5827能够扩增出282bp的扩增片段，则标志该待检小麦为存在抗白粉病Mlm2033的抗白粉病小麦。
全文摘要
本发明属于分子遗传学领域，涉及小麦抗白粉病基因Mlm2033的分子标记及其应用。所述的分子标记MAG5827与Mlm2033基因的遗传距离为0.4cM。利用分子标记MAG5827选择含有Mlm2033单株，通过桥梁亲本法可以将一粒小麦中的抗白粉病基因Mlm2033转移到普通小麦中。利用本发明与Mlm2033紧密连锁的分子标记，可以简便快捷的筛选含有Mlm2033的植株，分子标记MAG5827的应用，可以大大节省抗病材料的筛选时间和劳力，并加强预测的准确性。
文档编号C12N15/11GK102653758SQ201210085158
公开日2012年9月5日 申请日期2012年3月28日 优先权日2012年3月28日
发明者付必胜, 马正强 申请人:南京农业大学