辣椒高效遗传转化及植株再生的方法与流程

本发明属于植物细胞工程技术领域，涉及到植物的遗传转化和植株再生，具体为一种辣椒高效遗传转化及植株再生的方法。

背景技术：

辣椒是一种重要的蔬菜和工业原料作物，遗传转化体系的建立是其基因工程遗传改良和功能基因组学研究的重要基础，而要进行辣椒的遗传转化，建立高效离体再生系统是重要条件之一。目前辣椒的遗传转化体系和离体再生系统还不完善，限制了基因工程在辣椒遗传改良上的有效应用和辣椒功能基因组学研究的进展。目前植物的植株再生主要通过幼苗外植体器官再生、花药培养和原生质体培养三条途径，其中通过原生质体培养来获得再生植株是植物组培苗工厂化生产和遗传转化的重要方法。

对于辣椒的植株再生，一般通过外植体直接分化成苗、脱分化形成愈伤组织并再分化成苗、Flamingo bill成苗三种方式进行。其中，以幼苗子叶、茎尖和胚轴为外植体的植株再生，是目前在建立辣椒离体再生系统中，研究的最多的一个领域，具体为，利用子叶、茎尖、胚轴等作为外植体经脱分化形成愈伤组织，通过农杆菌的介导将目的基因引入辣椒受体，再通过辣椒体细胞发生途径获得再生植株。但是目前这些辣椒植株再生技术还停留在芽诱导阶段，而对于芽的伸长、生根困难的问题长期难以解决，因而辣椒的遗传转化和离体再生难以真正实现并应用，限制了基因工程在辣椒遗传改良上的有效应用和辣椒功能基因组学研究的进展。

在辣椒的离体再生体系中，Flamingo bill外植体是一种将幼苗去掉茎尖和一片子叶的特殊的外植体，由单片子叶、下胚轴、胚根组成，其切口部位为顶端分生组织所在区域，细胞生长速度快，分化能力强，另外Flamingo bill外植体不同于一般外植体，其具有完整植株的特性，在组织培养中其根系能够吸收营养物质供应顶部分生组织的生长和分化，而一般的外植体在培养中只是靠细胞膨大所引起的被动吸收。然而经过反复试验得知，Flamingo bill外植体介导的辣椒植株再生依然存在很多的缺点：（1）同样受芽伸长困难的限制；（2）从flamingo bill外植体上切下的小苗生根困难；（3）Flamingo bill外植体在固体MS培养基中转移容易导致根部死亡；（3）农杆菌介导的遗传转化在筛选的的过程中容易使Flamingo bill的母体植株死亡；（4）根系易出现带菌污染而致死亡。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明公开一种辣椒高效遗传转化及植株再生的方法， 通过Flamingo bill外植体介导辣椒植株再生，该方法能够有效提高遗传转化率，使不定芽顺利伸长并生根，获得完整辣椒再生植株。

本发明所要解决的技术问题采用以下技术方案来实现：

辣椒高效遗传转化及植株再生的方法，包括以下步骤：

（1）载体构建：设计目标位点引物，并通过PCR扩增获得目标序列，将获得序列进行连接及筛选，并通过测序分析，获得最终正确的表达载体；

（2）转化农杆菌及扩繁备用：将表达载体转化LBA4404农杆菌，并扩繁备用；

（3）Flamingo bill外植体的制备及预培养：将MS固体培养基的PH调节为5.7～6.2后灭菌，PH值优选为5.8，把辣椒种子培养于MS固体培养基中，25～28℃，1600～2200 Lux光照下培养10～15天后得到辣椒无菌苗，取出辣椒无菌苗置于空培养皿中，在超净工作台中用消毒的镊子和手术刀切下茎尖及一侧子叶，留下和胚轴及根系相连的另一侧子叶即得Flamingo bill外植体，采用Flamingo bill外植体，可大大缩短辣椒遗传转化及植株再生的周期，将制得的Flamingo bill外植体置于液体的MS培养基中，将液体的MS培养基PH调节为5.7～6.2后灭菌，PH值优选为5.8，在25～28℃、1600～2200 Lux光照下下预培养1～2天；

（4）侵染转化及共培养：取吸光度OD为0.3的LBA4404农杆菌2ml于平皿中，把8mlMS液体培养基稀释5倍，并加入0.1mol/L的乙酰丁香酮后与平皿中的LBA4404农杆菌混合，得到侵染液，取出预培养好的Flamingo bill外植体放入侵染液中侵染，且所述侵染液只没过Flamingo bill外植体子叶及伤口部分，不接触下胚轴及根系部分，侵染20～30min，期间间歇轻摇，侵染完成后，将Flamingo bill外植体稍稍晾干水分即可将其转至共培养基，所述共培养基为液体MS基本培养基，预先将共培养基的PH调节为5.7～6.2后灭菌，PH值优选为5.8，在23℃黑暗条件下共培养3～4天；

（5）愈伤诱导、新茎尖形成及伸长：共培养结束后，用200mg/l的噻胞液洗菌，去除LBA4404农杆菌，并将共培养后的Flamingo bill外植体转至MS固体培养基中，且MS固体培养基PH为5.7～6.2，转移至MS固体培养基后，只让Flamingo bill外植体根系接触培养基，不让其他部分如子叶接触培养基，在25～28℃、1600～2200 Lux光照下培养14～20天，新生植株便会从Flamingo bill外植体伤口长出并伸长，期间只需要2～3周即可诱导新生苗的形成并伸长，与传统组培方式相比时间大大缩短；

（6）新生植株的切割及转移：当Flamingo bill外植体上的新生植株伸长至1.5～2.5cm时，将新生植株从其基部切割下，切割新生植株时连同切下一部分愈伤组织，并转移至生根培养基；

（7）生根及筛选：新生植株的生根采用生根培养法或嫁接法，其中，所述生根培养法即在基本MS固体培养基中添加0.5mg/L的NAA（萘乙酸），克服生根困难，获得完整植株，并且添加Basta（除草剂）作为筛选物，调节培养基的PH为5.7～6.2后灭菌，PH值优选为5.8，将带愈伤组织的新生植株转移至生根培养基中后，在25～28℃、1600～2200 Lux光照下培养12～16天并筛选即可获得完整再生植株；

所述嫁接法具体操作步骤如下：

a.选取成苗10～14天，生长健壮笔直的无菌辣椒植株作为嫁接母体备用；

b.选取Flamingo bill外植体上切下的已有茎尖、主茎及叶片的分化丛芽，切去多余叶片备用；

c.准备好含MS固体培养基的平皿及刚溶解好的添加有2倍琼脂粉的MS备用；

d.在无菌环境下，用无菌手术刀片将嫁接母体和分化丛芽的伤口切平整垂直，确保嫁接母体和分化丛芽在嫁接时伤口完全接触并保证后期长成一体后植株形态是直立的，然后将两者以伤口完全接触且半镶嵌于平皿中的MS固体培养基中，保持植株形态学上下端呈直线状态，使用2倍琼脂粉的MS培养基，进一步固定；

e.将平皿进行密封，保持直立的形态学方式培养于25～28℃垂直光照的环境下，每天14h光照，10h黑暗，每两天观察一次，确认伤口紧密连接并保持鲜活，如果伤口褐化则应取出切去褐化部分，重新嫁接，如遇芽或胚轴伸长使伤口错位，则取出重新调整固定连接，连续培养7～10天后，即可嫁接成功，嫁接成功的幼苗可直接移栽。

目前，关于辣椒幼苗外植体再生及Flamingo bill技术还停留在芽诱导部分，没有涉及芽的伸长、生根等辣椒植株再生的完整过程，使得培养的辣椒再生植株难以存活并继续生长发育，难以应用于农业生产和基因工程遗传改良及功能基因组学的研究。

申请人经分析认为，目前辣椒幼苗外植体再生及Flamingo bill技术之所以还停留在芽诱导阶段，主要原因在于外植体的选取、培养基类型和外界环境等条件存在缺陷和不足，因此，申请人从辣椒幼苗遗传转化和植株再生的各操作环节入手，仔细观察分析，做出各种假设、反复的试验并验证结论。

以往的Flamingo bill外植体在固体MS培养基中转移容易导致死亡，降低Flamingo bill外植体存活率。申请人前期通过对Flamingo bill外植体转移后的培养基营养组分、培养温度、光照等条件作出反复调整后仍无法降低其死亡率，经大量重复试验发现，Flamingo bill外植体转移后容易死亡的主要原因在于目前辣椒外植体再生培养采用的是固体培养基，在Flamingo bill外植体转移时固体培养基会对Flamingo bill外植体根部造成损伤，影响根系功能进而导致植株死亡。本发明的步骤（3）和（4）中预培养和共培养均在液体培养基中进行，避免Flamingo bill外植体在固体培养基中转移伤害根系，大大降低Flamingo bill外植体的死亡率。

在辣椒的植株再生中，很容易出现外植体或Flamingo bill外植体根系出现带菌污染而致死亡，目前在实际操作中多采用对培养基、器皿和外植体进行消毒灭菌，然而在外植体后期的培养中仍然会出现由于细菌污染而导致的死亡，且外植体在被侵染的同时难以避免被侵染液中杂菌污染，进而污染培养基造成外植体死亡。在本发明步骤（4）中，侵染液只没过Flamingo bill外植体子叶及伤口部分，不接触下胚轴及根系部分，大大减小由于根系带菌的染菌率，很大限度减少后期Flamingo bill外植体染菌死亡，提高侵染后Flamingo bill外植体存活率，进一步提高遗传转化效率。

在步骤（5）中，经共培养的Flamingo bill外植体转移至MS固体培养基后，只让Flamingo bill外植体根系接触培养基，不让其他部分如子叶接触培养基，以免植株生长畸形，影响不定芽的形成和伸长，提高植株再生率。

从flamingo bill外植体上切下的新生植株生根困难，因此现有的技术大多采用改变新生植株切下后的培养基以及改善培养条件来促进生根，但新生植株的生根依旧困难，由于生根困难因而局限了芽的伸长，最终新生植株死亡。本发明申请人起初也是对培养基进行改良并改善培养条件，效果十分不理想，在一次新生植株的切割中由于偶然将部分愈伤组织连同新生植株一同切下，经培养得到了生根并能够持续生长的完整再生植株，因此申请人认为新生植株带有愈伤组织切割的方式能够有效提高其根部的生发，并在多次重复试验后验证此结论，在本发明步骤（6）中，切割新生植株时连同底部的部分愈伤组织一同切下，愈伤组织具有很强的增生能力和分化能力，因此相比于以往直接切割幼苗而言大大提高了新生植株的生根存活率。

通过改进新生植株的切割方式大大提高了新生植株根部的生长率，然而根部形成后，其继续伸长效果不理够想，在步骤（7）中，申请人通过对生根培养基进一步改进，采用在基本MS固体培养基添加0.5mg/L的NAA，调节培养基的PH为5.7～6.2后灭菌，进一步促进了新生植株在生根培养基中根部的伸长发育。在方法二中通过嫁接使辣椒新生植株存活，由于嫁接母体为生长健壮且具有完整根系的辣椒植株，因此将新生植株嫁接于母体上，相比于以往的辣椒植株再生而言，有效提高了新生植株存活率。

申请人同时对筛选时间进行了改进，本发明对新生植株在Flamingo母体上时并不筛选，将筛选移至生根或嫁接成功后进行，可大大提高外植体存活率，获得了更多再生植株，提高了遗传转化效率。

综上所述，本发明经申请人大量反复的试验和筛选，通过改良或改变培养基、侵染方式、外植体切割方式、延迟筛选和改进生根方式，实现了辣椒的遗传转化和植株再生，获得完整的可供农业种植和科学研究的再生植株，且该辣椒高效遗传转化及植株再生的方法具有较高的遗传转化效率和植株再生率。

本发明与现有技术相比，具有如下的优点和有益效果：

（1）本发明采用Flamingo bill外植体，不受采样季节限制，可以长年进行辣椒组织培养及遗传转化，克服了现有技术的外植体取材时间上的制约，并克服了辣椒的再生周期长的问题，大大缩短了获得转基因辣椒后代的时间；

（2）本发明提供了一种完整有效的遗传转化体系，通过采用新的侵染方式、新生植株切割方式、新的筛选方式和新生植株生根方式，大大提高了辣椒的遗传转化率，促进芽的伸长和生根，从而获得完整可持续生长的再生植株。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明实施例的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明实施例的限定。在附图中：

图1为本发明Flamingo bill外植体的制备示意图；

图2为本发明实施例1中带有新茎尖的Flamingo bill外植体示意图；

图3为本发明实施例1中带有伸长新茎尖的Flamingo bill外植体示意图；

图4为本发明实施例1中带有新生植株的Flamingo bill外植体示意图；

图5为本发明实施例1中Flamingo bill外植体与新生植株连接处示意图；

图6为本发明实施例1中Flamingo bill外植体上切下的新生植株示意图；

图7为本发明实施例1中新生植株转移至生根培养基内示意图；

图8为本发明实施例1中新生植株生根培养示意图；

图9为本发明实施例1中新生植株长成再生植株后的根部示意图；

图10为本发明实施例1中新生植株长成再生植株后的俯视图；

图11为本发明实施例4中具有待嫁接新生植株的Flamingo bill外植体示意图；

图12为本发明实施例4中嫁接成功的嫁接苗示意图；

图13为本发明实施例4中嫁接苗移栽入土并存活示意图；

图14为本发明实施例7中带有新生植株的Flamingo bill外植体示意图；

图15为本发明实施例7中切下并培养的新生植株根部示意图；

图16为本发明实施例7中新生植株在生根培养基中的茎叶示意图。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面结合实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的示意性实施方式及其说明仅用于解释本发明，并不作为对本发明的限定。

实施例1

本实施例公开的方法是本发明的优选实施例。

辣椒高效遗传转化及植株再生的方法，包括以下步骤：

（1）载体构建：通过NCBI设计目的基因引物，并通过辣椒公共数据库比对筛选，合成目标基因上下游引物，KODFX（高保真PCR酶）扩增模板，胶回收，连接T载体，测序，若测序不正确则重新扩增连接测序，直至扩增序列完全正确，测序正确后，进行表达载体连接；

（2）连接反应完成后，取5ulPCR产物转化大肠杆菌，用含有Kan抗生素（卡那霉素）的LB（细菌基础培养基）板子涂板，挑单克隆摇菌检测，选择检测正确的摇菌提质粒，用质粒酶切或用基因引物进行质粒PCR检测，检测正确的送测序，将正确的最终表达载体保存于-20℃备用；

（3）转化农杆菌及扩繁备用：取1μg质粒转化LBA4404农杆菌，并检测是否成功，将转化成功的含目的基因和筛选基因的质粒的LBA4404农杆菌菌种，接种到含50 mg/LKan抗生素和50 mg/LRif抗生素（利福霉素）的YEB固体培养基上28℃暗培养3d直至长出单菌落，其中，所述筛选基因具体为Bar基因，再使用100 μL的枪头挑取单克隆接种到含有50 mg/L Kan抗生素和50 mg/L Rif抗生素的2 mL YEP液体培养基中，28℃、200 r/min避光振荡过夜培养，将成功活化后的LBA4404农杆菌液进行PCR检测，将阳性菌液即转LBA4404农杆菌后测序正确包含目的基因的单克隆菌液按1: 400的比例加入到400 mL 含50 mg/LKan抗生素和Rif抗生素的YEB液体培养基中，28℃、200 r/min 避光振荡大量扩繁，在分光光度计上设定波长为600nm测定菌液的OD值，当OD值为0.3停止培养，将此时的菌液在超净台中倒入已灭菌的50 mL离心管，3000 r/min离心10 min，去除上清液，加入等量的侵染液轻弹混匀后遮光待用；

（4）Flamingo bill外植体的制备及预培养：将MS固体培养基的PH调节为5.8后灭菌，本实施例采用遵辣1号辣椒种子，将遵辣1号辣椒种子培养于MS固体培养基中15天后得到辣椒无菌苗，如图1中A所示，取出辣椒无菌苗置于空培养皿中，在超净工作台中用消毒的镊子和手术刀切下茎尖及一侧子叶，如图1中B所示，留下和胚轴及根系相连的另一侧子叶即得Flamingo bill外植体，将制得的Flamingo bill外植体置于PH为5.8的液体MS培养基中，避免在固体培养基中转移易伤害根系且不易清除干净粘附的培养基，液体量以刚没过根部为宜，通常2～3ml，在28℃、2000Lux光照下预培养2天；

（5）侵染转化及共培养：把预培养好的Flamingo bill外植体放入空的平皿中，每皿5个，取OD为0.3的LBA4404农杆菌2ml于平皿中，把8mlMS液体培养基稀释5倍，并加入0.1mol/L的乙酰丁香酮后与平皿中的LBA4404农杆菌混合，得到侵染液，加入侵染液并刚好没过Flamingo bill外植体子叶及伤口部分，不接触下胚轴及根系部分，侵染30min，期间歇轻摇，侵染完成后，将Flamingo bill外植体稍稍晾干水分即可将其转至共培养基，共培养基为液体MS基本培养基，避免在固体培养基中转移易伤害根系并不易清除干净粘附的培养基，且该液体MS基本培养基为PH为5.8的无菌培养基，Flamingo bill外植体在23℃黑暗条件下共培养3天；

（6）愈伤诱导及、新茎尖形成及伸长：共培养结束后，用200mg/l的噻胞洗菌，然后将Flamingo bill外植体转至MS固体培养基中，该MS固体培养基是PH为5.8的无菌培养基，转移至新培养基后，只让植株根系接触培养基，不让其他部分如子叶接触培养基，以免植株生长畸形，在28℃、2000 Lux光照下培养20天，如图2～3所示，新生植株便会从Flamingo bill外植体伤口长出并伸长；

（7）新生植株的切割及转移：如图4所示，培养20天后，Flamingo bill外植体上的新生植株伸长至2.5cm，将新生植株从其基部切割下，如图5～6所示切割新生植株时连同切下一部分愈伤组织，并转移至新的培养基，当新生植株在Flamingo母体上时并不筛选，而是延迟至生根时再筛选，更能够提高存活率；

（8）生根及筛选：生根培养基为基本MS固体培养基添加0.5mg/L的NAA，并且添加Basta作为筛选物，调节培养基的PH为5.8后灭菌，即得生根培养基，如图7所示，将带愈伤组织的新生植株转移至生根培养基中，如图8所示，在28℃、2000 Lux光照下培养8天后所有新生植株长出根系，茎叶伸长，继续培养至第14天获得如图9～10所示完整的再生植株，再生植株的根系和茎叶进一步发育、伸长，具有较高的生命力，筛选后即可将健壮的再生植株进行移栽。

实施例2

辣椒高效遗传转化及植株再生的方法，包括以下步骤：

（1）载体构建：通过NCBI设计目的基因引物，并通过辣椒公共数据库比对筛选，合成目标基因上下游引物，KODFX扩增模板，胶回收，连接T载体，测序，若测序不正确则重新扩增连接测序，直至扩增序列完全正确，测序正确后，进行表达载体连接；

（2）连接反应完成后，取5ulPCR产物转化大肠杆菌，用含有Kan抗生素的LB板子涂板，挑单克隆摇菌检测，选择检测正确的摇菌提质粒，用质粒酶切或用基因引物进行质粒PCR检测，检测正确的送测序，将正确的最终表达载体保存于-20℃备用；

（3）转化农杆菌及扩繁备用：取1μg质粒转化LBA4404农杆菌，并检测是否成功，将转化成功的含目的基因和筛选基因的质粒的LBA4404农杆菌菌种，接种到含50 mg/LKan抗生素和Rif抗生素的YEB固体培养基上28℃暗培养2d直至长出单菌落，其中，所述筛选基因具体为Bar基因，再使用100 μL的枪头挑取单克隆接种到含有50 mg/L Kan抗生素和50 mg/L Rif抗生素的2 mL YEP液体培养基中，28℃、200 r/min避光振荡过夜培养，将成功活化后的LBA4404农杆菌液进行PCR检测，将阳性菌液按1: 400的比例加入到400 mL 含50 mg/LKan抗生素和Rif抗生素的YEB液体培养基中，28℃、200 r/min 避光振荡大量扩繁，在分光光度计上设定波长为600nm测定菌液的OD值，当OD值为0.3停止培养，将此时的菌液在超净台中倒入已灭菌的50 mL离心管，3000 r/min离心10 min，去除上清液，加入等量的侵染液轻弹混匀后遮光待用；

（4）Flamingo bill外植体的制备及预培养：将MS固体培养基的PH调节为5.7后灭菌，把辣椒种子培养于MS固体培养基中10天后得到辣椒无菌苗，取出辣椒无菌苗置于空培养皿中，在超净工作台中用消毒的镊子和手术刀切下茎尖及一侧子叶，留下和胚轴及根系相连的另一侧子叶即得Flamingo bill外植体，将制得的Flamingo bill外植体置于PH为5.7的液体MS培养基中，避免在固体培养基中转移易伤害根系且不易清除干净粘附的培养基，液体量以刚没过根部为宜，通常2～3ml，在25℃、1600Lux光照下预培养1天；

（5）侵染转化及共培养：把预培养好的Flamingo bill外植体放入空的平皿中，每皿3个，取OD为0.3的LBA4404农杆菌2ml于平皿中，把8mlMS液体培养基稀释5倍，并加入0.1mol/L的乙酰丁香酮后与平皿中的LBA4404农杆菌混合，得到侵染液，加入侵染液并刚好没过Flamingo bill外植体子叶及伤口部分，不接触下胚轴及根系部分，侵染20min，期间歇轻摇，侵染完成后，将Flamingo bill外植体稍稍晾干水分即可将其转至共培养基，共培养基为液体MS基本培养基，避免在固体培养基中转移易伤害根系并不易清除干净粘附的培养基，且该液体MS基本培养基为PH为5.7的无菌培养基，Flamingo bill外植体在23℃黑暗条件下共培养4天；

（6）愈伤诱导及、新茎尖形成及伸长：共培养结束后，用200mg/l的噻胞洗菌，然后将Flamingo bill外植体转至MS固体培养基中，该MS固体培养基是PH为5.7的无菌培养基，转移至新培养基后，只让植株根系接触培养基，不让其他部分如子叶接触培养基，以免植株生长畸形，在25℃、1600Lux光照下培养14天，新生植株便会从Flamingo bill外植体伤口长出并伸长；

（7）新生植株的切割及转移：培养14天后，Flamingo bill外植体上的新生植株伸长至1.6cm，将新生植株从其基部切割下，切割新生植株时连同切下一部分愈伤组织，并转移至新的培养基，当新生植株在Flamingo母体上时并不筛选，而是延迟至生根时再筛选，更能够提高存活率；

（8）生根及筛选：生根培养基为基本MS固体培养基添加0.5mg/L的NAA，并且添加Basta作为筛选物，调节培养基的PH为5.7后灭菌，即得生根培养基，将带愈伤组织的新生植株转移至生根培养基中后，在25℃、1600Lux光照下培养12天后获得完整的再生植株。随后进入筛选，在生根筛选的过程中，可见一小部分植株接触培养基的伤口变褐，不能产生分生组织，再生为根，而其余植株的伤口则保持新鲜的白色，并不断增生，分化产生根系，最终形成完整再生植株。

实施例3

辣椒高效遗传转化及植株再生的方法，包括以下步骤：

（1）载体构建：通过NCBI设计目的基因引物，并通过辣椒公共数据库比对筛选，合成目标基因上下游引物，KODFX扩增模板，胶回收，连接T载体，测序，若测序不正确则重新扩增连接测序，直至扩增序列完全正确，测序正确后，进行表达载体连接；

（2）连接反应完成后，取5ulPCR产物转化大肠杆菌，用含有Kan抗生素的LB板子涂板，挑单克隆摇菌检测，选择检测正确的摇菌提质粒，用质粒酶切或用基因引物进行质粒PCR检测，检测正确的送测序，将正确的最终表达载体保存于-20℃备用；

（3）转化农杆菌及扩繁备用：取1μg质粒转化LBA4404农杆菌，并检测是否成功，将转化成功的含目的基因和筛选基因（Bar）的质粒的LBA4404农杆菌菌种，接种到含50 mg/LKan抗生素和Rif抗生素的YEB固体培养基上28℃暗培养3d直至长出单菌落，其中，所述筛选基因具体为Bar基因，再使用100 μL的枪头挑取单克隆接种到含有50 mg/L Kan抗生素和50 mg/L Rif抗生素的2 mL YEP液体培养基中，28℃、200 r/min避光振荡过夜培养，将成功活化后的LBA4404农杆菌液进行PCR检测，将阳性菌液按1: 400的比例加入到400 mL 含50 mg/LKan抗生素和Rif抗生素的YEB液体培养基中，28℃、200 r/min 避光振荡大量扩繁，在分光光度计上设定波长为600nm测定菌液的OD值，当OD值为0.3停止培养，将此时的菌液在超净台中倒入已灭菌的50 mL离心管，3000 r/min离心10 min，去除上清液，加入等量的侵染液轻弹混匀后遮光待用；

（4）Flamingo bill外植体的制备及预培养：将MS固体培养基的PH调节为6.2后灭菌，把辣椒种子培养于MS固体培养基中13天后得到辣椒无菌苗，取出辣椒无菌苗置于空培养皿中，在超净工作台中用消毒的镊子和手术刀切下茎尖及一侧子叶，留下和胚轴及根系相连的另一侧子叶即得Flamingo bill外植体，将制得的Flamingo bill外植体置于PH为6.2的液体MS培养基中，避免在固体培养基中转移易伤害根系且不易清除干净粘附的培养基，液体量以刚没过根部为宜，在27℃、2200 Lux光照下预培养2天；

（5）侵染转化及共培养：把预培养好的Flamingo bill外植体放入空的平皿中，每皿7个，取OD为0.3的LBA4404农杆菌2ml于平皿中，把8mlMS液体培养基稀释5倍，并加入0.1mol/L的乙酰丁香酮后与平皿中的LBA4404农杆菌混合，得到侵染液，加入侵染液并刚好没过Flamingo bill外植体子叶及伤口部分，不接触下胚轴及根系部分，侵染25min，期间歇轻摇，侵染完成后，将Flamingo bill外植体稍稍晾干水分即可将其转至共培养基，共培养基为液体MS基本培养基，避免在固体培养基中转移易伤害根系并不易清除干净粘附的培养基，且该液体MS基本培养基为PH为6.2的无菌培养基，Flamingo bill外植体在23℃黑暗条件下共培养3天；

（6）愈伤诱导及、新茎尖形成及伸长：共培养结束后，用200mg/l的噻胞洗菌，然后将Flamingo bill外植体转至MS固体培养基中，该MS固体培养基是PH为6.2的无菌培养基，转移至新培养基后，只让植株根系接触培养基，不让其他部分如子叶接触培养基，以免植株生长畸形，在27℃、2200 Lux光照下培养17天，新生植株便会从Flamingo bill外植体伤口长出并伸长；

（7）新生植株的切割及转移：培养17天后，Flamingo bill外植体上的新生植株伸长至2.1cm，将新生植株从其基部切割下，切割新生植株时连同切下一部分愈伤组织，并转移至新的培养基，当新生植株在Flamingo母体上时并不筛选，而是延迟至生根时再筛选，更能够提高存活率；

（8）生根及筛选：生根培养基为基本MS固体培养基添加0.5mg/L的NAA，并且添加Basta作为筛选物，调节培养基的PH为6.2后灭菌，即得生根培养基，将带愈伤组织的新生植株转移至生根培养基中后，在27℃、2200 Lux光照下培养，新生植株在生根培养中根系逐渐长出并伸长，顶部逐步伸长发育成茎和叶，15天后新生植株基本发育为完整健壮的再生植株，再进一步筛选健壮植株移栽。

实施例4

辣椒高效遗传转化及植株再生的方法，包括以下步骤：

（1）载体构建：通过NCBI设计目的基因引物，并通过辣椒公共数据库比对筛选，合成目标基因上下游引物，KODFX扩增模板，胶回收，连接T载体，测序，若测序不正确则重新扩增连接测序，直至扩增序列完全正确，测序正确后，进行表达载体连接；

（2）连接反应完成后，取5ulPCR产物转化大肠杆菌，用含有Kan抗生素的LB板子涂板，挑单克隆摇菌检测，选择检测正确的摇菌提质粒，用质粒酶切或用基因引物进行质粒PCR检测，检测正确的送测序，将正确的最终表达载体保存于-20℃备用；

（3）转化农杆菌及扩繁备用：取1μg质粒转化LBA4404农杆菌，并检测是否成功，将转化成功的含目的基因和筛选基因（Bar）的质粒的LBA4404农杆菌菌种，接种到含50 mg/LKan抗生素和Rif抗生素的YEB固体培养基上28℃暗培养3d直至长出单菌落，其中，所述筛选基因具体为Bar基因，再使用100 μL的枪头挑取单克隆接种到含有50 mg/L Kan抗生素和50 mg/L Rif抗生素的2 mL YEP液体培养基中，28℃、200 r/min避光振荡过夜培养，将成功活化后的LBA4404农杆菌液进行PCR检测，将阳性菌液按1: 400的比例加入到400 mL 含50 mg/LKan抗生素和Rif抗生素的YEB液体培养基中，28℃、200 r/min 避光振荡大量扩繁，在分光光度计上设定波长为600nm测定菌液的OD值，当OD值为0.3停止培养，将此时的菌液在超净台中倒入已灭菌的50 mL离心管，3000 r/min离心10 min，去除上清液，加入等量的侵染液轻弹混匀后遮光待用；

（4）Flamingo bill外植体的制备及预培养：将MS固体培养基的PH调节为5.8后灭菌，本实施例采用遵辣1号辣椒种子，将遵辣1号辣椒种子培养于MS固体培养基中15天后得到辣椒无菌苗，取出辣椒无菌苗置于空培养皿中，在超净工作台中用消毒的镊子和手术刀切下茎尖及一侧子叶，留下和胚轴及根系相连的另一侧子叶即得Flamingo bill外植体，将制得的Flamingo bill外植体置于PH为5.8的液体MS培养基中，避免在固体培养基中转移易伤害根系且不易清除干净粘附的培养基，液体量以刚没过根部为宜，在28℃、2000Lux光照下预培养2天；

（5）侵染转化及共培养：把预培养好的Flamingo bill外植体放入空的平皿中，每皿5个，取OD为0.3的LBA4404农杆菌2ml于平皿中，把8mlMS液体培养基稀释5倍，并加入0.1mol/L的乙酰丁香酮后与平皿中的LBA4404农杆菌混合，得到侵染液，加入侵染液并刚好没过Flamingo bill外植体子叶及伤口部分，不接触下胚轴及根系部分，侵染30min，期间歇轻摇，侵染完成后，将Flamingo bill外植体稍稍晾干水分即可将其转至共培养基，共培养基为液体MS基本培养基，避免在固体培养基中转移易伤害根系并不易清除干净粘附的培养基，且该液体MS基本培养基为PH为5.8的无菌培养基，Flamingo bill外植体在23℃黑暗条件下共培养3天；

（6）愈伤诱导及、新茎尖形成及伸长：共培养结束后，用200mg/l的噻胞洗菌，然后将Flamingo bill外植体转至MS固体培养基中，该MS固体培养基是PH为5.8的无菌培养基，转移至新培养基后，只让植株根系接触培养基，不让其他部分如子叶接触培养基，以免植株生长畸形，在28℃、2000 Lux光照下培养20天，新生植株便会从Flamingo bill外植体伤口长出并伸长；

（7）新生植株的切割及转移：如图11所示，培养20天后，Flamingo bill外植体上的新生植株伸长至2.3cm，将新生植株从其基部切割下；

（8）生根及筛选：使用嫁接方式获得完整植株，从Flamingo bill上切下幼苗后，通过嫁接法也能有效克服生根困难，具体如下：

a.选取成苗10天，生长健壮笔直的无菌辣椒植株作为嫁接母体备用；

b.选取Flamingo bill外植体上切下的已有茎尖、主茎及叶片的分化丛芽，切去多余叶片备用；

c.准备好含MS固体培养基的平皿及刚溶解好的添加有2倍琼脂粉的MS培养基备用；

d.在无菌环境下，用无菌手术刀片将嫁接母体和分化丛芽的伤口切平整垂直，将两者以伤口完全接触且半镶嵌于平皿中的MS固体培养基中，保持植株形态学上下端呈直线状态，使用2倍琼脂粉的MS培养基，进一步固定；

e.将平皿进行密封，保持直立的形态学方式培养于25℃垂直光照的环境下，每天14h光照，10h黑暗，每两天观察一次，确认伤口紧密连接并保持鲜活，连续培养至第10天，如图12所示，分化丛芽嫁接成功，继续培养10天，即当嫁接成功的嫁接苗生长至足够健壮时，将其直接移栽在土壤中，如图13所示，辣椒的嫁接苗在土壤中顺利存活并生长良好。

实施例5

辣椒高效遗传转化及植株再生的方法，包括以下步骤：

（1）载体构建：通过NCBI设计目的基因引物，并通过辣椒公共数据库比对筛选，合成目标基因上下游引物，KODFX扩增模板，胶回收，连接T载体，测序，若测序不正确则重新扩增连接测序，直至扩增序列完全正确，测序正确后，进行表达载体连接；

（2）连接反应完成后，取5ulPCR产物转化大肠杆菌，用含有Kan抗生素的LB板子涂板，挑单克隆摇菌检测，选择检测正确的摇菌提质粒，用质粒酶切或用基因引物进行质粒PCR检测，检测正确的送测序，将正确的最终表达载体保存于-20℃备用；

（3）转化农杆菌及扩繁备用：取1μg质粒转化LBA4404农杆菌，并检测是否成功，将转化成功的含目的基因和筛选基因（Bar）的质粒的LBA4404农杆菌菌种，接种到含50 mg/LKan抗生素和Rif抗生素的YEB固体培养基上28℃暗培养2d直至长出单菌落，其中，所述筛选基因具体为Bar基因，再使用100 μL的枪头挑取单克隆接种到含有50 mg/L Kan抗生素和50 mg/L Rif抗生素的2 mL YEP液体培养基中，28℃、200 r/min避光振荡过夜培养，将成功活化后的LBA4404农杆菌液进行PCR检测，将阳性菌液按1: 400的比例加入到400 mL 含50 mg/LKan抗生素和Rif抗生素的YEB液体培养基中，28℃、200 r/min 避光振荡大量扩繁，在分光光度计上设定波长为600nm测定菌液的OD值，当OD值为0.3停止培养，将此时的菌液在超净台中倒入已灭菌的50 mL离心管，3000 r/min离心10 min，去除上清液，加入等量的侵染液轻弹混匀后遮光待用；

（4）Flamingo bill外植体的制备及预培养：将MS固体培养基的PH调节为5.7后灭菌，把辣椒种子培养于MS固体培养基中10天后得到辣椒无菌苗，取出辣椒无菌苗置于空培养皿中，在超净工作台中用消毒的镊子和手术刀切下茎尖及一侧子叶，留下和胚轴及根系相连的另一侧子叶即得Flamingo bill外植体，将制得的Flamingo bill外植体置于PH为5.7的液体MS培养基中，避免在固体培养基中转移易伤害根系且不易清除干净粘附的培养基，液体量以刚没过根部为宜，在25℃、1600Lux光照下预培养1天；

（5）侵染转化及共培养：把预培养好的Flamingo bill外植体放入空的平皿中，每皿3个，取OD为0.3的LBA4404农杆菌2ml于平皿中，把8mlMS液体培养基稀释5倍，并加入0.1mol/L的乙酰丁香酮后与平皿中的LBA4404农杆菌混合，得到侵染液，加入侵染液并刚好没过Flamingo bill外植体子叶及伤口部分，不接触下胚轴及根系部分，侵染20min，期间歇轻摇，侵染完成后，将Flamingo bill外植体稍稍晾干水分即可将其转至共培养基，共培养基为液体MS基本培养基，避免在固体培养基中转移易伤害根系并不易清除干净粘附的培养基，且该液体MS基本培养基为PH为5.7的无菌培养基，Flamingo bill外植体在23℃黑暗条件下共培养4天；

（6）愈伤诱导及、新茎尖形成及伸长：共培养结束后，用200mg/l的噻胞洗菌，然后将Flamingo bill外植体转至MS固体培养基中，该MS固体培养基是PH为5.7的无菌培养基，转移至新培养基后，只让植株根系接触培养基，不让其他部分如子叶接触培养基，以免植株生长畸形，在25℃、1600Lux光照下培养14天，新生植株便会从Flamingo bill外植体伤口长出并伸长；

（7）新生植株的切割及转移：培养14天后，Flamingo bill外植体上的新生植株伸长至1.5cm，将新生植株从其基部切割下；

（8）生根及筛选：使用嫁接方式获得完整植株，从Flamingo bill上切下幼苗后，通过嫁接法也能有效克服生根困难，具体如下：

a.选取成苗14天，生长健壮笔直的无菌辣椒植株作为嫁接母体备用；

b.选取Flamingo bill外植体上切下的已有茎尖、主茎及叶片的分化丛芽，切去多余叶片备用；

c.准备好含MS固体培养基的平皿及刚溶解好的添加有2倍琼脂粉的MS培养基备用；

d.在无菌环境下，用无菌手术刀片将嫁接母体和分化丛芽的伤口切平整垂直，将两者以伤口完全接触且半镶嵌于平皿中的MS固体培养基中，保持植株形态学上下端呈直线状态，使用2倍琼脂粉的MS培养基，进一步固定；

e.将平皿进行密封，保持直立的形态学方式培养于28℃垂直光照的环境下，每天14h光照，10h黑暗，每两天观察一次，确认伤口紧密连接并保持鲜活，如果伤口褐化则应取出切去褐化部分，重新嫁接，如遇芽或胚轴伸长使伤口错位，则取出重新调整固定连接，在连续培养10天后，有60%的分化丛芽嫁接成功，嫁接成功的嫁接苗可筛选后直接移栽。

实施例6

辣椒高效遗传转化及植株再生的方法，包括以下步骤：

（1）载体构建：通过NCBI设计目的基因引物，并通过辣椒公共数据库比对筛选，合成目标基因上下游引物，KODFX扩增模板，胶回收，连接T载体，测序，若测序不正确则重新扩增连接测序，直至扩增序列完全正确，测序正确后，进行表达载体连接；

（2）连接反应完成后，取5ulPCR产物转化大肠杆菌，用含有Kan抗生素的LB板子涂板，挑单克隆摇菌检测，选择检测正确的摇菌提质粒，用质粒酶切或用基因引物进行质粒PCR检测，检测正确的送测序，将正确的最终表达载体保存于-20℃备用；

（3）转化农杆菌及扩繁备用：取1μg质粒转化LBA4404农杆菌，并检测是否成功，将转化成功的含目的基因和筛选基因（Bar）的质粒的LBA4404农杆菌菌种，接种到含50 mg/LKan抗生素和Rif抗生素的YEB固体培养基上28℃暗培养3d直至长出单菌落，其中，所述筛选基因具体为Bar基因，再使用100 μL的枪头挑取单克隆接种到含有50 mg/L Kan抗生素和50 mg/L Rif抗生素的2 mL YEP液体培养基中，28℃、200 r/min避光振荡过夜培养，将成功活化后的LBA4404农杆菌液进行PCR检测，将阳性菌液按1: 400的比例加入到400 mL 含50 mg/LKan抗生素和Rif抗生素的YEB液体培养基中，28℃、200 r/min 避光振荡大量扩繁，在分光光度计上设定波长为600nm测定菌液的OD值，当OD值为0.3停止培养，将此时的菌液在超净台中倒入已灭菌的50 mL离心管，3000 r/min离心10 min，去除上清液，加入等量的侵染液轻弹混匀后遮光待用；

（4）Flamingo bill外植体的制备及预培养：将MS固体培养基的PH调节为6.2后灭菌，把辣椒种子培养于MS固体培养基中13天后得到辣椒无菌苗，取出辣椒无菌苗置于空培养皿中，在超净工作台中用消毒的镊子和手术刀切下茎尖及一侧子叶，留下和胚轴及根系相连的另一侧子叶即得Flamingo bill外植体，将制得的Flamingo bill外植体置于PH为6.2的液体MS培养基中，避免在固体培养基中转移易伤害根系且不易清除干净粘附的培养基，液体量以刚没过根部为宜，在27℃、2200 Lux光照下预培养2天；

（5）侵染转化及共培养：把预培养好的Flamingo bill外植体放入空的平皿中，每皿7个，取OD为0.3的LBA4404农杆菌2ml于平皿中，把8mlMS液体培养基稀释5倍，并加入0.1mol/L的乙酰丁香酮后与平皿中的LBA4404农杆菌混合，得到侵染液，加入侵染液并刚好没过Flamingo bill外植体子叶及伤口部分，不接触下胚轴及根系部分，侵染25min，期间歇轻摇，侵染完成后，将Flamingo bill外植体稍稍晾干水分即可将其转至共培养基，共培养基为液体MS基本培养基，避免在固体培养基中转移易伤害根系并不易清除干净粘附的培养基，且该液体MS基本培养基为PH为6.2的无菌培养基，Flamingo bill外植体在23℃黑暗条件下共培养3天；

（6）愈伤诱导及、新茎尖形成及伸长：共培养结束后，用200mg/l的噻胞洗菌，然后将Flamingo bill外植体转至MS固体培养基中，该MS固体培养基是PH为6.2的无菌培养基，转移至新培养基后，只让植株根系接触培养基，不让其他部分如子叶接触培养基，以免植株生长畸形，在27℃、2200 Lux光照下培养17天，新生植株便会从Flamingo bill外植体伤口长出并伸长；

（7）新生植株的切割及转移：培养17天后，Flamingo bill外植体上的新生植株伸长至2.2cm，将新生植株从其基部切割下；

（8）生根及筛选：使用嫁接方式获得完整植株，从Flamingo bill上切下幼苗后，通过嫁接法也能有效克服生根困难，具体如下：

a.选取成苗12天，生长健壮笔直的无菌辣椒植株作为嫁接母体备用；

b.选取Flamingo bill外植体上切下的已有茎尖、主茎及叶片的分化丛芽，切去多余叶片备用；

c.准备好含MS固体培养基的平皿及刚溶解好的添加有2倍琼脂粉的MS培养基备用；

d.在无菌环境下，用无菌手术刀片将嫁接母体和分化丛芽的伤口切平整垂直，将两者以伤口完全接触且半镶嵌于平皿中的MS固体培养基中，保持植株形态学上下端呈直线状态，使用2倍琼脂粉的MS培养基，进一步固定；

e.将平皿进行密封，保持直立的形态学方式培养于26℃垂直光照的环境下，每天14h光照，10h黑暗，每两天观察一次，确认伤口紧密连接并保持鲜活，如果伤口褐化则应取出切去褐化部分，重新嫁接，如遇芽或胚轴伸长使伤口错位，则取出重新调整固定连接，在连续培养7天后，嫁接成功，嫁接成功的嫁接苗筛选后可直接移栽。

实施例7

辣椒高效遗传转化及植株再生的方法，包括以下步骤：

（1）载体构建：通过NCBI设计目的基因引物，并通过辣椒公共数据库比对筛选，合成目标基因上下游引物，KODFX扩增模板，胶回收，连接T载体，测序，若测序不正确则重新扩增连接测序，直至扩增序列完全正确，测序正确后，进行表达载体连接；

（2）连接反应完成后，取5ulPCR产物转化大肠杆菌，用含有Kan抗生素的LB板子涂板，挑单克隆摇菌检测，选择检测正确的摇菌提质粒，用质粒酶切或用基因引物进行质粒PCR检测，检测正确的送测序，将正确的最终表达载体保存于-20℃备用；

（3）转化农杆菌及扩繁备用：取1μg质粒转化LBA4404农杆菌，并检测是否成功，将转化成功的含目的基因和筛选基因的质粒的LBA4404农杆菌菌种，接种到含50 mg/LKan抗生素和Rif抗生素的YEB固体培养基上28℃暗培养3d直至长出单菌落，其中，所述筛选基因具体为Bar基因，再使用100 μL的枪头挑取单克隆接种到含有50 mg/L Kan抗生素和50 mg/L Rif抗生素的2 mL YEP液体培养基中，28℃、200 r/min避光振荡过夜培养，将成功活化后的LBA4404农杆菌液进行PCR检测，将阳性菌液按1: 400的比例加入到400 mL 含50 mg/LKan抗生素和Rif抗生素的YEB液体培养基中，28℃、200 r/min 避光振荡大量扩繁，在分光光度计上设定波长为600nm测定菌液的OD值，当OD值为0.3停止培养，将此时的菌液在超净台中倒入已灭菌的50 mL离心管，3000 r/min离心10 min，去除上清液，加入等量的侵染液轻弹混匀后遮光待用；

（4）Flamingo bill外植体的制备及预培养：将MS固体培养基的PH调节为5.8后灭菌，本实施例采用遵辣1号辣椒种子，将遵辣1号辣椒种子培养于MS固体培养基中15天后得到辣椒无菌苗，取出辣椒无菌苗置于空培养皿中，在超净工作台中用消毒的镊子和手术刀切下茎尖及一侧子叶，留下和胚轴及根系相连的另一侧子叶即得Flamingo bill外植体，将制得的Flamingo bill外植体置于PH为5.8的液体MS培养基中，避免在固体培养基中转移易伤害根系且不易清除干净粘附的培养基，液体量以刚没过根部为宜，通常2～3ml，在28℃、2000Lux光照下预培养2天；

（5）侵染转化及共培养：把预培养好的Flamingo bill外植体放入空的平皿中，每皿5个，取OD为0.3的LBA4404农杆菌2ml于平皿中，把8mlMS液体培养基稀释5倍，并加入0.1mol/L的乙酰丁香酮后与平皿中的LBA4404农杆菌混合，得到侵染液，加入侵染液并刚好没过Flamingo bill外植体子叶及伤口部分，不接触下胚轴及根系部分，侵染30min，期间歇轻摇，侵染完成后，将Flamingo bill外植体稍稍晾干水分即可将其转至共培养基，共培养基为液体MS基本培养基，避免在固体培养基中转移易伤害根系并不易清除干净粘附的培养基，且该液体MS基本培养基为PH为5.8的无菌培养基，Flamingo bill外植体在23℃黑暗条件下共培养3天；

（6）愈伤诱导及、新茎尖形成及伸长：共培养结束后，用200mg/l的噻胞洗菌，然后将Flamingo bill外植体转至MS固体培养基中，该MS固体培养基是PH为5.8的无菌培养基，转移至新培养基后，只让植株根系接触培养基，不让其他部分如子叶接触培养基，以免植株生长畸形，在28℃、2000 Lux光照下培养20天，新生植株便会从Flamingo bill外植体伤口长出并伸长；

（7）新生植株的切割及转移：如图14所示，培养20天后，Flamingo bill外植体上的新生植株伸长至2.5cm，将新生植株从其基部切割下，切割新生植株时不附带切下愈伤组织，转移至新的培养基，当新生植株在Flamingo母体上时并不筛选；

（8）生根及筛选：生根培养基是PH为6.2的无菌MS固体培养基，并且添加有Basta作为筛选物，将新生植株转移至生根培养基中后，在28℃、2000 Lux光照下培养，经过一周的持续观察发现，绝大部分新生植株的伤口处变褐，并不生根，只有极少数新生植株根部膨大有根系长出，如图15所示，但根部颜色为深褐色，继续培养6天，如图16所示，长出根系的新生植株全部死亡，其根系颜色加深并不再伸长，叶片逐步枯萎，最终死亡，辣椒遗传转化及植株再生失败。

综上，本发明通过改良或改变培养基、侵染方式、外植体切割方式、延迟筛选和改进生根方式，实现了辣椒的遗传转化和植株再生，获得完整的可供农业种植和科学研究的再生植株，并有效提高辣椒遗传转化及植株再生的效率。

以上所述的具体实施方式，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，所应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施方式而已，并不用于限定本发明的保护范围，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。