本发明涉及一种育种方法，尤其涉及一种基于抗粗缩病玉米的育种方法，属于现代农业高新技术领域。
背景技术：
玉米在我国的栽培历史悠久，是重要的粮食和饲料作物，具有产量高、耐储存、再生产价值高的特点，但随着气候变暖、耕作制度改变和单一品种大面积种植等多重逆境因素引发或加重玉米作物的病虫害，严重影响了玉米的稳产性。
玉米粗缩病是在全国范围内严重危害玉米稳产的病毒病。玉米感病后呈现系统侵染，生长发育受阻，主要由灰飞虱以持久性方式传播的玉米粗缩病毒或者玉米黑条矮缩病毒引起。无毒灰飞虱在感染了RBSDV的植株上吸汁获毒，获毒时间一般为24-48h，最短lh，无毒虫一经带毒后能终身传毒，不经卵传染，毒虫多数为短期间歇传毒。
防治玉米粗缩病的传统方法是切断其传播途径，利用杀虫剂对灰飞虱进行防治是防治该病害的有效方法。但目前生产上广泛使用的农药只针对灰飞虱，植株一旦染病就没有十分有效的防治措施，其效果有限；随着这些杀虫剂的使用年限增加，昆虫对杀虫剂产生了高抗药性；而且杀虫剂的使用不可避免地对环境造成污染和破坏。生产过程中还有通过改进栽培技术条件对玉米粗缩病进行防治的措施，但收效甚微。
现有技术在玉米生产上对玉米粗缩病的防治对策在一定程度上增加了玉米生产的成本，并且加重了环境压力。
现有技术防治玉米粗缩病最为有效的方法是选用抗病性的玉米品种，培育玉米粗缩病抗性品种的方法通常有两种：常规育种和分子技术育种。
常规育种的周期很长，培育出一个玉米粗缩病抗性品种往往需要6～8年的时间，而又由于粗缩病病毒生理小种遗传的复杂性和致病性的多样性使得病菌群体的毒力基因的组成发生变化，往往选育的抗性品种在推广3～5年后即产生能侵染该品种的优势小种，最终导致新品种的抗性丧失。常规育种消耗时间长，尤其随着粗缩病病毒突变频率的增加，新品种育成的速度已经跟不上粗缩病病毒的突变速度。
转基因育种与分子标记辅助选择等分子技术育种是目前农业发展的新方向，对特定优良主栽品种进行粗缩病抗病基因和其他优良基因的转基因育种是一种可选方案，但由于目前转基因育种被抵制，且转基因育种和分子标记辅助选择育种首先需要基因定位，同样需要大田多世代的杂交回交，周期也较长，分子技术育种还存在费用高、技术门槛高的问题，难以被一般育种者所掌握。
技术实现要素：
基于现有技术的缺陷，本发明提供一种抗粗缩病玉米的育种方法，能够将粗缩病抗性基因高效而专一地渗入到本地优质玉米品种中。
本发明涉及的抗粗缩病玉米的育种方法所需种子材料包括，第一粗缩病抗性玉米材料、第二粗缩病抗性玉米材料以及玉米育种主干品系材料。
所述玉米育种主干品系材料为产量高、米质好、易感粗缩病的种系，所述第一粗缩病抗性玉米材料和第二粗缩病抗性玉米材料为高抗粗缩病、不高产、在产地不适宜大规模推广的种系。
玉米育种主干品系材料优选为郑单958，所述第一粗缩病抗性玉米材料优选为登海3622，所述第二粗缩病抗性玉米材料优选为金海5号。
具体包括如下步骤：
(1)第一播种和移栽程序：
将第一粗缩病抗性玉米材料和第二粗缩病抗性玉米材料分别浸种于稀释的浸种液中，浸种1～2天后，催芽并按品种播种于实验秧田，单株移栽，株行距为30×30cm；一般大田肥水和病虫草害管理，至植株正常生长到扬花期，进行步骤(2)。
所述浸种液为2mL10％二硫氰基甲烷乳油、2g咪酰胺、15mL40％福·克悬浮种衣剂、2mL70％吡虫啉水分散粒剂，加500倍水稀释配制而成。
(2)杂交种F1的获取：
将母本植株的玉米穗浸入39～46℃的温水中，浸泡6～10分钟后取出，自然冷却30分钟，用纸袋将母本植株的玉米穗套好并作标记，待用。当父本植株进入开花期时，将父本植株上玉米穗的花药均匀落到纸袋中母本植株玉米穗的柱头上，人工授粉完成后将纸袋继续套好，等待杂交玉米穗的籽粒成熟，即获得杂交种F1。
所述母本植株的玉米穗浸入的温水温度优选为42℃，所述浸泡时间优选为7分钟。
本方法结实率高，并可避免自交，还能促进开花，便于授粉。
(3)杂交种F1抗粗缩病的灰飞虱筛选：
杂交种F1正季播种，当杂交种F1处于2～2.5叶期时，按每株玉米10～20头的数量向秧田释放灰飞虱，50天后对每株玉米进行评估，保留未受粗缩病侵害的植株。
所述灰飞虱每头饲喂玉米粗缩病毒粗毒素提取液4～5天，全部携带玉米粗缩病毒。
(4)杂交种F1的花药愈伤诱导：
以玉米穗中部花药位置占颖壳的1/2为标准取穗，取穗后用70％乙醇表面消毒，然后用塑料薄膜包住整个玉米穗，保持玉米穗湿润放入冰箱中，在4℃下低温预处理3天；在85％的酒精中消毒处理2～10分钟，晾干后用剪开花药上部，将花药置于第一培养基中，进行诱导培养，在22～28℃下暗培养2～3天后，转移至第二培养基中，于25～29℃、光周期16h7500lx光照8h黑暗下进行继代培养，50天后将获得的杂交种F1的花药愈伤组织，统计花药愈伤组织诱导率，若花药愈伤组织诱导率低于5％，则需将杂交种F1与粗缩病抗性玉米材料亲本回交直至花药愈伤组织诱导率高于5％。
(5)第二播种和移栽程序：
将玉米育种主干品系材料和杂交种F1分别浸种于稀释的浸种液中，浸种1-2天后，催芽并按品种播种于实验秧田，单株移栽，株行距为30×30cm；一般大田肥水和病虫草害管理，至植株正常生长到扬花期，进行步骤(6)。
所述浸种液同步骤(1)。
(6)三交F1杂交种的获取：
将母本植株的玉米穗浸入39～46℃的温水中，浸泡6～10分钟后取出，自然冷却30分钟，剪去l/3颖壳及未开颖的小花，用纸袋将母本植株的玉米穗套好并作标记，待用。当父本植株进入开花期时，将父本植株上玉米穗的花药均匀落到纸袋中母本植株玉米穗的柱头上，人工授粉完成后将纸袋继续套好，等待杂交玉米穗的籽粒成熟，即获得三交F1杂交种。
所述母本植株的玉米穗浸入的温水温度优选为42℃，所述浸泡时间优选为7分钟。
(7)三交F1杂交种抗粗缩病的灰飞虱筛选：
三交F1杂交种正季播种，当三交F1杂交种处于2～2.5叶期时，按每株玉米10～20头的数量向秧田释放灰飞虱，50天后对每株玉米进行评估，保留未受粗缩病侵害的植株。
所述灰飞虱每头饲喂玉米粗缩病毒粗毒素提取液4～5天，全部携带玉米粗缩病毒。
(8)三交F1杂交种的花药愈伤诱导：
以玉米穗中部花药位置占颖壳的1/2为标准取穗，取穗后用70％乙醇表面消毒，然后用塑料薄膜包住整个玉米穗，保持玉米穗湿润放入冰箱中，在4℃下低温预处理3天；在85％的酒精中消毒处理2～10分钟，晾干后用剪开花药上部，将花药置于第一培养基中，进行诱导培养，在22～28℃下暗培养2～3天后，转移至第二培养基中，于25～29℃、光周期16h7500lx光照8h黑暗下进行继代培养，获得花药愈伤组织，继续培养出花培苗、育苗、移植到大田，等待玉米穗籽粒成熟，通过筛选即获得粗缩病抗性玉米。
其中步骤(4)和(8)中所述第一培养基的成分为：N6基础培养基500mg/L、甘氨酸4.2mg/L，烟酸11mg/L，琼脂2.3g/L；激动素KT 15mg/L，山梨醇0.5g/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺20mg/L，丙氨酸10mg/L，赤霉素GA3 0.8mg/L，胰岛素12mg/L，叶酸16mg/L，秋水仙碱1.9mg/L；pH值为6.0。
步骤(4)和(8)中所述第二培养基的成分为：MS基本培养基700mg/L、肌醇50mg/L，甘氨酸6mg/L，维生素B1 0.4mg/L，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷20mg/L，维生素B6 0.5mg/L，蔗糖1.5g/L，萘乙酸NAA 1.3mg/L，生物素11mg/L，脱落酸ABA 3.5mg/L，甲基亚硝基脲3.5mg/L，调环酸钙4.2mg/L，水解蛋白0.7g/L；以及浓度30％的玉米粗缩病毒粗毒素提取液，pH值为6.0。
步骤(3)、(7)和(8)中所述玉米粗缩病毒粗毒素提取液的制备方法为：将染病玉米的穗颈部剪下，清洁表面后置于湿润培养皿中，在37℃条件下暗培养，在菌丝产生后加入营养琼脂继续培养，得到菌株；将菌株接种到液体培养基中37℃下摇床培养20天，超声振荡10～30分钟、过滤、以1000～2200rpm的速度离心15～20分钟，得到的上清液即玉米粗缩病毒粗毒素。
本发明涉及的一种抗粗缩病玉米的育种方法，将抗粗缩病基因高效而专一地渗入玉米育种主干品系材料，培育出一种抗粗缩病玉米品系，避免了现有技术利用化学药剂防治玉米抗粗缩病造成的环境污染，缩短了育种周期，避免基因导入引起的细胞变异，保持了良种优异性能的同时增加了其抗粗缩病能力，在一定程度上减少了玉米生产成本，具有应用前景。
具体实施方式
下面通过具体实施例，进一步对本发明的技术方案进行具体说明。应该理解，下面的实施例只是作为具体说明，而不限制本发明的范围，同时本领域的技术人员根据本发明所做的显而易见的改变和修饰也包含在本发明范围之内。
实施例1
第一粗缩病抗性玉米材料选择登海3622，玉米育种主干品系材料选择郑单958，所述第二粗缩病抗性玉米材料为金海5号。采用本发明的技术路线进行粗缩病抗病育种，成功获得了6个农艺性状优良、粗缩病抗性得到改良的花培家系。
郑单958为中国种植面积最大的玉米品种，有高产、稳产优势，但较感粗缩病。登海3622是山东登海种业股份有限公司育成的品种，高抗粗缩病，但感矮花叶病和玉米螟。金海5号是中国农民育种专家翟延举育成的品种，高抗粗缩病，但感弯孢菌叶斑病和丝黑穗病。
其具体操作流程如下：
(1)第一播种和移栽程序：
将登海3622和金海5号分别浸种于稀释的浸种液中，浸种1～2天后，催芽并按品种播种于实验秧田，单株移栽，株行距为30×30cm；一般大田肥水和病虫草害管理，至植株正常生长到扬花期，进行步骤(2)。
所述浸种液为2mL10％二硫氰基甲烷乳油、2g咪酰胺、15mL40％福·克悬浮种衣剂、2mL70％吡虫啉水分散粒剂，加500倍水稀释配制而成。
(2)杂交种F1的获取：
将母本植株的玉米穗浸入42℃的温水中，浸泡7分钟后取出，自然冷却30分钟，用纸袋将母本植株的玉米穗套好并作标记，待用。当父本植株进入开花期时，将父本植株上玉米穗的花药均匀落到纸袋中母本植株玉米穗的柱头上，人工授粉完成后将纸袋继续套好，等待杂交玉米穗的籽粒成熟，即获得杂交种F1。
(3)杂交种F1抗粗缩病的灰飞虱筛选：
杂交种F1正季播种，当杂交种F1处于2～2.5叶期时，按每株玉米10～20头的数量向秧田释放灰飞虱，50天后对每株玉米进行评估，保留未受粗缩病侵害的植株。
所述灰飞虱每头饲喂玉米粗缩病毒粗毒素提取液4～5天，全部携带玉米粗缩病毒。
(4)杂交种F1的花药愈伤诱导：
以玉米穗中部花药位置占颖壳的1/2为标准取穗，取穗后用70％乙醇表面消毒，然后用塑料薄膜包住整个玉米穗，保持玉米穗湿润放入冰箱中，在4℃下低温预处理3天；在85％的酒精中消毒处理2～10分钟，晾干后用剪开花药上部，将花药置于第一培养基中，进行诱导培养，在22～28℃下暗培养2～3天后，转移至第二培养基中，于25～29℃、光周期16h7500lx光照8h黑暗下进行继代培养，50天后将获得的杂交种F1的花药愈伤组织，统计花药愈伤组织诱导率，若花药愈伤组织诱导率低于5％，则需将杂交种F1与粗缩病抗性玉米材料亲本回交直至花药愈伤组织诱导率高于5％。
(5)第二播种和移栽程序：
将郑单958和杂交种F1分别浸种于稀释的浸种液中，浸种1-2天后，催芽并按品种播种于实验秧田，单株移栽，株行距为30×30cm；一般大田肥水和病虫草害管理，至植株正常生长到扬花期，进行步骤(6)。
所述浸种液同步骤(1)。
(6)三交F1杂交种的获取：
将母本植株的玉米穗浸入42℃的温水中，浸泡7分钟后取出，自然冷却30分钟，剪去l/3颖壳及未开颖的小花，用纸袋将母本植株的玉米穗套好并作标记，待用。当父本植株进入开花期时，将父本植株上玉米穗的花药均匀落到纸袋中母本植株玉米穗的柱头上，人工授粉完成后将纸袋继续套好，等待杂交玉米穗的籽粒成熟，即获得三交F1杂交种。
(7)三交F1杂交种抗粗缩病的灰飞虱筛选：
三交F1杂交种正季播种，当三交F1杂交种处于2～2.5叶期时，按每株玉米10～20头的数量向秧田释放灰飞虱，50天后对每株玉米进行评估，保留未受粗缩病侵害的植株。
所述灰飞虱每头饲喂玉米粗缩病毒粗毒素提取液4～5天，全部携带玉米粗缩病毒。
(8)三交F1杂交种的花药愈伤诱导：
以玉米穗中部花药位置占颖壳的1/2为标准取穗，取穗后用70％乙醇表面消毒，然后用塑料薄膜包住整个玉米穗，保持玉米穗湿润放入冰箱中，在4℃下低温预处理3天；在85％的酒精中消毒处理2～10分钟，晾干后用剪开花药上部，将花药置于第一培养基中，进行诱导培养，在22～28℃下暗培养2～3天后，转移至第二培养基中，于25～29℃、光周期16h7500lx光照8h黑暗下进行继代培养，获得花药愈伤组织，继续培养出花培苗、育苗、移植到大田，等待玉米穗籽粒成熟，即获得粗缩病抗性玉米。
其中步骤(4)和(8)中所述第一培养基的成分为：N6基础培养基500mg/L、甘氨酸4.2mg/L，烟酸11mg/L，琼脂2.3g/L；激动素KT 15mg/L，山梨醇0.5g/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺20mg/L，丙氨酸10mg/L，赤霉素GA3 0.8mg/L，胰岛素12mg/L，叶酸16mg/L，秋水仙碱1.9mg/L；pH值为6.0。
步骤(4)和(8)中所述第二培养基的成分为：MS基本培养基700mg/L、肌醇50mg/L，甘氨酸6mg/L，维生素B1 0.4mg/L，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷20mg/L，维生素B6 0.5mg/L，蔗糖1.5g/L，萘乙酸NAA 1.3mg/L，生物素11mg/L，脱落酸ABA 3.5mg/L，甲基亚硝基脲3.5mg/L，调环酸钙4.2mg/L，水解蛋白0.7g/L；以及浓度30％的玉米粗缩病毒粗毒素提取液，pH值为6.0。
步骤(3)、(7)和(8)中所述玉米粗缩病毒粗毒素提取液的制备方法为：将染病玉米的穗颈部剪下，清洁表面后置于湿润培养皿中，在37℃条件下暗培养，在菌丝产生后加入营养琼脂继续培养，得到菌株；将菌株接种到液体培养基中37℃下摇床培养20天，超声振荡10～30分钟、过滤、以1000～2200rpm的速度离心15～20分钟，得到的上清液即玉米粗缩病毒粗毒素。