一种利用组培技术诱导微鳞茎繁育白芨种苗的方法与流程

本发明涉及植物种苗繁育技术领域，具体是涉及一种利用组培技术诱导微鳞茎繁育白芨种苗的方法。

背景技术：

白芨又称白及、紫兰、甘根、连及草，是兰科白芨属多年生宿根草本植物，分布于中国至朝鲜、日本等国，我国分布于华东、华南、及河南、陕西、四川、云南等地。白芨的块茎为我国传统中药，早在《神农本草经》中就有记载，《中国药典》中所收载具有补肺、消肿、生肌、止血、敛疮等功效，用于治疗肺伤咳血、金疮出血、溃疡疼痛、汤火灼伤、手足皲裂等症。此外，白芨花色艳丽，也是一种很好的园林景观植物，因此市场对白芨的需求十分旺盛。近年来随市场需求量增大，白芨价格也逐年攀升。由于长期无限制地人工采挖，野生资源蕴藏量日趋减少，濒临灭绝，白芨被国家列为重点保护的野生药用植物之一。为保护白芨野生资源，人工繁育和栽培白芨势在必行。

白芨的种子非常细小且无胚乳，因此在自然状况下很难萌发和生长，实生苗的繁育较为困难，传统栽培主要靠分割假鳞茎的方式进行分株繁殖。一般1个假鳞茎1年仅能形成1～3个新假鳞茎，因此，分株繁殖周期长，繁殖效率低，而且耗种量大，很难满足大面积栽培的需要。近年，组织培养技术被广泛应用于白芨种苗繁育，一般采用白芨成熟蒴果为材料，在不同培养基上进行无菌播种，种子萌发后利用组织培养方法进行无性系繁殖，实现白芨种苗的规模化生产。我国学者在利用组培技术繁育白芨方面采用了“无菌播种→原球茎→诱导原球茎增殖→诱导芽的分化→诱导生根→炼苗移栽”、“无菌播种→原球茎→诱导芽的分化→诱导生根→炼苗移栽”、“无菌播种→原球茎→诱导芽的分化→诱导生根→炼苗移栽”等技术路线。这些技术方案一般都需要在无菌播种后再经过2～3次转接，在不同的培养基上完成分化、增殖、生根等组培过程，然后再经过炼苗、移栽才能得到白芨种苗。而白芨组培苗移栽后成活率不高，移栽成活后根系细弱，生长慢，需精细管理6～12个月后才能移栽大田。因此，组培程序步骤繁琐，移栽成活率不高，移栽苗生长慢是限制白芨组培繁育技术规模化应用的制约因素。

技术实现要素：

为解决上述问题，本发明提供如下技术方案：

一种利用组培技术诱导微鳞茎繁育白芨种苗的方法，其特征在于，包括如下步骤：

A、将白芨种子无菌播种于MS培养基上，在温度25℃±1℃，光照强度1000Lx，光照时间12h/d条件下培养50d，得到具有1～2片小叶的原球茎；

B、将步骤A得到的原球茎转接到“MS+15％马铃薯汁+0.1％活性炭”的培养基上，在温度25℃±1℃，光照强度2000Lx，光照时间12h/d条件下培养45d，得到具有3～4片叶的白芨组培瓶苗；

C、将经步骤B培养的白芨组培瓶苗在温度15℃±1℃，光照强度2000Lx，光照时间10h/d条件下培养40d，诱导白芨组培瓶苗形成微鳞茎；

D、将经步骤C培养的白芨组培瓶苗在温度25℃±1℃，光照强度1000Lx，光照时间12h/d条件下培养60～80d，微鳞茎膨大并萌发出新芽，从组培瓶中取出组培苗，剥去老叶，洗掉培养基，得到已萌芽的微鳞茎；

E、选取步骤D得到微鳞茎中直径3mm以上，芽长0.3～1.0cm者播种于装有育苗基质的育苗穴盘中，播种深度1cm，播后浇透水，放置在塑料大棚内进行育苗管理，棚温控制在白天25～30℃，夜间15～20℃，出苗前育苗基质含水量保持在70％～75％，出苗后水分管理见干见湿。播种后70d，白芨小苗长出3～5片叶，苗高6cm以上时移栽大田。

上述步骤A和B所述的一种MS培养基，其特征在于，蔗糖含量为30g/L，琼脂含量为6.5g/L，pH值为5.8。

上述步骤E所述的一种育苗基质，其特征在于，由田园土、腐熟的锯末和腐熟的鸡粪按体积比50:40:10混合而成。

本发明的有益效果是：①组培程序简单，只需要在无菌播种得到具有1～2片小叶的原球茎后转接一次。②通过改变培养条件诱导白芨瓶苗形成微鳞茎，操作简单，成本低廉。③用萌芽的微鳞茎播种繁育白芨种苗成苗率高、苗根系发达、生长健壮，育苗时间短。与现有技术相比，本发明具有组培程序简单、节省人力物力、成本低廉、可操作性强、繁育周期短、育成苗健壮及移栽大田后成活率高、生长势强等优点。

附图说明

图1为开始分化叶片的原球茎瓶苗。

图2为已萌芽的微鳞茎。

图3为出苗后的微鳞茎播种苗。

图4为微鳞茎播种白芨苗粗壮的根系。

具体实施方式

下面结合实施方式和实施例对本发明作进一步说明。

实施方式：

步骤1：在超净工作台下将成熟的白芨果夹用70％的酒精处理1min后转入0.2％的升汞溶液浸泡8min，浸泡过程中适当搅动几次使果夹表面全部浸在溶液中；捞出果夹，用无菌水冲洗4次，再用经灭菌的滤纸吸干果夹表面水分；用经火焰消毒处理的镊子和手术刀刨开果夹，将白芨种子无菌播种于装有MS培养基的组培瓶内；在温度25℃±1℃，光照强度1000Lx，光照时间12h/d条件下培养50d，得到具有1～2片小叶的原球茎。

步骤2：将经步骤1培养得到的具有1～2片小叶的原球茎转接到含有15％马铃薯汁和0.1％活性炭的MS培养基上，200ml组培瓶接种20个原球茎。在温度25℃±1℃，光照强度2000Lx，光照时间12h/d条件下培养45d，得到具有3～4片叶的白芨组培瓶苗。

步骤3：将经步骤2培养的白芨组培瓶苗在温度15℃±1℃，光照强度2000Lx，光照时间10h/d条件下培养40d，诱导白芨组培瓶苗形成微鳞茎。

步骤4：将经步骤3培养的白芨组培瓶苗在温度25℃±1℃，光照强度1000Lx，光照时间12h/d条件下培养60～80d，微鳞茎膨大并萌发出新芽，从组培瓶中取出组培苗，剥去老叶，洗掉培养基，得到已萌芽的微鳞茎。

步骤5：选取步骤4得到的微鳞茎中直径3mm以上，芽长0.3～1.0cm者播种于装有育苗基质的育苗穴盘中，播种深度1cm，播后浇透水，放置在塑料大棚内进行育苗管理，棚温控制在白天25～30℃，夜间15～20℃，出苗前育苗基质含水量保持在70％～75％，出苗后水分管理见干见湿。播种后70d，白芨小苗长出3～5片叶，苗高6cm以上时移栽大田。

上述步骤1和2所述的MS培养基，其蔗糖含量为30g/L，琼脂含量为6.5g/L，pH值为5.8。

上述步骤5所述的育苗基质由田园土、腐熟的锯末和腐熟的鸡粪按体积比50:40:10混合而成。

实施例1

选用的白芨种子为在汉中市留坝县采收的家种紫花白芨果夹。按照实施方式所述方法进行步骤1无菌播种及原球茎培养、步骤2组培苗培养和步骤3诱导形成微鳞茎后，经调查统计微鳞茎诱导率为84.3％。再经步骤4继续培养，培养70d时统计，微鳞茎平均直径4.6mm，平均芽长0.59cm；培养80d时统计，微鳞茎平均直径4.8mm，平均芽长0.64cm。选择直径3mm以上，芽长0.3～1.0cm的微鳞茎按照实施方式步骤5中所述的方法播种和管理，同日移栽白芨组培苗作为对照，播后70d时调查统计成苗率及苗素质情况见表1，从表中可看出微鳞茎播种苗(处理1)成苗率、叶片数、苗高、根数及根粗等指标均显著优于同品种组培苗直接移栽(处理3)。

表1：白芨微鳞茎播种苗与组培移栽苗素质比较

实施例2

实施例2与实施例1不同之处在于：选用的白芨种子为在汉中市略阳县采收的野生黄花白芨果夹。步骤3诱导形成微鳞茎后，经调查统计微鳞茎诱导率为89.5％。再经步骤4继续培养，培养60d时统计，微鳞茎平均直径4.3mm，平均芽长0.45cm。选择直径3mm以上，芽长0.3～1.0cm的微鳞茎按照实施方式中步骤5所述的方法播种和管理，同日移栽白芨组培苗作为对照，播后70d时调查统计成苗率及苗素质情况见表1，从表中可看出微鳞茎播种苗(处理3)成苗率、叶片数、苗高、根数及根粗等指标均显著优于组培苗直接移栽(处理4)。