一种水稻无菌苗培养的方法与流程

本发明涉及一种水稻无菌苗培养的方法，属于植物组织培养技术领域。

背景技术：
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“无菌苗”法是植物组织培养技术的延伸，无菌苗是植物有机营养及根系分泌物研究等试验的必备生物材料，而水稻无菌苗的有效培养是开展后续组织培养和转基因工作的前提和基础。水稻种子消毒是一项麻烦的工作，这是由于水稻种子中的内生菌较多，而且种子外有一层与胚结合紧密的壳包裹着，这就给消毒带来了麻烦，使消毒液不易渗入种子内杀死微生物。在现代研究技术领域中，水稻种子消毒的方法比较少，目前效果比较好的方法只有周颖君等人的先将水稻种子去壳后，再用5％的次氯酸钠消毒45分钟，这种方法不但繁琐，增加工作量，而且会损伤种子的胚，影响发芽率，所以说目前寻找一种适合水稻种子的消毒方法是比较重要的。

技术实现要素：
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针对上述问题，本发明要解决的技术问题是提供一种水稻无菌苗培养的方法。

本发明的水稻无菌苗培养的具体方法为：1、取一定量的水稻种子，用水选法汰除空秕粒后，用水浸种4-8小时；

2、准备几个大烧杯或培养皿、几瓶去离子水以及实验所需直径为4-5cm杯底垫有4层湿纱布的培养杯，将其包好后置于120-130℃下灭菌25-35分钟；

3、待浸种完成后，在超净工作台内进行如下操作：

3-1、将浸种后的水稻种子置于无菌的烧杯中，向烧杯中倒入适量的70％-75％酒精，使其完全没过水稻种子，让酒精浸泡1-2分钟；

3-2、待酒精消毒完成后，倒去酒精，再向烧杯中加入适量的35％-40％甲醛，使其完全没过水稻种子，让甲醛浸泡种子3-5分钟；

3-3、待甲醛消毒完成后，倒去甲醛，再向烧杯中加入适量的无菌水(去离子水灭菌所得)清洗种子，清洗三次；

3-4、待种子洗净后，将种子置于铺垫4层纱布的无菌培养杯中以无菌培养膜封口，再将培养杯置于温度25℃-32℃的环境中进行催芽。

本发明的有益效果：它的方法简单，易于操作，能解决现在实验室中的水稻种子的消毒问题，进而为开展后续组织培养和转基因工作提供前处理技术，以及为研究水稻有机营养及根系分泌物提供实验材料。

附图说明：

为了易于说明，本发明由下述的具体实施及附图作以详细描述。

图1为本发明实施例1中培养的水稻的生长状况观察结果图；

图2为本发明实施例1中培养的水稻的发芽率分析结果图；

图3为本发明实施例2中培养的水稻的发芽率分析结果图；

图4为本发明实施例3中培养的水稻的发芽率分析结果图。

具体实施方式：

本具体实施方式采用以下技术方案：1、取一定量的水稻种子，用水选法汰除空秕粒后，用水浸种4-8小时；

2、准备几个大烧杯或培养皿、几瓶去离子水以及实验所需直径为4-5cm杯底垫有4层湿纱布的培养杯，将其包好后置于120-130℃下灭菌25-35分钟；

3、待浸种完成后，在超净工作台内进行如下操作：

3-1、将浸种后的水稻种子置于无菌的烧杯中，向烧杯中倒入适量的70％-75％酒精，使其完全没过水稻种子，让酒精浸泡1-2分钟；

3-2、待酒精消毒完成后，倒去酒精，再向烧杯中加入适量的35％-40％甲醛，使其完全没过水稻种子，让甲醛浸泡种子3-5分钟；

3-3、待甲醛消毒完成后，倒去甲醛，再向烧杯中加入适量的无菌水(去离子水灭菌所得)清洗种子，清洗三次；

3-4、待种子洗净后，将种子置于铺垫4层纱布的无菌培养杯中以无菌培养膜封口，再将培养杯置于温度25℃-32℃的环境中进行催芽。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

实施例1：

称取5克水稻种子，将其置于一烧杯中，在烧杯中注满水，然后将水稻秕粒捞出来，再让水浸泡4小时。同时在121℃下将5套培养皿、3瓶300ml去离子水灭菌30min。在实验前40分钟再将实验所需用具，如：镊子、酒精灯、无菌的土豆培养基平板等置于超净工作台内打开紫外灯灭菌30分钟，待灭菌完成后，在超净工作台内将浸种后的水稻种子转移到灭过菌的培养皿中，再向培养皿中加入浓度为75％的酒精使其没过水稻种子，浸泡1分钟后倒去酒精，再向盛有种子的培养皿中加入适量浓度浓度为40％的甲醛使其没过种子，浸泡5分钟后倒去甲醛，再用无菌水清洗三次。然后用无菌的镊子夹取15颗种子分别置于三个无菌的土豆培养基平板中，每个平板5颗，在28℃的环境中培养7天，观察结果(见图1；图2)。此实施例中水稻的发芽率为93.33％。

实施例2：

称取10克水稻种子，将其置于一烧杯中，在烧杯中注满水，然后将水稻空壳秕粒捞出来，再让水浸泡4小时。同时在121℃下将1个规格为500ml烧杯、5瓶300ml去离子水灭菌30min。在实验前40分钟再将实验所需用具，如：镊子、酒精灯、无菌且内有湿润纱布的聚乙烯耐高温培养杯等置于超净工作台内打开紫外灯灭菌30分钟，待灭菌完成后，在超净工作台内将浸种后的水稻种子转移到灭过菌的烧杯中，再向烧杯中加入浓度为70％的酒精使其没过水稻种子，浸泡2分钟后倒去酒精，再向盛有种子的烧杯中加入适量浓度为40％的甲醛使其没过种子，浸泡5分钟后倒去甲醛，再用无菌水清洗三次。然后用无菌的镊子夹取90颗种子分别置于三个无菌且内有湿润纱布的聚乙烯耐高温培养杯，每个培养杯30颗，在30℃的环境中培养7天，观察结果(见图3)，此实施例中水稻的发芽率为91.11％。

实施例3：

称取10克水稻种子，将其置于一烧杯中，在烧杯中注满水，然后将水稻空壳捞出来，再让水浸泡8小时。同时在121℃下将1个规格为500ml烧杯、5瓶300ml去离子水灭菌30min。在实验前40分钟再将实验所需用具，如：镊子、酒精灯、无菌且内有湿润纱布的聚乙烯耐高温培养杯等置于超净工作台内打开紫外灯灭菌30分钟，待灭菌完成后，在超净工作台内将浸种后的水稻种子转移到灭过菌的烧杯中，再向烧杯中加入浓度为75％的酒精使其没过水稻种子，浸泡1分钟后倒去酒精，再向盛有种子的烧杯中加入适量浓度为38％的甲醛使其没过种子，浸泡5分钟后倒去甲醛，再用无菌水清洗三次。然后用无菌的镊子夹取150颗种子分别置于三个无菌且内有湿润纱布的聚乙烯耐高温培养杯，每个培养杯50颗，在29℃的环境中培养9天，观察结果(见图4)，此实施例中水稻的发芽率为94％。