一种玉米花药诱导培养方法与流程

本发明涉及一种玉米育种方法，具体涉及一种玉米花药诱导培养的方法，属于现代农业高新技术领域。

背景技术：

玉米在我国的栽培历史悠久，目前在我国的播种面积仅次于水稻、小麦，在粮食作物中居第三位。玉米是重要的粮食和饲料作物，也是现代食品和化学、能源、营养品以及医药工业的原料，广泛用于造纸、食品、纺织、医药等行业。

玉米具有产量高、耐储存、再生产价值高的特点，但随着气候变暖、耕作制度改变和单一品种大面积种植多重逆境因素的影响，病虫害、种质退化等现象频繁发生，严重影响了玉米的稳产性。

为保证玉米的稳产性，现有技术的育种方式是利用其杂种优势来育种，在育种过程中最为关键的环节是纯系选育。常规玉米自交系的选育需要经过多代的自交选择，因此选育一个品种往往需要数年的时间，大大延长了育种周期而且增加了人力与资源成本。利用花药培养技术进行诱导培养，与常规方法相比不仅大大缩短育种周期，而且节约大量的人力、物力和财力。

然而，迄今为止，玉米花药培养的去分化和分化频率仍然较低，加之各基因型之间的差异很大，从而限制了该技术在育种上的应用。因此，进一步提高玉米花药离体培养效率有非常重要的科学价值和实践意义。影响玉米花药培养效果的因素多种多样，既包括由植株本身所决定的从基因型差异、花药的发育时期及供体植株的生理状态等内在条件；也包括基本培养基成分、激素及培养温度等外界因素。从花培育种角度考虑，对于优良品种的改良和培育，往往需要从大量的花培后代中筛选优良家系，需要更大规模的培育花培子代，所以改善培养条件、提高花培效率是花培育种的最现实的需求。

技术实现要素：

在玉米花药培养过程中，愈伤组织分化是很重要的一步，花药愈伤组织分化率和白化率水平极大地影响着花药培养的效率。本发明目的是提供一种玉米花药诱导培养方法，并通过组合和优化提供实用的玉米花药诱导、分化培养基组分。

具体方法为：选取玉米的花药培养供体，正季播种，从大田中选取小孢子发育时期处于四分体时期、单核中期、单核靠边期及双核阶段的花药小穗，取穗后用70％乙醇表面消毒，然后用塑料薄膜包住整个玉米穗，保持玉米穗湿润放入冰箱中，在4℃下低温预处理3天；每个试管接5个小穗，倒入30ml提取液，用高速分散器超速旋切，用300目筛网过滤，滤液离心2～10min，重复3～5次，收集小孢子。小孢子用提取液于25℃、黑暗预处理2d。

培养前将小孢子先用20％麦芽糖纯化，再用培养基洗涤1次，然后将小孢子悬浮液接种于培养基中，进行诱导培养，在22～28℃下暗培养2～3天后，环境条件控制为25～29℃、光周期16h7500lx光照8h黑暗。

所述提取液的成分为：10～15％甘露醇、1～2g/L CaCl₂、1.2～1.5g/L N-吗啡乙烷磺酸MES，15～20％蔗糖，优选为：12％甘露醇、1.5g/L CaCl₂、1.3g/L N-吗啡乙烷磺酸MES，17％蔗糖。

所述玉米花药分化培养基的组分为：

KNO₃ 3000～3500mg/L，NH₄NO₃ 2500～2800mg/L，KH₂PO₄ 360～400mg/L，CaCl₂·2H₂O 580～640mg/L，MgSO₄·7H₂O 250～300mg/L，Na₂-EDTA 50～80mg/L，FeSO₄·7H₂O 35～45mg/L，MnSO₄·4H₂O 30～45mg/L，ZnSO₄·7H₂O 15～20mg/L，H₃BO₃ 8.5～10.0mg/L，KI 1.5～2.0mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.05～0.08mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.5～0.8mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.05～0.08mg/L，肌醇30～60mg/L，甘氨酸2.5～3.5mg/L，维生素B1 0.65～0.85mg/L，维生素B6 0.65～0.85mg/L，烟酸0.85～0.90mg/L，蔗糖16～20g/L，琼脂4～5g/L，激动素KT 2.8～3.2mg/L，萘乙酸NAA 0.65～0.85mg/L，山梨醇32～40g/L，生物素0.15～0.20mg/L；

吲哚-3-乙酸IAA 0～0.55mg/L，甲基茉莉酸0～0.11mg/L，酵母提取物0～4.5mg/L，水杨酸甲酯0～0.35mg/L，2,4-D 0～10mg/L，复酞核酸0～8.5mg/L。

所述玉米花药分化培养基的优选组分为：

KNO₃ 3200mg/L，NH₄NO₃ 2730mg/L，KH₂PO₄ 385mg/L，CaCl₂·2H₂O 610mg/L，MgSO₄·7H₂O 280mg/L，Na₂-EDTA 67.5mg/L，FeSO₄·7H₂O 40mg/L，MnSO₄·4H₂O 35mg/L，ZnSO₄·7H₂O 18mg/L，H₃BO₃ 9mg/L，KI 1.8mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.065mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.65mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.06mg/L，肌醇40mg/L，甘氨酸3.0mg/L，维生素B1 0.7mg/L，维生素B6 0.7mg/L，烟酸0.86mg/L，蔗糖18g/L，琼脂4.5g/L，激动素KT 3.0mg/L，萘乙酸NAA 0.7mg/L，山梨醇35g/L，生物素0.17mg/L；

吲哚-3-乙酸IAA 0.30～0.55mg/L，甲基茉莉酸0.05～0.11mg/L，酵母提取物3.2～4.5mg/L，水杨酸甲酯0.18～0.35mg/L，2,4-D 5～10mg/L，复酞核酸4.5～8.5mg/L。

更进一步优选，所述玉米花药分化培养基的组分为：KNO₃ 3200mg/L，NH₄NO₃2730mg/L，KH₂PO₄ 385mg/L，CaCl₂·2H₂O 610mg/L，MgSO₄·7H₂O 280mg/L，Na₂-EDTA 67.5mg/L，FeSO₄·7H₂O 40mg/L，MnSO₄·4H₂O 35mg/L，ZnSO₄·7H₂O 18mg/L，H₃BO₃ 9mg/L，KI 1.8mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.065mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.65mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.06mg/L，肌醇40mg/L，甘氨酸3.0mg/L，维生素B1 0.7mg/L，维生素B6 0.7mg/L，烟酸0.86mg/L，蔗糖18g/L，琼脂4.5g/L，激动素KT 3.0mg/L，萘乙酸NAA 0.7mg/L，山梨醇35g/L，生物素0.17mg/L；

吲哚-3-乙酸IAA 0.45mg/L，甲基茉莉酸0.05mg/L，酵母提取物3mg/L，水杨酸甲酯0.15mg/L，2,4-D 6mg/L，复酞核酸5mg/L。

本发明涉及的一种玉米花药诱导培养方法及其培养基的组分，提高玉米花药愈伤组织分化率和降低白化率，大大提高玉米花药培养的效率。本发明涉及的玉米花药分化培养方法及其培养基对玉米品种京科665、良玉188的愈伤组织诱导率高达71.4％和76.5％，对玉米单倍体育种和玉米花药培养技术在遗传转化中的应用具有较大的实用价值，具有较高的产业推广前景。

具体实施方式

下面通过具体实施例，进一步对本发明的技术方案进行具体说明。应该理解，下面的实施例只是作为具体说明，而不限制本发明的范围，同时本领域的技术人员根据本发明所做的显而易见的改变和修饰也包含在本发明范围之内。

下面实施例1～7的区别为玉米花药分化培养基不同，而培养供体的选择、愈伤组织的诱导培养方法、操作方法相同，具体方法为：

选取玉米品种京科665和良玉188作为花药培养供体，正季播种，从大田中选取小孢子发育时期处于四分体时期、单核中期、单核靠边期及双核阶段的花药小穗，取穗后用70％乙醇表面消毒，然后用塑料薄膜包住整个玉米穗，保持玉米穗湿润放入冰箱中，在4℃下低温预处理3天；每个试管接5个穗子，倒入30ml提取液，用高速分散器超速旋切，用300目筛网过滤，滤液离心2～10min，重复3～5次，收集小孢子。小孢子用提取液于25℃、黑暗预处理2d。

培养前将小孢子先用20％麦芽糖纯化，再用培养基洗涤1次，然后将小孢子悬浮液接种于培养基中，进行诱导培养，在22～28℃下暗培养2～3天后，环境条件控制为25～29℃、光周期16h7500lx光照8h黑暗。

绿苗产生后(长到2cm左右)，计算愈伤组织分化率和白化苗率。愈伤组织分化率(绿苗分化率)(％)＝分化绿苗数/转移的愈伤块数×100％(本发明所述的分化率除特别指明均认为是绿苗分化率)；白化苗率(％)＝白化苗数/转移的愈伤块数×100％。

以下实施例1～7中为玉米花药分化培养基的组分。

实施例1

KNO₃ 3200mg/L，NH₄NO₃ 2730mg/L，KH₂PO₄ 385mg/L，CaCl₂·2H₂O 610mg/L，MgSO₄·7H₂O 280mg/L，Na₂-EDTA 67.5mg/L，FeSO₄·7H₂O 40mg/L，MnSO₄·4H₂O 35mg/L，ZnSO₄·7H₂O 18mg/L，H₃BO₃ 9mg/L，KI 1.8mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.065mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.65mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.06mg/L，肌醇40mg/L，甘氨酸3.0mg/L，维生素B1 0.7mg/L，维生素B6 0.7mg/L，烟酸0.86mg/L，蔗糖18g/L，琼脂4.5g/L，激动素KT 3.0mg/L，萘乙酸NAA 0.7mg/L，山梨醇35g/L，生物素0.17mg/L；

吲哚-3-乙酸IAA 0.45mg/L，甲基茉莉酸0.05mg/L，酵母提取物3mg/L，水杨酸甲酯0.15mg/L，2,4-D 6mg/L，复酞核酸5mg/L。

实施例2

变量为吲哚-3-乙酸IAA添加浓度：

KNO₃ 3200mg/L，NH₄NO₃ 2730mg/L，KH₂PO₄ 385mg/L，CaCl₂·2H₂O 610mg/L，MgSO₄·7H₂O 280mg/L，Na₂-EDTA 67.5mg/L，FeSO₄·7H₂O 40mg/L，MnSO₄·4H₂O 35mg/L，ZnSO₄·7H₂O 18mg/L，H₃BO₃ 9mg/L，KI 1.8mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.065mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.65mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.06mg/L，肌醇40mg/L，甘氨酸3.0mg/L，维生素B1 0.7mg/L，维生素B6 0.7mg/L，烟酸0.86mg/L，蔗糖18g/L，琼脂4.5g/L，激动素KT 3.0mg/L，萘乙酸NAA 0.7mg/L，山梨醇35g/L，生物素0.17mg/L；

甲基茉莉酸0.05mg/L，酵母提取物3mg/L，水杨酸甲酯0.15mg/L，2,4-D 6mg/L，复酞核酸5mg/L。

吲哚-3-乙酸IAA的添加浓度设置以下7种：0，0.1mg/L，0.2mg/L，0.3mg/L，0.4mg/L，0.5mg/L，0.55mg/L。

实施例3

变量为甲基茉莉酸添加浓度：

KNO₃ 3200mg/L，NH₄NO₃ 2730mg/L，KH₂PO₄ 385mg/L，CaCl₂·2H₂O 610mg/L，MgSO₄·7H₂O 280mg/L，Na₂-EDTA 67.5mg/L，FeSO₄·7H₂O 40mg/L，MnSO₄·4H₂O 35mg/L，ZnSO₄·7H₂O 18mg/L，H₃BO₃ 9mg/L，KI 1.8mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.065mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.65mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.06mg/L，肌醇40mg/L，甘氨酸3.0mg/L，维生素B1 0.7mg/L，维生素B6 0.7mg/L，烟酸0.86mg/L，蔗糖18g/L，琼脂4.5g/L，激动素KT 3.0mg/L，萘乙酸NAA 0.7mg/L，山梨醇35g/L，生物素0.17mg/L；

吲哚-3-乙酸IAA 0.45mg/L，酵母提取物3mg/L，水杨酸甲酯0.15mg/L，2,4-D 6mg/L，复酞核酸5mg/L。

甲基茉莉酸设置为以下6种：0，0.02mg/L，0.04mg/L，0.06mg/L，0.09mg/L，0.11mg/L。

实施例4

变量为酵母提取物添加浓度：

KNO₃ 3200mg/L，NH₄NO₃ 2730mg/L，KH₂PO₄ 385mg/L，CaCl₂·2H₂O 610mg/L，MgSO₄·7H₂O 280mg/L，Na₂-EDTA67.5mg/L，FeSO₄·7H₂O 40mg/L，MnSO₄·4H₂O 35mg/L，ZnSO₄·7H₂O 18mg/L，H₃BO₃ 9mg/L，KI 1.8mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.065mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.65mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.06mg/L，肌醇40mg/L，甘氨酸3.0mg/L，维生素B1 0.7mg/L，维生素B6 0.7mg/L，烟酸0.86mg/L，蔗糖18g/L，琼脂4.5g/L，激动素KT 3.0mg/L，萘乙酸NAA 0.7mg/L，山梨醇35g/L，生物素0.17mg/L；

吲哚-3-乙酸IAA 0.45mg/L，甲基茉莉酸0.05mg/L，水杨酸甲酯0.15mg/L，2,4-D 6mg/L，复酞核酸5mg/L。

酵母提取物的添加浓度设置以下5种：0，1.2mg/L，2.3mg/L，3.5mg/L，4.5mg/L。

实施例5

变量为水杨酸甲酯添加浓度：

KNO₃ 3200mg/L，NH₄NO₃ 2730mg/L，KH₂PO₄ 385mg/L，CaCl₂·2H₂O 610mg/L，MgSO₄·7H₂O 280mg/L，Na₂-EDTA 67.5mg/L，FeSO₄·7H₂O 40mg/L，MnSO₄·4H₂O 35mg/L，ZnSO₄·7H₂O 18mg/L，H₃BO₃ 9mg/L，KI 1.8mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.065mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.65mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.06mg/L，肌醇40mg/L，甘氨酸3.0mg/L，维生素B1 0.7mg/L，维生素B6 0.7mg/L，烟酸0.86mg/L，蔗糖18g/L，琼脂4.5g/L，激动素KT 3.0mg/L，萘乙酸NAA 0.7mg/L，山梨醇35g/L，生物素0.17mg/L；

吲哚-3-乙酸IAA 0.45mg/L，甲基茉莉酸0.05mg/L，酵母提取物3mg/L，2,4-D 6mg/L，复酞核酸5mg/L。

水杨酸甲酯添加浓度设置以下4种：0，0.08mg/L，0.12mg/L，0.35mg/L。

实施例6

变量为2,4-D添加浓度：

KNO₃ 3200mg/L，NH₄NO₃ 2730mg/L，KH₂PO₄ 385mg/L，CaCl₂·2H₂O 610mg/L，MgSO₄·7H₂O 280mg/L，Na₂-EDTA67.5mg/L，FeSO₄·7H₂O 40mg/L，MnSO₄·4H₂O 35mg/L，ZnSO₄·7H₂O 18mg/L，H₃BO₃ 9mg/L，KI 1.8mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.065mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.65mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.06mg/L，肌醇40mg/L，甘氨酸3.0mg/L，维生素B1 0.7mg/L，维生素B6 0.7mg/L，烟酸0.86mg/L，蔗糖18g/L，琼脂4.5g/L，激动素KT 3.0mg/L，萘乙酸NAA 0.7mg/L，山梨醇35g/L，生物素0.17mg/L；

吲哚-3-乙酸IAA 0.45mg/L，甲基茉莉酸0.05mg/L，酵母提取物3mg/L，水杨酸甲酯0.15mg/L，复酞核酸5mg/L。

2,4-D添加浓度设置以下5种：0，2.5mg/L，5mg/L，7.5mg/L，10mg/L。

实施例7

变量为复酞核酸添加浓度：

KNO₃ 3200mg/L，NH₄NO₃ 2730mg/L，KH₂PO₄ 385mg/L，CaCl₂·2H₂O 610mg/L，MgSO₄·7H₂O 280mg/L，Na₂-EDTA 67.5mg/L，FeSO₄·7H₂O 40mg/L，MnSO₄·4H₂O 35mg/L，ZnSO₄·7H₂O 18mg/L，H₃BO₃ 9mg/L，KI 1.8mg/L，CuSO₄·5H₂O 0.065mg/L，Na₂MoO₄·2H₂O 0.65mg/L，CoCl₂·6H₂O 0.06mg/L，肌醇40mg/L，甘氨酸3.0mg/L，维生素B1 0.7mg/L，维生素B6 0.7mg/L，烟酸0.86mg/L，蔗糖18g/L，琼脂4.5g/L，激动素KT 3.0mg/L，萘乙酸NAA 0.7mg/L，山梨醇35g/L，生物素0.17mg/L；

吲哚-3-乙酸IAA 0.45mg/L，甲基茉莉酸0.05mg/L，酵母提取物3mg/L，水杨酸甲酯0.15mg/L，2,4-D 6mg/L。

复酞核酸添加浓度设置以下5种：0，2mg/L，4.5mg/L，6.5mg/L，8.5mg/L。

培养基对比实验

将实施例2-7分别与实施例1进行对比，对比的结果如表1-6所示：

表1吲哚-3-乙酸IAA添加浓度效果对比

表2甲基茉莉酸添加浓度效果对比

表3酵母提取物添加浓度效果对比

表4水杨酸甲酯添加浓度效果对比

表5 2,4-D添加浓度效果对比

表6复酞核酸添加浓度效果对比

从表1～6可以看出，使用本发明实施例1的培养基(即本发明的一个优选方案)比使用其它任何对比培养基诱导玉米花药愈伤组织的效率更高，表明本发明实施例1提供的技术方案中培养基的组分及配比是经过大量单因子、多因子试验所筛选的最优组合，多年来我们亦围绕本发明的组合配比做了小范围单因子改变优化组合试验。使用本发明所提供的培养基对玉米品种京科665、良玉188的愈伤组织诱导率高达71.4％和76.5％，充分说明了本发明提供的技术方案及其培养基是对玉米花药诱导培养具有显著的技术效果，具有较高的产业推广价值和理论研究价值。