一种慢性肝硬化胆道闭锁动物模型的构建方法与流程

本发明涉及动物模型构建技术领域，更具体地，涉及一种慢性肝硬化胆道闭锁动物模型的构建方法。

背景技术：

胆道闭锁（biliary atresia，BA）是发生于婴幼儿的进行性炎症性胆管病，是引起婴幼儿阻塞性黄疸的常见疾病，最终导致肝外、肝内胆管的梗阻及肝硬化，预后差，病死率高。鉴于胆道闭锁病因的不明确性和复杂性，使得人们对胆道闭锁的临床研究受到限制，人们常常通过构建动物模型，模拟胆道闭锁症状，从而研究其发病机制，试图寻找治疗疾病的方法。

恒河猴轮状病毒（rhesus rotavirus group A，RRV）被认为与胆道闭锁的发病有一定的关系，国外学者Petersen等使用RRV对出生24小时内的新生小鼠进行腹腔注射，成功建立了小鼠胆道闭锁动物模型，即被注射的新生小鼠表现出皮肤黄染、陶土样大便、尿色深黄、体重增加缓慢等症状，解剖显示肝内外胆管闭锁，其表现与胆道闭锁患者相似，成为临床上胆道闭锁疾病研究的重要动物模型。但该模型发展至今仍然存在许多缺陷：1、在新生小鼠出生24小时内注射RRV诱导的胆道闭锁经典动物模型中，虽然可以模拟出胆道闭锁急性炎症阶段，新生小鼠可以表现出全身黄疸，糙毛，体重低，尿色深黄，白色陶土样大便，精神状态差等，但可能由于新生小鼠胆道系统对RRV表现出较强的免疫反应，导致该模型的小鼠不能存活至14天，存活率极低；2、在新生小鼠出生第4或5天注射高剂量的RRV诱导的胆道闭锁动物模型中，小鼠虽然能存活至15～20天，但该模型不稳定，重复率低；注射病毒原液剂量大从而造成浪费；该模型大部分小鼠表现出一过性肝炎的症状，并不符合胆道闭锁患者的临床特点；经解剖观察，该模型极少有胆道发生闭锁；该模型仍然不能充分模拟出胆道闭锁终末期肝硬化阶段；因此可知，现有轮状病毒诱导的胆道闭锁动物模型只能模拟出临床胆道闭锁患者急性炎症阶段，且没有充分的证据表明现有的模型能模拟出胆道闭锁慢性肝硬化或终末期肝硬化阶段。然而，几乎所有胆道闭锁患者经手术探查时，肝脏均已经发展到不同程度的肝硬化。

因此，针对胆道闭锁动物模型能否发展到终末期肝硬化阶段，对该疾病的治疗具有非常重要的研究意义。而现有胆道闭锁动物模型并不能模拟胆道闭锁病情的发生、发展、预后整个疾病过程。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是克服现有技术存在的上述缺陷，首先提供Gr-1抗体在构建慢性肝硬化胆道闭锁动物模型中的应用。

本发明的第二个目的是提供一种慢性肝硬化胆道闭锁动物模型的构建方法；利用本发明所述方法构建获得的动物模型能充分且完整地模拟胆道闭锁发生、发展、预后整个疾病过程。

本发明的目的是通过以下技术方案予以实现的：

Gr-1抗体在构建慢性肝硬化胆道闭锁动物模型中的应用。

MDSCs是骨髓来源的一群异质细胞，是树突状细胞、巨噬细胞、粒细胞的前体，具有显著抑制免疫细胞应答的能力，发明人通过研究发现Gr-1抗体通过抑制MDSCs（其下游细胞包括巨噬细胞、粒细胞及树突状细胞）而降低新生小鼠对病毒的免疫抑制能力，从而避免前期小鼠对恒河猴轮状病毒（RRV）表现出较强的免疫反应而死亡。

本发明还提供一种慢性肝硬化胆道闭锁动物模型的构建方法，参照新生小鼠出生24小时内注射恒河猴轮状病毒诱导的胆道闭锁经典动物模型进行，在注射恒河猴轮状病毒前，先注射Gr-1抗体；并且在该小鼠出生后的14天内，多次注射Gr-1抗体，以维持小鼠体内Gr-1抗体在有效浓度范围；每次给小鼠注射Gr-1抗体的剂量为5～20ng/1.6g小鼠。

优选地，在注射恒河猴轮状病毒前（4～12）h，注射Gr-1抗体。

研究发现首次注射Gr-1抗体能够抑制小鼠体内的MDSCs，但若不在小鼠感染病毒后继续注射Gr-1抗体对小鼠进行干预，则很可能不能形成慢性肝硬化的小鼠模型，因此，在前期需要维持小鼠体内Gr-1抗体的有效浓度，优选地，在首次注射Gr-1抗体后，每隔（3～4）d对小鼠注射Gr-1抗体，以维持小鼠体内Gr-1抗体在有效浓度范围。

优选地，本发明中，所述恒河猴轮状病毒的注射剂量为20μL/只小鼠，病毒滴度为1×10⁶PFU。

一般Gr-1抗体的药效持续3~4天左右，因此优选地，在首次注射Gr-1抗体后，在小鼠出生第4天第二次注射Gr-1抗体，在小鼠出生第8天第三次注射Gr-1抗体，在小鼠出生第12天第四次注射Gr-1抗体。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明首次将Gr-1抗体用于构建慢性肝硬化胆道闭锁动物模型，在利用恒河猴轮状病毒诱导小鼠形成胆道闭锁之前，先给小鼠注射Gr-1抗体，Gr-1抗体通过抑制MDSCs而降低新生小鼠对病毒的免疫抑制能力，从而避免前期小鼠对恒河猴轮状病毒表现出较强的免疫反应而死亡，后期继续使用Gr-1抗体对感染病毒的小鼠进行干预，使得感染病毒的小鼠形成一个持续的病毒性炎症反应；该方法构建小鼠模型具有以下优点：

（1）构建得到的模型稳定，重复率高，小鼠生存率高；（2）不仅模拟了临床患者胆道闭锁的急性炎症阶段，更重要的是模拟了临床患者胆道闭锁的终末期肝硬化阶段；通过该模型能充分并且完整的模拟了胆道闭锁发生、发展、预后整个疾病过程；（3）构建得到的模型新生小鼠生存周期长，闭锁率高；构建得到的模型小鼠生存至28天，其生存率达到80%以上；生存至42天，其生存率达到50%以上；经统计，该模型小鼠胆道闭锁发生率在70%以上（其中，完全胆道闭锁在50%以上）；（4）构建得到的模型不仅能模拟出胆道闭锁早期急性炎症阶段的症状（如全身黄疸，糙毛，体重低，尿色深黄，白色陶土样大便等），而且随着进行性肝硬化的发展，该模型小鼠体重增加缓慢，明显消瘦，全身黄疸依然存在，腹部膨隆，存在腹水；该模型新生小鼠在胆道闭锁的基础上，形成肝硬化。其肝脏质地硬，似砂砾状，肝脏土黄色，胆囊充盈膨胀。

该新生小鼠慢性肝硬化动物模型更贴近胆道闭锁患者病程的进展情况，为临床胆道闭锁病因学的研究，以及进一步的诊断和治疗提供了良好的研究工具。

附图说明

图1为实施例1实验组和阳性对照组新生小鼠第9天和第12天后外形观察图。

图2为实施例1实验组和阴性对照组新生小鼠第28天和第42天后外形观察图。

图3为实施例1构建方法过程中，新生小鼠第9天、第28天、第35天和第42天外形观察图。

图4为正常小鼠和肝硬化小鼠第28天肝脏图片；其中肝硬化小鼠是实施例1构建方法获得模型小鼠。

图5为实施例1构建方法获得的模型小鼠第28天和第42天的肝脏图片。

图6为实施例1实验组和阴性对照组小鼠第28天时分离肝脏图片。

图7为实施例1实验组和阴性对照组小鼠第42天时分离肝脏图片。

图8为实施例1构建方法获得的模型小鼠第42天肝脏组织切片（苦味酸-天狼星红染色）染色图，其中，图8A为肝硬化小鼠（1号），图8B为肝硬化小鼠（2号），图8C为肝硬化小鼠（3号）。

具体实施方式

下面将结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤、条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。若无特别说明，实施例中所用的实验方法均为本领域技术人员所熟知的常规方法和技术，试剂或材料均为通过商业途径得到。

实施例1

实验组为注射抗MDSCs药物和RRV组（RRV+ anti Gr-1组），阳性对照组为仅仅注射RRV组（RRV组），阴性对照组为不注射MDSCs药物和RRV组（正常组），慢性肝硬化动物模型的构建方法，包括以下步骤：

（1）Balb/c新生小鼠，在出生24小时内，腹腔注射抗MDSCs药物[Anti-Mouse Ly-6G（Gr-1），简称Gr-1抗体]，首次剂量为5ng每只小鼠（新生小鼠的重量约为1.6g）。

（2）注射抗MDSCs药物4小时之后，再经腹腔注射恒河猴轮状病毒（MMU18006病毒株，病毒悬液滴度为1×10⁶PFU），注射剂量为20μL每只小鼠，其中恒河猴轮状病毒的注射时间也是在Balb/c新生小鼠出生24小时内。

（3）抗MDSCs药物多次注射：在上述新生小鼠出生后4天第二次注射抗MDSCs药物，在新生小鼠出生后8天第三次注射MDSCs药物，在新生小鼠出生后12天第四次注射MDSCs药物，每次抗MDSCs药物的剂量为每1.6g小鼠注射5ng。

（4）待新生小鼠生存至21天时，进行人工喂食，保证其生存质量。

在新生小鼠出生第9天，将实验组和阳性对照组比较，发现实验组皮肤无毛区黄疸不明显，而阳性对照组表现出明显的黄疸、体型稍瘦，因此注射抗MDSCs药物能够减轻或延缓RRV感染后小鼠急性期的炎症免疫反应（图1）；同时还观察到新生小鼠出生第12天时，阳性对照组小鼠黄疸明显，体型瘦小，而实验组仅表现出轻微的黄疸、糙毛（图1）；在新生小鼠出生第28天和第42天后，将实验组和阴性对照组（即正常组）比较，发现实验组小鼠皮肤黄疸、糙毛持续存在，体型瘦小，因此注射抗MDSCs药物能够形成RRV感染后小鼠慢性期的炎症阶段，即慢性肝硬化阶段（图2）；图3为实验组小鼠不同时间段的表形观察，即注射抗MDSCs药物后，观察感染RRV的小鼠从急性期至慢性期的表形，实验组小鼠皮肤黄疸、糙毛持续存在，体型瘦小（图3），图4为实验组和阴性对照组的新生小鼠出生第28天肝胆表观，可以看出实验组肝脏颜色黄，有大量散在的点状炎症坏死灶，胆囊充盈膨胀，胆管发生闭锁；阴性对照组肝脏颜色红润，胆管正常（图4），图5为实验组的新生小鼠出生后第28天和第42天肝脏外形，可以看出实验组第42天的肝脏变的暗黄色，有大量的炎症坏死灶，肝脏表面有小结节突起，似砂砾状（图5）。

本实施例实验组共处理新生小鼠32只，存活至中后期（28天后）的小鼠有28只，存活率87.5%。其中最终成功构建表现出胆道闭锁的小鼠有23只，闭锁发生率为82.14%（其中，12只完全闭锁，即完全闭锁率52.17%；11只不完全闭锁，即不完全闭锁率47.83%）。这23只胆道闭锁小鼠存活至中后期（28天后）均表现出不同程度肝硬化。42天后，存活小鼠数量为16只，存活率50%。

实施例2

实验组为注射抗MDSCs药物和RRV组（RRV+ anti Gr-1组），阳性对照组为仅仅注射RRV组（RRV组），阴性对照组为不注射MDSCs药物和RRV组（正常组），慢性肝硬化动物模型的构建方法，包括以下步骤：

（1）Balb/c新生小鼠，在出生24小时内，腹腔注射抗MDSCs药物[Anti-Mouse Ly-6G（Gr-1），简称Gr-1抗体]，首次剂量为20ng每只小鼠（新生小鼠的重量约为1.6g）。

（2）注射抗MDSCs药物4小时之后，再经腹腔注射恒河猴轮状病毒（MMU18006病毒株，病毒悬液滴度为1×10⁶PFU），注射剂量为20μL每只小鼠，其中恒河猴轮状病毒的注射时间也是在Balb/c新生小鼠出生24小时内。

（3）抗MDSCs药物多次注射：在新生小鼠出生后4天第二次注射抗MDSCs药物，在新生小鼠出生后8天第三次注射MDSCs药物，在新生小鼠出生后12天第四次注射MDSCs药物，每次抗MDSCs药物的剂量为每1.6g小鼠注射20ng。

（4）待新生小鼠生存至21天时，进行人工喂食，保证其生存质量。

本实施例实验组共处理新生小鼠20只，存活在中后期（28天后）的小鼠有16只，存活率80%。其中最终成功构建表现出胆道闭锁的小鼠有12只，闭锁发生率为75%（其中，8只完全闭锁，即完全闭锁率66.67%；4只不完全闭锁，即不完全闭锁率33.33%）。这12只胆道闭锁小鼠存活至中后期（28天后）均表现出不同程度肝硬化。42天后，存活小鼠数量为12只，存活率60%。