本发明涉及组织培养
技术领域：
，特别涉及一种大花月季组织培养的培养基及方法。
背景技术：
：大花月季，别名香水月季、壮花月季、观赏月季，是蔷薇属植物，适宜在阳光充足、空气流通的环境中生长，它对土壤要求不严。品种众多，是现代月季的主体部分。其特征是：植株健壮，单朵或群花，花朵大，花型高雅优美，花色众多、鲜艳明快，具有芳香气味，观赏性强。主产地为河南省南阳市，山东、云南、江苏、北京、上海等地也有生产。大花月季比较常见的繁殖方式是嫁接、扦插。月季嫁接苗的优点是月季嫁接苗一般比扦插苗生长快3倍以上，当年就可以发育成粗壮的大株，开出标准的花朵。缺点是寿命较短，5年以上植株开始衰老，而且经常萌发砧芽。月季扦插苗的优点是扦插苗属无性繁殖，取其枝条便可生根形成一个独立的个体，其性状与母本的花色，株形，习性表现一致。但有些品种的月季很难扦插生根，或根系不发达。大花月季的组织快繁技术，在保持母本的优良性状基础上，并能快速、大量成苗。大花月季组培的关键技术就是月季外植体的消毒杀菌，及不同阶段培养基的选择。公开号为CN102422815A的中国专利公开了一种以大花香水月季茎段为外植体的植株再生方法，通过对大花香水月季中部枝条，切段、灭菌后进行继代培养一个月，再将大花香水月季无菌苗的叶片横切数刀，接种到愈伤诱导培养基上，待长出胚性愈伤组织，再在分化培养基上培养待胚性愈伤组织分化出不定芽，然后接种到壮苗培养基上，长高后接种到生根培养基上培养即形成完整植株。公开号为CN105309306A的中国专利公开了一种香水月季扩繁技术，包括：剪取香水月季的健壮枝条中部，剪成带芽的小段1～3cm长；用牙刷粘洗衣粉轻轻刷去茎段表面的泥渍，置于流水冲洗45min，置于无菌环境下用75％酒精浸泡15～30s，并用无菌水冲洗一遍；次氯酸钠溶液消毒后，切去茎段头尾两端，接种于含有6-BA、NAA的MS培养基上，然后在增殖、壮苗、生根、开花培养基上培养。但采用上述分化、继代及生根培养基对大花月季进行组织培养的诱导分化率、外植体增殖系数及生根率较低。因此，研发一种可提高大花月季诱导分化率、外植体增殖系数及生根率的组织培养的培养基具有重要的现实意义。技术实现要素：有鉴于此，本发明提供了一种大花月季组织培养的培养基及方法。该培养基配方可显著提高大花月季的诱导分化率、外植体增殖系数及生根率。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种大花月季组织培养的培养基，包括分化培养基、继代培养基和生根培养基；分化培养基为：含有0.5～2.0mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、0.1～0.3mg/LTDZ、20～30g/L蔗糖和7～8g/L琼脂的MS培养基，pH值为5.8；继代培养基为：含有1.0mg/L6-BA和0.1～0.5mg/LNAA、20～30g/L蔗糖和7～8g/L琼脂的MS培养基，pH值为5.8；生根培养基为：含有0.2～1.0mg/LNAA、20～30g/L蔗糖和7～8g/L琼脂的MS培养基，pH值为5.8。6-BA是6-苄氨基腺嘌呤，为人工合成细胞分裂素，具有抑制植物叶内叶绿素、核酸、蛋白质分解，保绿防老；氨基酸、生长素、无机盐等向处理部位调运等多种效能，广泛用农业、树和园艺作物从发芽收获各阶段。萘乙酸(1-Naphthylaceticacid)，简称NAA，是一种有机化合物，它是植物生长调节剂中的生长素类似物，常用于商用的发根粉或发根剂中，在植物使用扦插法繁殖时使用。它也可用于植物组织培养。其是广谱型植物生长调节剂，能促进细胞分裂与扩大，诱导形成不定根增加座果，防止落果，改变雌、雄花比率等。可经叶片、树枝的嫩表皮，种子进入到植株内，随营养流输导到全株。塞苯隆，英文通用名thidiazuron，其他名称：脱叶灵、脱叶脲、Dropp、TDZ，是一种新型高效的细胞分裂素用于组培能更好的促进植物的芽分化。本发明将上述3种激素以特定比例添加到MS培养基中，制得分化培养基、继代培养基和生根培养基，对大花月季外植体进行组织培养时，可显著提高大花月季的诱导分化率、增殖系数及生根率，效果好于现有报道的培养基种类。优选地，本发明提供的分化培养基为：含有1.0mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、0.1～0.3mg/LTDZ、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的MS培养基；继代培养基为：含有1.0mg/L6-BA、0.3mg/LNAA、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的MS培养基；生根培养基为：含有0.6mg/LNAA、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的MS培养基。更优选地，分化培养基为：含有1.0mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、0.2mg/LTDZ、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的MS培养基；继代培养基为：含有1.0mg/L6-BA、0.3mg/LNAA、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的MS培养基；生根培养基为：含有0.6mg/LNAA、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的MS培养基。本发明还提供了一种大花月季的组织培养方法，包括如下步骤：将大花月季外植体接种到分化培养基，诱导带腋芽的外植体分化；待腋芽长至4～6cm，切成带腋芽的茎段，转接到继代培养基进行继代培养；待外植体粗壮后转接到生根培养基进行生根培养，得到组培苗；分化培养基为：含有0.5～2.0mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、0.1～0.3mg/LTDZ、20～30g/L蔗糖和7～8g/L琼脂的MS培养基，pH值为5.8；继代培养基为：含有1.0mg/L6-BA和0.1～0.5mg/LNAA、20～30g/L蔗糖和7～8g/L琼脂的MS培养基，pH值为5.8；生根培养基为：含有0.2～1.0mg/LNAA、20～30g/L蔗糖和7～8g/L琼脂的MS培养基，pH值为5.8。优选地，本发明提供的分化培养基为：含有1.0mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、0.1～0.3mg/LTDZ、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的MS培养基；继代培养基为：含有1.0mg/L6-BA、0.3mg/LNAA、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的MS培养基；生根培养基为：含有0.6mg/LNAA、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的MS培养基。更优选地，分化培养基为：含有1.0mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、0.2mg/LTDZ、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的MS培养基；继代培养基为：含有1.0mg/L6-BA、0.3mg/LNAA、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的MS培养基；生根培养基为：含有0.6mg/LNAA、30g/L蔗糖和7g/L琼脂的MS培养基。在本发明提供的一些实施例中，将大花月季外植体接种到分化培养基之前还包括：采取大花月季枝条进行消毒处理，切成1～1.5cm的带腋芽的茎段，得到大花月季外植体。作为优选，大花月季外植体的采取时间为每年4月上旬至5月上旬。采摘的时间早，外植体太嫩，后期组培瓶苗长势弱，采摘时间晚，外植体木质化，接种后易长菌且生长缓慢。作为优选，大花月季外植体选择幼嫩的枝条，避免采取花芽、腋芽已经开始分化的外植体。作为优选，消毒处理具体为：将大花月季枝条用水和NaClO溶液清洗，然后用酒精和HgCl溶液消毒，再用水清洗。作为优选，NaClO溶液的质量百分浓度0.1％，浸泡时间为30min；酒精的体积百分浓度为75％，酒精消毒的时间为2min；HgCl溶液的质量百分浓度为0.1％，HgCl溶液的消毒时间为30s。作为优选，大花月季组织培养的光照周期为12h/d，光照强度为2500～3500lx，培养温度为24～26℃，相对湿度为45％～50％，每3d用紫外灯灭菌10～15min。优选地，大花月季组织培养的光照周期为12h/d，光照强度为3500lx，培养温度为25℃，相对湿度为65％，每3d用紫外灯灭菌15min。作为优选，得到组培苗后还包括炼苗的步骤。在本发明提供的实施例中，炼苗为：取出组培苗，洗掉根部附着的培养基，晾干水分后栽植至培养土中，喷施含有多菌灵和代锌蒙森混合液，放置背光处，覆膜保湿，保持温度在15～20℃之间；待长出新叶后将苗挪至向阳处，并逐渐去掉覆膜，30d后转入正常养护。本发明提供了一种大花月季组织培养的培养基及方法。该大花月季组织培养的培养基包括分化培养基、继代培养基和生根培养基；分化培养基为：含有0.5～2.0mg/L6-BA、0.1mg/LNAA、0.1～0.3mg/LTDZ、20～30g/L蔗糖和7～8g/L琼脂的MS培养基，pH值为5.8；继代培养基为：含有1.0mg/L6-BA和0.1～0.5mg/LNAA、20～30g/L蔗糖和7～8g/L琼脂的MS培养基，pH值为5.8；生根培养基为：含有0.2～1.0mg/LNAA、20～30g/L蔗糖和7～8g/L琼脂的MS培养基，pH值为5.8。本发明至少具有如下优势之一：采用本发明提供的培养基配方可显著提高大花月季的诱导分化率、外植体增殖系数及生根率，利用植物组织培养的方法，使具有优良性状的大花月季得以快速繁殖；本发明首次对大花月季的取材及消毒方法进行了改进，降低了接种的污染率。具体实施方式本发明公开了一种大花月季组织培养的培养基及方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本
发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本发明提供的大花月季组织培养的培养基及方法中所用培养基组分均可由市场购得。6-BA是6-苄氨基腺嘌呤，细胞分裂素，称0.1g6-BA溶于20ml1mol/L的NaOH中，再用容量瓶定容到100ml，倒到瓶中，放在冰箱备用；NAA是萘乙酸，0.1gNAA溶于20ml水中，再用容量瓶定容到100ml，倒到瓶中，放在冰箱备用；TDZ是噻苯隆，植物生长调节剂，具有很强的细胞分裂素活性，称0.1gTDZ溶于20ml1mol/L的NaOH中，完全溶解后再用容量瓶定容到100ml，倒到瓶中，放在冰箱备用。上述三种激素都可以高温蒸汽灭菌。下面结合实施例，进一步阐述本发明：实施例11、生长环境(1)采用MS固体培养基，其中再加琼脂质量浓度7g/L，蔗糖质量浓度30g/L，pH值为5.8，所配培养基经过高压高温蒸汽灭菌(温度126℃，0.145MPa，5min)。(2)组培室，光照时间12h/d，光照强度3500lx，培养温度为25℃，相对湿度65％，每3d用紫外灯灭菌15min。MS培养基高压蒸汽灭菌时，采用温度126℃，5min，不同于传统的121℃，30min。经过此法灭菌的培养基在经过7天的光照培养箱(38℃，无光照)培养后，发现并未出现菌落。证明此种条件下，完全可以达到灭菌效果。试验所用灭菌锅功率为2kw，对比传统方法节省时间0.5h，每次灭菌可节省1度电。2、大花月季外植体的采取(1)采取时间为3月20日到5月31日之间。(2)采取时，选择幼嫩无病虫害的枝条。(3)避免采取顶芽是花芽的或者侧芽是花芽的外植体，腋芽已经开始分化的外植体也不要。外植体采集时间的确认，本申请从3月20日开始到5月31日进行连续接种试验，以下是大花月季接种后第5天的染菌情况：表1大花月季接种后第5天的染菌情况从表中可以看出，在4月1日到5月10日这期间的大花月季带腋芽的茎段接种后，染菌率在5％以下，且通过观察，大花月季组培苗长势快，且后期生长良好。3、正常环境的清洗杀菌(1)大花月季外植体采回后，摘去叶片，留下腋芽，茎上皮刺不需做其他处理。(2)将大花月季切成带腋芽的小段。(3)外植体用双层纱布包住，在流水下冲洗30min。(4)之后在0.1％NaClO中浸泡30min。4、无菌环境中消毒杀菌(1)外植体在无菌工作台内用75％酒精浸泡2min，这之间要不停的晃动。(2)之后用0.1％HgCl消毒30s。(3)消毒完成后，用无菌水冲洗6遍，每次浸泡时间要求长于3min。用此种方法消毒，0.1％NaClO、75％酒精、0.1％HgCl等消毒液可反复利用，出现明显浑浊物时重新配置。5、大花月季的接种(1)在无菌工作台内，将消毒好的大花月季带腋芽外植体下端切掉，切成1-1.5cm的小段。(2)将切好的小段接种到固体培养基中，每瓶1个外植体。6、培养基的选择(1)诱导带腋芽的外植体分化时，用MS+6-BA0.5～2.0mg/L+NAA0.1mg/L+TDZ0.1～0.3mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8的培养基。诱导带腋芽的外植体分化时，采用MS培养基，6-BA的浓度分别取0.5mg/L、1.0mg/L、1.5mg/L、2.0mg/L，TDZ分别取0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L，NAA加0.1mg/L，外植体接到以上12种培养基中后，每5天观察记录生长情况，以下是25d后的生长状况：表2诱导带腋芽的外植体分化后的生长状况处理1234567891011126-BA(mg/L)0.50.50.51.01.01.01.51.51.52.02.02.0TDZ(mg/L)0.10.20.30.10.20.30.10.20.30.10.20.3茎长(cm)3.22.43.75.65.86.34.74.94.15.14.94.6增殖系数1116.77.67.1111111大花月季外植体接在MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+TDZ0.1～0.3mg/L的培养基上生长最好，由于培养基中加入了TDZ，在诱导分化时，其中MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+TDZ0.2mg/L的增殖系数出现高达7.6的情况。(2)待腋芽长至4～6cm时，约25天左右，将芽切下来，再切成带腋芽的小段，用继代培养基MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1～0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8。继代培养基采用MS培养基，6-BA1.0mg/L，NAA取0.1mg/L、0.2mg/L、0.3mg/L、0.4mg/L、0.5mg/L，经过20d的培养，观察茎段粗度为：表3继代培养20d的茎段粗度处理12345NAA(mg/L)0.10.20.30.40.5茎段粗度(cm)0.50.61.20.80.4可见MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.3mg/L的茎段最粗，为1.2cm。(3)约20d后，等外植体粗壮后转入生根培养基MS+NAA0.2～1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.80中培养，长出须根后，即可进入炼苗期。生根培养时，用传统的1/2MS+NAA0.1～0.5mg/L、1/2MS+IBA0.1～0.5mg/L培养基时，大花月季组培苗会出现叶片干枯掉落，经过30d观察，发现没有生根的现象。本技术用MS+NAA0.2～1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8，做生根培养基，NAA分别取0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L、0.8mg/L、1.0mg/L，经过20d的培养观察，试验结果如下：表4生根培养试验结果处理12345NAA(mg/L)0.20.40.60.81.0生根率(％)27％85％100％72％10％上述试验结果表明，配方为MS+NAA0.6mg/L，生根率达100％，叶片正常生长，且茎段下能长出根原基，正常长出5～7条须根。7、炼苗取出大花月季组培苗，洗掉根部附着的培养基，晾干水分后栽植至培养土中，喷施含有多菌灵和代锌蒙森混合液，放置背光处，覆膜保湿，保持温度在15～20℃之间；待长出新叶后将苗挪至向阳处，并逐渐去掉覆膜，30d后转入正常养护。实施例21、生长环境(1)采用MS固体培养基，其中再加琼脂质量浓度7g/L，蔗糖质量浓度30g/L，pH值为5.8，所配培养基经过高压高温蒸汽灭菌(温度126℃，0.145MPa，5min)。(2)组培室，光照时间12h/d，光照强度3500lx，培养温度为25℃，相对湿度65％，每3d用紫外灯灭菌15min。MS培养基高压蒸汽灭菌时，采用温度126℃，5min，不同于传统的121℃，30min。经过此法灭菌的培养基在经过7天的光照培养箱(38℃，无光照)培养后，发现并未出现菌落。证明此种条件下，完全可以达到灭菌效果。试验所用灭菌锅功率为2kw，对比传统方法节省时间0.5h，每次灭菌可节省1度电。2、大花月季外植体的采取(1)采取时间为4月10日。(2)采取时，选择幼嫩无病虫害的枝条。(3)避免采取顶芽是花芽的或者侧芽是花芽的外植体，腋芽已经开始分化的外植体也不要。3、正常环境的清洗杀菌(1)大花月季外植体采回后，摘去叶片，留下腋芽，茎上皮刺不需做其他处理。(2)将大花月季切成带腋芽的小段。(3)外植体用双层纱布包住，在流水下冲洗30min。(4)之后在0.1％NaClO中浸泡30min。4、无菌环境中消毒杀菌(1)外植体在无菌工作台内用75％酒精浸泡2min，这之间要不停的晃动。(2)之后用0.1％HgCl消毒30s。(3)消毒完成后，用无菌水冲洗5-6遍，每次浸泡时间要求长于3min。用此种方法消毒，0.1％NaClO、75％酒精、0.1％HgCl等消毒液可反复利用，出现明显浑浊物时重新配置。5、大花月季的接种(1)在无菌工作台内，将消毒好的大花月季带腋芽外植体下端切掉，切成1-1.5cm的小段。(2)将切好的小段接种到固体培养基中，每瓶1个外植体。6、培养基的选择(1)诱导带腋芽的外植体分化试验组1：MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+TDZ0.1mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8；试验组2：MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+TDZ0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8；试验组3：MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L+TDZ0.3mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8；对照组1：MS+NAA0.1mg/L+GA31.0mg+TDZ1.0mg/L+30g/L葡萄糖+3.0g/L植物凝胶，pH5.8；(CN102422815A中实施例4公开的分化培养基)对照组2：MS+6-BA0.8mg/L+NAA0.1mg/L+1.5％的蔗糖+0.75％琼脂；(CN105309306A中实施例1公开的分化培养基)外植体接到上述培养基中后，每5天观察记录生长情况，以下是25d后的生长状况：表5诱导带腋芽的外植体分化后的生长状况组别茎长(cm)增殖系数试验组15.66.7试验组25.87.6试验组36.37.1对照组12.35.6对照组24.16.2大花月季外植体接在试验组1～3的培养基上生长最好，且增殖系数较对照组两个较高。(2)待腋芽长至4～6cm时，约25天左右，将芽切下来，再切成带腋芽的小段，用继代培养基培养。试验组1：MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.3mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8；对照组1：MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.02mg/L+GA30.3mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6.2g/L，pH值6.0；(CN102422815A中实施例4公开的继代培养基)对照组2：MS+IBA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+1.5％的蔗糖+0.75％琼脂；(CN105309306A中实施例1公开的继代培养基)经过20d的培养，观察大花月季茎段粗度为：表6继代培养20d的增殖系数组别茎段粗度(cm)试验组11.2对照组10.8对照组21.0可见试验组1的茎段粗度最粗，为1.2cm。(3)约20d后，等外植体粗壮后转入生根培养基培养，长出须根后，即可进入炼苗期。试验组1：MS+NAA0.6mg/L+蔗糖30g/L+琼脂7g/L，pH5.8；对照组1：1/2MS+NAA0.2mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6.5g/L，pH值6.1；(CN102422815A中实施例4公开的生根培养基)对照组2：1/2MS+1.5％的蔗糖+0.75％琼脂+0.5g/L活性炭；(CN105309306A中实施例1公开的生根培养基)经过20d的培养观察，试验结果如下：表7生根培养试验结果组别生根率(％)试验组1100对照组117对照组223上述试验结果表明，试验组1的生根率达100％，叶片正常生长，且茎段下能长出根原基，正常长出5～7条须根。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。当前第1页1 2 3