本发明属于植物转化领域，具体涉及一种提高小麦幼胚出芽率的方法及其培养基配方。
背景技术：
小麦是最后一个转化成功的重要禾谷类粮食作物，一方面由于小麦属于六倍体作物，遗传背景复杂，基因组相对较大(约17Gb)，是玉米的7倍，水稻的40倍；另一方面，小麦遗传转化过程中DNA导入频率低且转化后再生能力不高，有较强的基因型依赖性。自1992年成功获得第一例转基因小麦以来，人们尝试利用多种转化方法和多种外植体转化小麦，转化方法包括农杆菌、基因枪、花粉管通道、超声波法、离子束注入法、激光微束穿刺法和PEG法等，外植体包括幼胚、成熟胚、花药愈伤组织和幼穗等，在降低转化的基因型依赖性、提高转化效率等方面取得了一定的进展，但普遍存在的问题是转化效率仍然很低，难以实现规模化。
本发明对提高小麦幼胚出芽率的方法进行了探索，并建立了高效的小麦幼胚培育体系，为后续小麦功能基因组学的研究和小麦分子育种，具有重要的意义。
技术实现要素：
本发明提供了一种提高小麦幼胚胚性愈伤产生率的培养基配方和组织培养方法。本发明所提供的提高小麦幼胚胚性愈伤产生率的方法，在预培养阶段，可以有效的提高幼胚产生胚性愈伤的效率，本发明提供了一种小麦幼胚胚性愈伤诱导培养基MSV4，可以提高小麦幼胚胚性愈伤的诱导率，其特征在于所述诱导培养基含有终浓度为0.027mM的甘氨酸，0.1～2.57mM的谷氨酰胺，50～500mg/L的水解酪蛋白和0.5～52mg/L的Dicamba。
在上述诱导培养基中，还包含MS大量元素、微量元素、铁盐和B5的维生素。
更具体的，本发明提供了一种小麦幼胚胚性愈伤诱导培养基，所述诱导培养基的组成组分是：CaCl2 2.99mM，KNO3 18.79mM，NH4NO3 20.61mM，KH2PO41.25mM，MgSO4 1.50mM，MnSO4 1mM，ZnSO4 26～30μM，H3BO3 81～100μM，KI 4.5～5μM，NaMoO4 1μM，CuSO4 0.1μM，CoCl6 0.1μM，FeSO4 100μM，Na2-EDTA 100μM，烟酸4.1～8μM，肌醇0.56mM，盐酸硫胺素0.3～30μM，盐酸吡哆醇2.4～4.9μM，甘氨酸0.027mM，谷氨酰胺0.1～2.57mM，水解酪蛋白50～500mg/L，Dicamba 0.5～52mg/L，蔗糖30g/L，pH5.8，phytagel 4g/L。
本发明还提供了一种上述诱导培养基的制备方法，包括以下步骤：按上述配方将各组分添加到MS基础培养基中，在高温灭菌完冷却后，再加入Dicamba 2mg/L。更具体的，其中所述的高温灭菌的一般条件是121℃，20min。
本发明还提供了一种提高小麦幼胚胚性愈伤率的组织培养方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
a)采集小麦授粉后的小麦幼胚；
b)将小麦幼胚在含有终浓度为0.027mM的甘氨酸、0.1～2.57mM的谷氨酰胺、50～500mg/L的水解酪蛋白和0.5～52mg/L的Dicamba的诱导培养基上进行预培养。
其中所述的小麦幼胚为小麦授粉后12-16天、直径为0.8-1.5mm的幼胚。在小麦授粉12-16天后，将小麦穗子上的未成熟种子放入灭菌三角瓶中加入75％乙醇摇洗1min，灭菌水洗三次；加入1％硝酸银，放入摇床中170rpm震荡15min，最后用灭菌水冲洗3-4次。再采集未成熟种子中的幼胚。
更具体地，在预培养阶段，是将幼胚盾片向上的接种于培养基上，预培养的时间是6-8天。发明人在研究过程中发现，在小麦幼胚转化的预培养阶段，将幼胚接种于培养基上时可以有不同的放置方向，盾片向上或盾片向下，发明人通过对幼胚不同放置方向产生胚性愈伤的效率进行比较，结果发现，盾片向上产生胚性愈伤的比例为22％，而盾片向下产生胚性愈伤的比例为0，尤其说明在小麦幼胚转化的预培养阶段，将盾片向上放置在培养基上，可以有效的提高胚性愈伤的产生效率，从而提高小麦转化的效率。
本发明所提供的组织培养方法，适用于所有小麦品种，所述小麦品种包括但不限于扬麦158、中国春、济麦22、京冬18、川农16、宁春4号、科农199和CB037。
更具体地，在上述组织培养方法中，其中所述的MSV4诱导培养基的组成成分是：CaCl2 2.99mM，KNO3 18.79mM，NH4NO3 20.61mM，KH2PO4 1.25mM，MgSO4 1.50mM，MnSO4 1mM，ZnSO4 26～30μM，H3BO3 81～100μM，KI 4.5～5μM，NaMoO4 1μM，CuSO4 0.1μM，CoCl6 0.1μM，FeSO4 100μM，Na2-EDTA 100μM，烟酸4.1～8μM，肌醇0.56mM，盐酸硫胺素0.3～30μM，盐酸吡哆醇2.4～4.9μM，甘氨酸0.027mM，谷氨酰胺0.1～2.57mM，水解酪蛋白50～500mg/L，Dicamba 0.5～52mg/L，蔗糖30g/L，pH5.8，phytagel 4g/L。将三个小麦品种(科农199、CB037、扬麦158)用MSV4培养基预培养6-8天的幼胚的出芽率分别是57.4％、81.7％和44.1％。
本发明使用现有技术中公开的诱导培养基MSV5进行幼胚培育，溶剂为水，MSV5的组成成分是：CaCl2 2.99mM，KNO3 18.79mM，NH4NO3 20.61mM，KH2PO4 1.25mM，MgSO4 1.50mM，MnSO4 1mM，ZnSO4 26μM，H3BO3 81μM，KI 4.5μM，NaMoO4 1μM，CuSO4 0.1μM，CoCl6 0.1μM，FeSO4 100μM，Na2-EDTA 100μM，烟酸4.1μM，肌醇0.56mM，盐酸硫胺素0.3μM，盐酸吡哆醇2.4μM，L-谷氨酰胺2.57mM，L-脯氨酸0.65mM，L-天门冬酰胺0.38mM，蔗糖90g/L，pH5.8，phytagel 4g/L,121℃，20min，灭菌后加入2,4-D 0.5mg/L，AgNO3 10mg/L。以上各浓度均为相应物质在所述MSV5培养基中的终浓度。本发明将三个小麦品种(科农199、CB037、扬麦158)用MSV5培养基预培养6-8天的幼胚的出芽率分别是19.6％、25.4％和19.6％。说明本发明所提供的MSV4培养基可以更好的提高小麦幼胚的胚性愈伤率，从而提高小麦幼胚培育的出芽率。
综合而言，本发明通过提供一种MSV4培养基，使小麦幼胚的胚性愈伤产生率明显提高，这对于利用基因工程途径和细胞工程途径改良优良小麦品种具有重要意义。
附图说明
图1是不同培养基和预培养时间的比较。A、B是小麦品种科农199，C、D是小麦品种CB037，E、F是小麦品种扬麦158。A、C、E是培养基MSV4上预培养6-8天，B、D、F是MSV5培养基上预培养2天。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用化学试剂均购自SIGMA公司，小麦材料CB037从中国农业科学院作物科学研究所获得。
实施例1.培养基的准备
本发明中用到的培养基配方如下所示。
诱导培养基MSV4：CaCl2 2.99mM，KNO3 18.79mM，NH4NO3 20.61mM，KH2PO4 1.25mM，MgSO4 1.50mM，MnSO4 1mM，ZnSO4 30μM，H3BO3 100μM，KI 5μM，NaMoO4 1μM，CuSO4 0.1μM，CoCl6 0.1μM，FeSO4 100μM，Na2-EDTA100μM，烟酸8μM，肌醇0.56mM，盐酸硫胺素30μM，盐酸吡哆醇4.9μM，甘氨酸0.027mM，谷氨酰胺0.2mM，水解酪蛋白250mg/L，蔗糖30g/L，pH5.8，phytagel 4g/L，121℃，20min，灭菌后加入Dicamba3mg/L。
诱导培养基MSV5：CaCl2 2.99mM，KNO3 18.79mM，NH4NO3 20.61mM，KH2PO4 1.25mM，MgSO4 1.50mM，MnSO4 1mM，ZnSO4 26μM，H3BO3 81μM，KI 4.5μM，NaMoO4 1μM，CuSO4 0.1μM，CoCl6 0.1μM，FeSO4 100μM，Na2-EDTA 100μM，烟酸4.1μM，肌醇0.56mM，盐酸硫胺素0.3μM，盐酸吡哆醇2.4μM，L-谷氨酰胺2.57mM，L-脯氨酸0.65mM，L-天门冬酰胺0.38mM，蔗糖90g/L，pH5.8，phytagel 4g/L,121℃，20min，灭菌后加入2,4-D 0.5mg/L，AgNO3 10mg/L。
实施例2.幼胚的预培养
采集小麦授粉后12-16天、直径为0.8-1.5mm的小麦幼胚进行预培养。预培养的目的是使幼胚在激素作用下脱分化产生愈伤，所产生的愈伤可以作为基因枪轰击的真正受体。幼胚脱分化所产生的愈伤又分为胚性愈伤和非胚性愈伤，只有胚性愈伤才能够在激素作用下再分化成完整植株，因此高的胚性愈伤产生率是高转化效率的基础。
具体地，在小麦授粉12-16天后，将小麦穗子上的未成熟种子放入灭菌三角瓶中加入75％乙醇摇洗1min，灭菌水洗三次；加入1％硝酸银，放入摇床中170rpm震荡15min，最后用灭菌水冲洗3-4次。再采集未成熟种子中的幼胚。幼胚接种于培养基上时可以有不同的放置方向(盾片向上和盾片向下)，发明人对幼胚不同放置方向产生胚性愈伤的效率进行了比较，结果如表1所示，盾片向上产生胚性愈伤的比例为22％，而盾片向下产生胚性愈伤的比例为0，因此，在后续实验中发明人都采取幼胚盾片向上的方式进行预培养。预培养的培养条件具体可为：
表1.幼胚预培养时不同放置方向出愈率比较
幼胚预培养时采用不同培养基和不同培养时间所产生的胚性愈伤再分化比例即出芽率也有所不同。本发明中，出芽率高的愈伤证明胚性愈伤的比例也高。发明人在三个小麦品种(科农199、CB037、扬麦158)中，就两种培养基和两个培养时间进行了对比，结果如表2和图1所示，用MSV4培养基预培养6-8天的幼胚的出芽率远高于用MSV5培养基预培养2天的幼胚的出芽率。说明本发明所提供的诱导培养基可以有效的提高小麦幼胚产生胚性愈伤的比率。
表2.不同培养基和预培养时间的比较