一种大麦花药分化培养基配方的制作方法

文档序号：12084536阅读：486来源：国知局

本发明涉及一种大麦花药分化培养基配方，具体涉及一种可以显著提高大麦花药愈伤组织分化率、降低白化率的花药分化培养基配方，属于农业高新技术领域。

背景技术：

大麦属禾本科大麦属一年生谷类植物，是一种主要的粮食和饲料作物，有30多个种，只有普通大麦（horderm vulgare L.）一个种具有栽培价值，包括二棱、多棱和中间型大麦3个亚种。作为工农业生产的重要谷类作物，全球现种植大麦6100多万hm²，总产量约1.7亿吨，面积和总产仅次于小麦、水稻、玉米，为第四大谷物。许多发达国家对大麦生产特别重视，这是与其发展啤酒工业和畜牧业，以提高人民生活质量相适应的。世界大麦面积分布依次为欧洲占50%以上，亚洲占20%～25%，美洲10%～15%，非洲占6%左右，大洋洲占5%左右。

大麦栽培历史悠久，是第一个被驯化的谷类作物。据考证，早在新石器时代中期，古羌族（居住在青海）就已在黄河上游开始栽培，距今已有5000年的历史。由于大麦具有早熟、耐旱、耐盐、耐低温冷凉、耐瘠薄等特点，因此栽培非常广泛。椐统计，我国大麦种植面积在20世纪30年代曾达到9570万亩，总产85亿公斤；50年代，面积缩小到5809万亩，总产34.5亿公斤；70年代，面积又扩增到9750万亩，总产99亿公斤，每亩产量101.5公斤；现已缩减到1500万亩，每亩产量266公斤，主要产区集中在长江流域、黄河流域和青藏高原。

近20年来我国啤酒工业发展迅速，现已成为世界第一啤酒生产大国，由于我国优质啤酒专用大麦品种选育研究滞后于啤酒工业的迅速发展，以及啤麦生产方式及设备等因素，我国的啤酒原料因质量问题而主要依赖进口。我国成为啤酒大麦的第一进口国，目前我国进口啤麦量占世界啤麦进口贸易量的一半以上，占我国啤麦需求的60%左右。由于全球啤酒工业的发展和大麦原料的紧缺，再加国外水、旱和病虫害的影响，大麦进口极不稳定，国内企业易受国外价格的冲击，我国啤酒业今后将面临涨价的压力。因此，努力实现啤酒原料国产化，对于促进我国啤酒工业的稳定发展具有十分重要的意义。

大麦籽粒的粗蛋白和可消化纤维均高于玉米，是牛、猪等家畜、家禽的好饲料。欧洲、北美的发达国家和澳大利亚，都把大麦作为牲畜的主要饲料。用大麦喂猪，在育肥期增加饲料中的大麦的比例，可使猪肉脂肪硬度大，熔点高，瘦肉多，肉质好。大麦还可以做青贮饲料，在灌浆期收割切段青储，是奶牛的好饲料。

我国南方各省饲料严重紧缺，每年从北方调入上千万吨玉米与豆粕等原料来弥补缺口，或直接以稻谷替代。在我国饲料工业中，近几年大麦型配合饲料所必需的β-葡聚糖酶等饲料添加剂的研制与生产已取得成功的突破，大麦型配合饲料开始在我国南方进入快速发展阶段。选育优质、高产饲料专用大麦新品种和建立饲麦生产基地等产业化网络，利用南方大片冬闲地、海涂盐碱地大力发展饲麦生产，对于解决我国南方地区饲料的供需矛质，促进该地区畜牧渔业的发展将发挥重大作用。尽管目前我国的大麦生产处于低谷阶段，但是从国内对大麦的巨大需求和充分利用我国有限的土地资源这两个重要的国情分析，我国的大麦生产应该和必将会得到迅速发展，大麦仍然是我国最具有发展潜力的谷物。

大麦新品种选育中应用单倍体技术可以简化和加速育种程序，缩短育种时间5年左右，因而受到国内外育种家的青睐。早在1971年和1973年Clapham就报道首次得到了大麦花药愈伤组织和花粉植株。自此，大麦花药培养技术受到各国学者的普遍重视，花粉植株不仅是遗传研究的良好群体，而且对单倍体育种也有实践意义。现在花药培养集成了杂交育种、诱变育种、细胞学、遗传学等各种生物科学的内容，是大麦育种学发展的趋势之一。

过去几十年的育种改良过程中，我国大麦育种目标从提高产量到提升品质，有了很大的改变。我国大麦花药培养在供体植株生长条件、花药预处理方法、培养基成分和培养条件等进行了一系列的研究，使培养效率有了较大的提高，利用花药培养技术成功育成了品种“单二”和“花30”和一些高产优质新品系。

然而，迄今为止，大麦花药培养的去分化和分化频率仍然较低，加之各基因型之间的差异很大，从而限制了该技术在育种上的应用。因此，进一步提高大麦花药离体培养效率有非常重要的科学价值和实践意义。影响大麦花药培养效果的因索是多种多样的，既包括由植株本身所决定的从基因型差异、花药的发育时期及供体植株的生理状态等内在条件；也包括基本培养基成分、激素及培养温度等外界因素。从花培育种角度考虑，对于优良品种的改良和培育，往往需要从大量的花培后代中筛选优良家系，需要更大规模的培育花培子代，所以改善培养条件、提高花培效率是花培育种的最现实的需求。

在大麦花培程序中，愈伤组织分化是大麦花药培养过程的第二步，花药愈伤组织分化率和白化率水平极大的影响着花药培养的效率。因此，组合和优化培养基组分，摸索出实用的大麦花药诱导、分化培养基配方是实现大麦花培苗的关键。通过多年大麦花药培养的摸索和实践，我们进一步优化了基本培养基配方，并且不断尝试加入一些提高大麦花药愈伤分化率和降低白化率的有机添加物并组合其种类搭配及浓度，最终摸索出了一种大麦花药分化培养基配方，进一步提高了大麦花药培养的效率。我们的研究结果对大麦单倍体育种和大麦花药培养技术在遗传转化中的应用具有较大的实用价值。

技术实现要素：

本发明提供了一种大麦花药分化培养基，该培养基的配方如下：

KNO₃ 1800～2000mg/L， NH₄NO₃ 1500～1800mg/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺 450～550mg/L，KH₂PO₄ 160～180mg/L，CaCl₂∙2H₂O 420～460mg/L，MgSO₄∙7H₂O 350～390mg/L，Na₂-EDTA 35～40mg/L，FeSO₄∙7H₂O 26～29mg/L，MnSO₄∙4H₂O 20～25mg/L，ZnSO₄∙7H₂O 8～9mg/L，H₃BO₃ 5.5～7.0mg/L，KI 0.7～0.9mg/L，CuSO₄∙5H₂O 0.02～0.03mg/L，Na₂MoO₄∙2H₂O 0.2～0.3mg/L，CoCl₂∙6H₂O 0.02～0.03mg/L，甲基亚硝基脲 0.7～0.9mg/L，肌醇 90～110mg/L，甘氨酸 1.8～2.2mg/L，丙氨酸 0.55～0.65mg/L，叶酸 0.45～0.55mg/L，维生素B1 0.35～0.45mg/L，维生素B6 0.45～0.55mg/L，烟酸 0.45～0.55mg/L，蔗糖 23～27g/L，琼脂 7～8g/L；

KT 1.8～2.2mg/L，NAA 0.45～0.55mg/L，调环酸钙0.35～0.45mg/L，水解蛋白 0.9～1.1g/L，秋水仙碱 0.25～0.35mg/L，山梨醇 23～27g/L，生物素 0.09～0.11mg/L，PH 5.6～6.0。

本发明所述的培养基具有显著提高大麦花药愈伤组织分化率、降低白化率的优点，从而大大提高了大麦花药培养的效率。下面的实施例以及对比实验可以清楚地反映本发明所述培养基的特点。

具体实施方式

实施例1

配制如下配方的培养基：

KNO₃ 1900mg/L， NH₄NO₃ 1650mg/L，2-氨基-5-羧基戊酰胺 500mg/L，KH₂PO₄ 170mg/L，CaCl₂∙2H₂O 440mg/L，MgSO₄∙7H₂O 370mg/L，Na₂-EDTA 37.5mg/L，FeSO₄∙7H₂O 27.5mg/L，MnSO₄∙4H₂O 22.5mg/L，ZnSO₄∙7H₂O 8.5mg/L，H₃BO₃ 6.25mg/L，KI 0.8mg/L，CuSO₄∙5H₂O 0.025mg/L，Na₂MoO₄∙2H₂O 0.25mg/L，CoCl₂∙6H₂O 0.025mg/L，甲基亚硝基脲 0.8mg/L，肌醇 100mg/L，甘氨酸 2.0mg/L，丙氨酸 0.6mg/L，叶酸 0.5mg/L，维生素B1 0.4mg/L，维生素B6 0.5mg/L，烟酸 0.5mg/L，蔗糖 25g/L，琼脂 7.5g/L；

KT 2.0mg/L，NAA 0.5mg/L，调环酸钙0.4mg/L，水解蛋白 1.0g/L，秋水仙碱 0.3mg/L，山梨醇 25g/L，生物素 0.1mg/L，PH 5.8。

选取大麦品种甘啤3号和金川3号作为花药培养供体，供体材料于2011年秋季大田播种，2012年春季取中部小花小孢子发育处于单核靠边期的花药诱导培养，花药愈伤组织产生后，挑选直径为6～10毫米大小的愈伤组织接种于该分化培养基上诱导绿苗，培养条件控制为：温度26℃、湿度75%、光照3000lx l4h/暗10h，绿苗产生后（长到2cm左右），计算愈伤组织分化率和白化苗率。绿苗分化率（%）=分化绿苗数/转移的愈伤块数×100%（本文所述的分化率除特别指明均认为是绿苗分化率）；白化苗率（%）=白化苗数/转移的愈伤块数×100%。

实施例2

配制如下配方的培养基（2-氨基-5-羧基戊酰胺添加浓度的优选）：

KNO₃ 1900mg/L， NH₄NO₃ 1650mg/L，KH₂PO₄ 170mg/L，CaCl₂∙2H₂O 440mg/L，MgSO₄∙7H₂O 370mg/L，Na₂-EDTA 37.5mg/L，FeSO₄∙7H₂O 27.5mg/L，MnSO₄∙4H₂O 22.5mg/L，ZnSO₄∙7H₂O 8.5mg/L，H₃BO₃ 6.25mg/L，KI 0.8mg/L，CuSO₄∙5H₂O 0.025mg/L，Na₂MoO₄∙2H₂O 0.25mg/L，CoCl₂∙6H₂O 0.025mg/L，甲基亚硝基脲 0.8mg/L，肌醇 100mg/L，甘氨酸 2.0mg/L，丙氨酸 0.6mg/L，叶酸 0.5mg/L，维生素B1 0.4mg/L，维生素B6 0.5mg/L，烟酸 0.5mg/L，蔗糖 25g/L，琼脂 7.5g/L；

KT 2.0mg/L，NAA 0.5mg/L，调环酸钙0.4mg/L，水解蛋白 1.0g/L，秋水仙碱 0.3mg/L，山梨醇 25g/L，生物素 0.1mg/L，PH 5.8。

2-氨基-5-羧基戊酰胺的添加浓度设置以下7种：0；100mg/L；200mg/L；300mg/L；400mg/L；600mg/L；700mg/L。