本发明属于海藻良种培育技术领域，具体涉及一种北方海区海带品种提纯的方法。
背景技术：
海带是我国养殖量最大的海藻，其产业在渔业产业经济中占有重要比例。从上个世纪60年代，我国就开展了海带品种培育工作，培育了一系列良种，为海带产业发展提供了良好的基础。但由于目前海带保种还主要依靠海上选种、室内混采孢子育苗和海上混杂养成的方法，同时由于连续自交及近交造成隐性基因的表达，海区环境的变化等原因，无法保证品种性状的稳定，导致新品种推广生产后没几年就严重混杂，新品种不能持续发挥应有的作用，使用寿命大大缩短。基于此问题，本专利提供了一种方法解决这个问题。
技术实现要素：
本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中存在的不足，而提供一种北方海区海带品种提纯的方法，目的在于解决北方海带养殖区生产上海带良种混杂、退化问题，对海带原良种提纯选优。
为了实现上述发明目的，本发明采用如下技术方案：
一种北方海区海带品种提纯方法，包括以下步骤：
(1)海带单株选择：
在海带收获开始期，根据海带的原良种标准特征在海上选择至少60株形态一致的优良单株，然后将优良单株的假根修剪掉，并取其梢部较嫩的部分做分子标记分析，以室内保存的海带品种配子体的AFLP图谱为标准，选择与配子体图谱一致的海带单株作为种菜；种菜夹于养殖苗绳上单独放在固定海区暂养，1-2个月后，根据品种特征再筛选种菜，剔除形态特征不符合的种菜，保留15-20株将符合要求的种菜；将最终符合要求的种菜切掉梢部和边缘的腐烂处、保留基部藻体1.5m；将基部藻体绑到苗绳上，挂到浮筏上放在海区培育；培育至基部藻体的伤口伤愈且其孢子囊成熟，该藻体为具备典型原良种特征的种海带；
(2)海带单株采苗：
将步骤(1)得到的种海带运至育苗场中，将育苗池分成多个独立的小单元，每个单元称为育苗单元；每个育苗单元中放置有提前处理过的育苗帘，种海带置于育苗单元中、且在8-9℃的过滤海水中放散游孢子；捞出种海带且用300目筛绢清除黏液等杂质，用8-9℃过滤海水调节游孢子密度后，游孢子附着于育苗帘上进行培育至幼苗出库；
(3)海上分系养殖：
将步骤(2)获得的出库幼苗采用湿运法运至暂养海区，将幼苗夹于苗绳上，将苗绳挂在吊绳上后放于海区暂养；暂养至幼苗长为20±3cm时开始分苗，选取长势最好的海带幼苗夹于苗绳上，每株种海带培育的幼苗夹在一排筏架，加上标记以区分，按照海带养殖技术标准进行养成，定期测量海带的各种性状特征；
(4)海带择优选种：
在第二年对每排筏架养殖的海带按照原良种标准特征再进行严格筛选，如果性状表现统一，符合原良种标准则可作为种菜采苗；如果性状仍有分离，则选留性状最统一，特征明显的一排筏架的10-20棵海带继续进行自交培育和养殖。
上述技术方案中，步骤(1)中，所述的海带的原良种标准特征指的是叶片完整、经济性状突出、没有孢子囊出现等特征；所述的品种特征指的是长度、宽度、中带部宽、色泽、孢子囊成熟度、根部形态和耐高温等特性。
上述技术方案中，步骤(1)中，所述的海区培育的条件为：基部藻体绑到苗绳上，挂到浮筏上水深1m以下放在海区培育，培育过程中经常摆洗。
上述技术方案中，步骤(1)中，所述的分子标记分析的过程为：
①基因组DNA提取过程：
海带配子体和孢子体的基因组DNA采用Tiangen植物基因组提取试剂盒提取；
②种质鉴定过程：
A、限制性酶切及连接：在0.2ml离心管中加入：模板量250ng，2.5μl10×酶切缓冲液，2.5μl 10×T4DNA连接酶切缓冲液，5U EcoR Ⅰ，5U Mse Ⅰ，2U T4连接酶，50pmol Mse Ⅰ接头，双蒸水补至25μl；在PCR扩增仪中，设定37℃反应过夜，然后在65℃20min灭酶活，放在-20℃保存；
B、预扩增：取3μl酶切连接产物，加入75ng E+A，75ng M+C引物，15mmol/L Mg2+，25mmol/L dNTPs，1U Tag酶，3μl 10×PCR缓冲液，加双蒸水补至30μl；PCR反应参数为：94℃90s；94℃30s，56℃1min，72℃1min，30个循环；72℃10min；
C、选择性PCR扩增：取释稀后的产物3μl，加入EcoR Ⅰ选择性引物、Mse Ⅰ选择性引物各75ng，15mmol/L Mg2+，25mmol/L dNTPs，1UTag酶，3μl 10×PCR缓冲液，加双蒸水补至30μl。反应参数为：94℃90s；94℃30s，65℃1min，72℃1min，13个循环；94℃30s，56℃1min，72℃1min，25个循环；72℃5min；
D、凝胶电泳与银染：扩增产物用6％变性聚丙烯酰胺胶和1×TBE电泳缓冲液电泳分离，然后加入银染液显色；
③数据分析：
用Quantity One软件统计比较海带配子体和筛选的种海带AFLP图谱，选择与配子体图谱一致的海带单株。
上述技术方案中，步骤(2)中，所述的种海带运至育苗场，运输时间为日出前或者日落后，运输过程中保持湿润。
上述技术方案中，步骤(2)中，所述的提前处理过的育苗帘指的是：育苗帘洗涮干净、抻直，放在低温海水中浸泡预冷，单层平面式整齐的放于育苗单元中。
上述技术方案中，步骤(2)中，所述的的用过滤海水调节游孢子密度，100倍显微镜下每视野有15个-20个游动活泼的游孢子即可。
上述技术方案中，步骤(2)中，所述的游孢子附着于育苗帘上进行培育至幼苗出库，培育条件为：配子体阶段水温8-10℃、光照10-30μmolm-2s-1，每天更换总水体1/6；中间阶段水温6-8℃、光照30-80μmolm-2s-1，每天更换总水体的1/5-1/4；幼苗出库前15天，水温逐渐提高到8-12℃、光照100-120μmolm-2s-1，每天更换总水体的1/3。
上述技术方案中，步骤(4)中，所述的海带的原良种标准特征指的是叶片完整、经济性状突出、没有孢子囊出现等特征。
本发明与现有技术相比：解决了北方海带养殖区生产上海带良种混杂、退化问题，对海带原良种提纯选优。
具体实施方式
下面结合具体实施例来对本发明的方法进行具体的描述：
实施例1：“荣福”海带良种提纯
“荣福”海带是中国海洋大学培育的海带良种，于2004年获得国家良种认证，其经济性状稳定、增产效果明显、耐高温性状突出，适宜在全国各海带栽培区推广栽培，但经过10余年的养殖，在荣成俚岛发现其耐高温性状和经济性状有所退化。利用本技术对荣成俚岛养殖的“荣福”海带提纯。
一种海黍子高褐藻胶品系培育和养殖方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)海带单株选择：
2014年5月13日在海上进行单株挑选，根据叶片完整、经济性状突出、没有孢子囊出现的原良种标准特征，严格选择若干形态一致的优良单株60株。将选择的种菜单独放在固定海区暂养，并取其梢部做AFLP分子标记分析，经过筛选剩余45株；二是在7月10日在种菜暂养区，根据耐高温性状再进行一次种菜筛选，将挑选的种菜切掉梢部，保留基部藻体1.5m。处理好的15株种海带绑到苗绳上，挂到浮筏上水深1m以下，经常摆洗；
所述的分子标记分析的过程为：
①基因组DNA提取过程：
海带配子体和孢子体的基因组DNA采用Tiangen植物基因组提取试剂盒提取；
②种质鉴定过程：
A、限制性酶切及连接：在0.2ml离心管中加入：模板量250ng，2.5μl10×酶切缓冲液，2.5μl 10×T4DNA连接酶切缓冲液，5U EcoR Ⅰ，5U Mse Ⅰ，2U T4连接酶，50pmol Mse Ⅰ接头，双蒸水补至25μl；在PCR扩增仪中，设定37℃反应过夜，然后在65℃20min灭酶活，放在-20℃保存；
B、预扩增：取3μl酶切连接产物，加入75ng E+A，75ng M+C引物，15mmol/L Mg2+，25mmol/L dNTPs，1U Tag酶，3μl 10×PCR缓冲液，加双蒸水补至30μl；PCR反应参数为：94℃90s；94℃30s，56℃1min，72℃1min，30个循环；72℃10min；
C、选择性PCR扩增：取释稀后的产物3μl，加入EcoR Ⅰ选择性引物、Mse Ⅰ选择性引物各75ng，15mmol/L Mg2+，25mmol/L dNTPs，1UTag酶，3μl 10×PCR缓冲液，加双蒸水补至30μl。反应参数为：94℃90s；94℃30s，65℃1min，72℃1min，13个循环；94℃30s，56℃1min，72℃1min，25个循环；72℃5min；
D、凝胶电泳与银染：扩增产物用6％变性聚丙烯酰胺胶和1×TBE电泳缓冲液电泳分离，然后加入银染液显色；
③数据分析：
用Quantity One软件统计比较荣福海带配子体和筛选的种海带AFLP图谱，选择与配子体图谱一致的海带单株。
(2)海带单株采苗：
将具备典型原良种的15株种海带在早晨6点运输至育苗场，分别置于育苗单元中；采苗时间为8月12日，将苗帘洗刷、抻直、低温海水浸泡预冷，单层平面式整齐摆放于育苗单元中；在水温8±1℃的过滤海水中放散游孢子，种海带放散游孢子后，用筛绢清除黏液等杂质，用过滤低温海水调节游孢子密度，100倍显微镜下每视野有15个-20个游动活泼的游孢子即可；配子体阶段水温8-10℃，光照10-25μmolm-2s-1，每天更换总水体的1/6；中间阶段水温7±1℃，光照46-80μmolm-2s-1；每天更换总水体的1/5-1/4；幼苗出库前15天，水温逐渐提高到10±1℃，光照100-120μmolm-2s-1，每天更换总水体的1/3。
(3)海上分系养殖：
在10月15日将每个苗帘的幼苗用湿运法运至暂养海区，将苗绳截成每段50cm的苗绳挂在吊绳上，下端系上坠石；幼苗长到20±3cm时开始分苗，选取长势最好的海带幼苗夹于苗绳上，每株海带培育的幼苗夹一排筏架，每排筏架有苗绳60绳，每绳夹苗30株，加上红色标签区分，按照海带养殖技术标准及时调节养殖条件，每两个月测量海带的各种性状特征。
(4)海带择优选种：
在第二年对每排筏架养殖海带按照原良种标准再进行严格筛选，发现到5月底，90％的海带经济性状比养殖对比海带突出，而且边缘腐烂程度明显偏低。符合“荣福”海带原良种标准。
上述实例只是为说明本发明的技术构思以及技术特点，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明的实质所做的等效变换或修饰，都应该涵盖在本发明的保护范围之内。