本发明属于植物转化领域，具体涉及一种提高小麦幼胚基因枪瞬时转化效率的方法。
背景技术：
小麦是最后一个转化成功的重要禾谷类粮食作物，一方面由于小麦属于六倍体作物，遗传背景复杂，基因组相对较大(约17gb)，是玉米的7倍，水稻的40倍；另一方面，小麦遗传转化过程中dna导入频率低且转化后再生能力不高，有较强的基因型依赖性。自1992年成功获得第一例转基因小麦以来，人们尝试利用多种转化方法和多种外植体转化小麦，转化方法包括农杆菌、基因枪、花粉管通道、超声波法、离子束注入法、激光微束穿刺法和peg法等，外植体包括幼胚、成熟胚、花药愈伤组织和幼穗等，在降低转化的基因型依赖性、提高转化效率等方面取得了一定的进展，但普遍存在的问题是转化效率仍然很低，难以实现规模化。
本发明对提高小麦幼胚基因枪的瞬时转化方法的效率进行了探索，并建立了高效的小麦幼胚瞬时转化体系，为后续小麦功能基因组学的研究和小麦分子育种，具有重要的意义。
技术实现要素：
本发明为提高小麦幼胚的基因枪瞬时转化效率，进行了一系列的实验摸索，提供了一种提高小麦瞬时转化效率的培养方法和培养基配方。
本发明提供的提高小麦基因枪瞬时转化效率的方法，包括以下步骤:
a)幼胚取材；
b)将幼胚进行预培养处理；
c)高渗处理，将预培养后的幼胚在22℃黑暗条件下，在高渗培育基上培养4-6小时；和
d)基因枪轰击。
本发明所述的提高小麦幼胚基因枪瞬时转化效率的方法，其中所述的幼胚通过以下方法获得并进行无菌化处理，剪取大田或生长室中生长健壮、病虫害少的开花10—14天的小麦幼穗，剥取幼穗种子，用体积百分含量为75％的乙醇溶液消毒1min；无菌水冲洗3次；再用1％的硝酸银溶液灭菌15-20min；无菌水冲洗3次。在超净工作台中用解剖刀切除胚芽后剥取大小为0.8-2.0mm半透明的未成熟胚(即小麦幼胚)。
剥取的未成熟胚，预培养6-8天后，盾片朝上接种于按下述方法制备的高渗培养基上，依次排列放置在60×15mm的培养皿中央直径为2.0—3.0cm的圆形区域内，parafilm封口，22℃黑暗条件下高渗培养4-6小时。基因枪法转化是利用物理方法将外源dna导入植物细胞的方法。基因枪轰击前对受体材料进行高渗处理能够降低轰击过程对受体细胞的损伤。
本实施例中所用到的高渗培养基配方包含cacl22.99mm，kno318.79mm，nh4no320.61mm，kh2po41.25mm，mgso41.50mm，mnso41mm，znso430μm，h3bo3100μm，ki5μm，namoo41μm，cuso40.1μm，cocl60.1μm，feso4100μm，na2-edta100μm，烟酸8μm，肌醇0.56mm，盐酸硫胺素30μm，盐酸吡哆醇4.9μm，甘氨酸0.027mm，谷氨酰胺0.2mm，水解酪蛋白200mg/l，蔗糖30g/l，0.2～0.4m甘露醇，0.2m～0.4山梨醇。该配方可加入植物凝胶进行凝固，当选用的植物凝胶为4g/l的phytagel时，培育基的ph调至5.8。在121℃，20min灭菌后加入dicamba2mg/l。
在进行基因枪轰击前，金粉的处理步骤如下：
①称取30mg金粉，将其放入1.5ml离心管中，加入1ml70％乙醇，vortex3-5min；
②静置15min；
③离心约5s，弃上清；
④加入1ml无菌水，vortex1min，静置1min，离心，弃上清；
⑤再用无菌水洗2次；
⑥加入500μl无菌水重悬，终浓度为60μg/μl。
微弹的制备的步骤如下：
①可以对之前处理好的金粉先进行涡旋或超声处理，使其能均匀悬浮，浓度均一；
②吸取12.5-50μl金粉加入1.5ml离心管中，在涡旋混合器上震荡混匀；
③加入5μldna(1μg/μl)，震荡混匀；
④将50μl2.5mcacl2和20μl0.1m亚精胺先在另一离心管中混匀后加入到上述离心管中，震荡混匀(2-3min)；
⑤离心3-5s，弃上清；
⑥加入140μl70％乙醇，离心3-5s，弃上清；
⑦加入140μl无水乙醇，离心3-5s，弃上清；
⑧加入48μl无水乙醇重悬，可进行6次轰击，每次6μl。
本发明所提供的基因枪瞬时转化方法，可以使用市面上的各种基因枪进行轰击。在本发明的一种实施方式中，使用bio-red公司生产的pds1000/he基因枪，轰击压力1100psi，轰击距离6cm，真空度26-28inhg，每皿材料轰击一次。
将经基因枪轰击后的小麦幼胚继续在高渗培养基上培养16-18小时，再将其移转至愈伤诱导培养基上，盾片朝上，90×15mm每皿25粒，于24℃黑暗培养。
本发明所转化的质粒中带有荧光蛋白基因mcherry表达框作为选择标记，将暗培养24小时的幼胚愈伤放在荧光体视镜下，观察荧光，以有mcherry表达的愈伤占总愈伤数的比例作为质粒的瞬时转化效率。
实验结果表明，本发明所提供的高渗培育基，甘露醇的浓度从0.2～0.4m,山梨醇的浓度从0.2～0.4m，可以将小麦幼胚的瞬时转化效率提高至53.5％～65.4％。其中，高渗培养基中终浓度为0.3m的甘露醇+0.3m的山梨醇处理的受体材料，瞬时转化效率最高，为65.4％。说明在该浓度下，小麦幼胚的瞬时转化效率最高。
具体实施方式
实施例1、幼胚取材
剪取大田或生长室中生长健壮、病虫害少的开花10—14天的小麦幼穗，剥取幼穗种子，用体积百分含量为75％的乙醇溶液消毒1min；无菌水冲洗3次；再用1％的硝酸银溶液灭菌15-20min；无菌水冲洗3次。在超净工作台中用解剖刀切除胚芽后剥取大小为0.8-2.0mm半透明的未成熟胚(即小麦幼胚)。
实施例2、幼胚的瞬时转化
取实施例1剥取的未成熟胚，预培养6-8天后，盾片朝上接种于按下述方法制备的高渗培养基上，依次排列放置在60×15mm的培养皿中央直径为2.0—3.0cm的圆形区域内，parafilm封口，22℃黑暗条件下高渗培养4-6小时。基因枪法转化是利用物理方法将外源dna导入植物细胞的方法。基因枪轰击前对受体材料进行高渗处理能够降低轰击过程对受体细胞的损伤。
本实施例中所用到的高渗培养基配方及制备方法是：cacl22.99mm，kno318.79mm，nh4no320.61mm，kh2po41.25mm，mgso41.50mm，mnso41mm，znso430μm，h3bo3100μm，ki5μm，namoo41μm，cuso40.1μm，cocl60.1μm，feso4100μm，na2-edta100μm，烟酸8μm，肌醇0.56mm，盐酸硫胺素30μm，盐酸吡哆醇4.9μm，甘氨酸0.027mm，谷氨酰胺0.2mm，水解酪蛋白200mg/l，蔗糖30g/l，0.2～0.4m甘露醇，0.2m～0.4山梨醇，ph5.8，phytagel4g/l，121℃，20min，灭菌后加入dicamba2mg/l。
按以下步骤进行基因枪的轰击准备。
(1)金粉的处理
①称取30mg金粉，将其放入1.5ml离心管中，加入1ml70％乙醇，vortex3-5min；
②静置15min；
③离心约5s，弃上清；
④加入1ml无菌水，vortex1min，静置1min，离心，弃上清；
⑤再用无菌水洗2次；
⑥加入500μl无菌水重悬，终浓度为60μg/μl。
(2)微弹的制备
①可以对之前处理好的金粉先进行涡旋或超声处理，使其能均匀悬浮，浓度均一；
②吸取12.5-50μl金粉加入1.5ml离心管中，在涡旋混合器上震荡混匀；
③加入5μldna(1μg/μl)，震荡混匀；
④将50μl2.5mcacl2和20μl0.1m亚精胺先在另一离心管中混匀后加入到上述离心管中，震荡混匀(2-3min)；
⑤离心3-5s，弃上清；
⑥加入140μl70％乙醇，离心3-5s，弃上清；
⑦加入140μl无水乙醇，离心3-5s，弃上清；
⑧加入48μl无水乙醇重悬，可进行6次轰击，每次6μl。
(3)基因枪轰击
使用bio-red公司生产的pds1000/he基因枪，轰击压力1100psi，轰击距离6cm，真空度26-28inhg，每皿材料轰击一次。
(4)愈伤组织的诱导
经基因枪轰击后的小麦幼胚继续在高渗培养基上培养16-18小时，再将其移转至愈伤诱导培养基上，盾片朝上，90×15mm每皿25粒，于24℃黑暗培养。
(5)瞬时转化效率的统计
所转化的质粒中带有荧光蛋白基因mcherry表达框，将暗培养24小时的幼胚愈伤放在荧光体视镜下，观察荧光，以有mcherry表达的愈伤占总愈伤数的比例作为质粒的瞬时转化效率。
实施例3、瞬时转化效率的检测
由于不同受体材料适用的高渗培养基浓度和高渗处理时间有所不同，发明人将受体材料在上述培养基中不同浓度的甘露醇和山梨醇配比中质粒的瞬时转化效率进行了比较，高渗处理时间采用4-6小时，其中msv4培养基的配方是：cacl22.99mm，kno318.79mm，nh4no320.61mm，kh2po41.25mm，mgso41.50mm，mnso41mm，znso430μm，h3bo3100μm，ki5μm，namoo41μm，cuso40.1μm，cocl60.1μm，feso4100μm，na2-edta100μm，烟酸8μm，肌醇0.56mm，盐酸硫胺素30μm，盐酸吡哆醇4.9μm，甘氨酸0.027mm，谷氨酰胺0.2mm，水解酪蛋白200mg/l，蔗糖30g/l。结果如下表1所示，经0.3m甘露醇+0.3m山梨醇处理的受体材料，瞬时转化效率最高，为65.4％。说明在该浓度下，小麦幼胚的瞬时转化效率最高。
表1.不同高渗培养基处理后转化质粒的瞬时转化效率