水稻OsPRAF1基因在改良植物根系及提高镉胁迫抗性中的应用的制作方法

本发明涉及生物化学技术领域，具体涉及水稻ospraf1基因在改良植物根系以及提高植物对镉胁迫的抗性中的应用。

背景技术：

praf基因家族是植物中特有的一类基因家族，具有许多特别的结构域和特异的序列(wywialandsingh,2010)，几乎存在于所有的植物中。典型的praf蛋白具有4个结构域：两个脂结合结构域：ph结构域(血小板-白细胞c激酶底物同源结构域)和fyve(fab1,yotb,vac1andeea1)锌指结构域，存在于praf氨基端的7个rcc1(染色质凝集调控子)串联重复序列(也可被称为ats1结构域，即α微管蛋白抑制子结构域)，以及最后存在于praf蛋白羧基端的brx结构域(briggs等,2006；herasanddrobak,2002；jensen等,2001；wywialandsingh,2010)。

praf基因家族的功能目前还不是十分清楚，在拟南芥中，praf基因家族有9个成员，都具有相似的蛋白结构(vanleeuwen等,2004)。但是拟南芥中各个praf基因的突变体株系并没有明显的表型。

拟南芥中第一个克隆到的praf基因命名为praf-1，praf-1基因在花中的表达水平较高，而在其他植物组织中以较低水平表达。大肠杆菌中表达的praf-1蛋白能与肌醇单磷酸脂特异性结合(herasanddrobak,2002)。

mtzr1是苜蓿中一个典型的praf蛋白，在根分生组织以及成熟茎节的维管束组织中表达。该基因在根中的表达受到多种非生物胁迫(盐，镉，干旱、铵)的负调控。mtzr1干涉株系主根变短，茎节发育异常，其过表达株系主根变长，茎节发育异常，这些说明mtzr1参与苜蓿根系与茎节发育过程(hopkins等,2014)。

目前对于植物中praf蛋白的生物学功能报道甚少。由于praf基因家族具有ph结构域，rcc1重复结构域，fyve锌指结构域和brx结构域。现有报道中，植物中不同蛋白的ph结构域能与不同的聚磷酸肌醇(ppis)特异性结合；含有ph结构域的蛋白在胞内物质运输、信号转导过程中发挥了重要的作用。植物中的rcc1蛋白能够与染色质上组蛋白结合以及染色质结合，参与调控信号(如uvb信号、冷冻信号)以及线粒体复合体转配相关的基因的表达。此外，praf基因中的brx结构域与拟南芥中油菜素内酯合成相关的转录因子brx结构相似，并且在酵母中两者可以通过它们共有的brx结构域相互作用。因此，可以推测praf基因可能在胞内信号转导以及一系列基因表达调控方面起着重要作用。

水稻是我国的主要粮食作物，利用生物信息学分析，水稻中有5个ospraf基因，目前尚无该基因的相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供水稻ospraf1基因在植物根系改良以及提高植物抗逆性方面的应用，填补水稻ospraf基因在生物学功能研究方面的空白。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种水稻ospraf1基因植物重组表达载体，包括原始载体和插入原始载体的目的基因，所述目的基因为水稻ospraf1基因，核苷酸序列如seqidno.1所示。

所述原始载体为植物过表达载体，其中启动目的基因表达的启动子为强启动子，强启动子能够有效提高外源基因的表达，启动水稻ospraf1基因过表达，如35s。作为优选，所述原始载体为ph2gw7、pk2gw7或ph7fwg2.0。

所述重组表达载体的构建方法，包括：依据水稻ospraf1基因的cds序列以及选用载体的同源重组位点设计引物，以ospraf1基因的全长cdna克隆ak121864为模板，扩增获得基因ospraf1，将基因ospraf1克隆到植物过表达载体中，获得重组表达载体。

本发明还提供了一种ospraf1基因过表达植株的筛选方法，包括：将所述的重组表达载体转化到受体植物材料(如愈伤组织)中，培育获得转基因植株，利用pcr技术(如荧光定量pcr)筛选ospraf1基因表达倍数增加的植株即为所述ospraf1基因过表达植株。

所述受体植物为农作物，包括粮食作物和经济作物，作为优选，所述受体植物为水稻或烟草品种。

一方面，本发明提供了水稻ospraf1基因在改良植物根系中的应用。本发明研究发现，ospraf1基因过表达植株的根系表现出短根的表型，表明重组表达载体在改良植物根系中具有一定应用价值。

所述应用，包括：(1)将所述水稻ospraf1基因连入植物表达载体中，构建得到重组表达载体；(2)将所述重组表达载体转化到受体植物材料中，培育获得根系改良的转基因植株。

作为优选，所述植物表达载体为ph7fwg2。所述受体植物为水稻或烟草品种。

另一方面，本发明提供了水稻ospraf1基因在提高植物对镉胁迫的抗性中的应用。研究发现，ospraf1基因过表达植株在重金属隔胁迫的生长环境下表现出一定的抗性，表明转基因方法导入ospraf1基因过表达载体能够增加植物对cd的抗性，为水稻抗逆境提供了一种解决方法。

所述应用，包括：(1)将所述水稻ospraf1基因连入植物表达载体中，构建得到重组表达载体；(2)将所述重组表达载体转化到受体植物材料中，培育获得转基因植株；(3)在转基因植株中筛选耐镉的植株。

作为优选，所述植物表达载体为ph7fwg2.0。所述受体植物为水稻或烟草品种。

本发明具备的有益效果：

本发明构建了一种水稻ospraf1基因的植物重组表达载体，利用植物重组表达载体转基因获得ospraf1基因过表达植株，可用于分析ospraf1基因的生物学功能；本发明还提供了水稻ospraf1基因过表达植株在根系改良和抗重金属镉方面的新用途，在农业开发方面具有潜在的应用价值。

附图说明

图1为水稻ospraf1pcr结果的电泳图，m：2kplusmarker；1：pcr产物。

图2为pcr检测阳性过表达载体，m：dl2000bp；1：空载体对照；2：阳性克隆。

图3为pentr^tm/载体的图谱信息。

图4为植物表达载体ph7fwg2.0的图谱信息。

图5为ospraf1基因过表达株系表达倍数鉴定，其中a为半定量pcr结果，b为荧光定量pcr结果。

图6为重金属处理后ospraf1基因过表达株系表型分析，其中a为常规水稻营养液培育，b为含有100μmcdcl2的水稻培养液培养。

图7为重金属处理后ospraf1基因过表达株系苗主根长度比较结果，其中a为常规水稻营养液培育，b为含有100μmcdcl2的水稻培养液培养。

图8为烟草瞬时转化实验，ospraf1基因过表达载体在其亚细胞定位中的应用。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

1材料与方法

1.1实验材料

实验材料：快速琼脂糖凝胶dna回收试剂盒(codeno.cw2302)、pentr^tmdirectionalcloningkits(invitrogen公司，货号为k240020)、lriienzymemix(invitrogen公司，货号为11791100)、dh5α感受态细胞、质粒提取试剂盒。

1.2方法

1.2.1构建重组表达载体

根据tigr水稻基因注释数据库(http://rice.plantbiology.msu.edu/)获得水稻ospraf1基因全长cdna序列，根据ph7fwg2.0的同源重组位点设计引物。从日本的ricegenomeresourcecenter(http://www.rgrc.dna.affrc.go.jp)上获得了ospraf基因的全长cdna克隆ak121864，上游引物前加上同源重组位点cacc：

上游引物：5’-caccatggcagatcccgtcgatat-3’

下游引物：5’-cgctgtcatcactcaagaaatc-3’

以ak121864质粒为模板进行pcr扩增。40μl扩增体系，含2×kodbuffer20μl；2.5mmdntpmix8μl；10μmol·l^-1正、反向引物各1μl；cdna1μl；kodfx0.5μl；ddh2o8.5μl。pcr条件是：94℃预变性5分钟后，进入循环反应即98℃10s，58℃30s，72℃3min，循环数为30，最后72℃延伸7min。

pcr产物加loadingbuffer后跑电泳，割胶回收，如图1。pcr产物回收采用cwbio公司的快速琼脂糖凝胶dna回收试剂盒：

主要步骤如下：

1、使用tae缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的dna进行琼脂糖凝胶电泳。

2、将单一目的dna条带从琼脂糖凝胶中切下(尽量切除多余部分)，放入干净的离心管中，称取重量。

3、若胶块的体积过大，可将胶块切成碎块向胶块中加入3倍体积bufferpg。(如凝胶重为100mg，其体积可视为100μl)。

4、52℃孵育10分钟，其间每隔2-3分钟温和地上下颠倒离心管，以确保胶块充分溶解。如果还有未溶的胶块，可再补加一些溶胶液或继续放置几分钟，直至胶块完全溶解均匀。

5、当回收片段<500bp或>4kb时，应加入1倍胶体积的异丙醇，上下颠倒混匀(如凝胶重100mg，则加入100μl的异丙醇)。

6、柱平衡：向已装入收集管(collectiontube)中的吸附柱(spincolumndm)中加入500μlbufferps，17,900×g(～13,000rpm)离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。

7、将步骤5所得溶液加入到已装入收集管的吸附柱中，室温放置2分钟，17,900×g(～13,000rpm)离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。注意：吸附柱容积为700μl，若样品体积大于700μl可分批加入。

8、向吸附柱中加入750μlbufferpw(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)，17,900×g(～13,000rpm)离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。

9、17,900×g(～13,000rpm)离心1分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。

10、将吸附柱放到一个新的1.5ml离心管(自备)中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μlbuffereb(ph8.5)，室温放置2分钟。17,900×g(～13,000rpm)离心1分钟，收集dna溶液。-20℃保存dna。

将回收产物连接pentr^tm/载体(invitrogen公司，货号为k240020)(如图3)，25℃连接30min。

连接pentr载体的体系如下：

热击转化dh5α感受态细胞，涂布卡那霉素(kan)平板，37℃培养12小时以上，挑取单克隆，用通用测序引物m13f和m13r，通过pcr鉴定阳性克隆。引物序列如下：

m13forward：5’-gtaaaacgacggccag-3’；

m13reverse：5’-caggaaacagctatgac-3’；

提取质粒送到上海生工生物工程公司测序。

将测序正确的质粒与植物表达载体ph7fwg2.0(如图4所示)进行lr反应，将目的基因同源重组到植物表达载体ph7fwg2.0上。lr反应体系如下：

将反应产物热击转化大肠杆菌dh5α感受态细胞，涂布壮观霉素(spe)抗性的lb平板上，37℃培养12小时以上，挑选单克隆菌落，抽提质粒用pcr检测。检测引物序列如下：

ospraf1(200)-u:5’-ggatagaacaatacgaaccag-3’；

egfp(200)-l:5’-tgaagcactgcacgccgt-3’；

通过pcr检测，阳性克隆能够扩增出400bp的条带，如图2所示：m，dnamarker；1，空载体对照；2，阳性克隆。

1.2.2转基因水稻

将阳性克隆质粒电转化农杆菌eha105，涂布壮观霉素(spe)和链霉素(str)的平板，28℃培养36个小时以上。挑取单克隆，提取质粒，用特定引物pcr鉴定阳性克隆。将阳性克隆放入-80℃保存。

将已经构建好的超表达载体质粒通过电击的方法导入农杆菌eha105感受态细胞，然后运用侵染水稻愈伤的方法(hiei等，1994)将其整合到水稻基因组上。转化的水稻愈伤经过农杆菌共培养、阳性愈伤的筛选、愈伤分化出苗、小苗生根和炼苗后，通过幼苗基因组dna提取，pcr鉴定出阳性苗，移到大田繁种。

2、结果分析

2.1ospraf1基因的qrt-pcr表达分析

过表达株系t2代苗进行表型分析。过表达株系表达中ospraf1基因表达倍数通过半定量pcr以及荧光定量pcr鉴定，鉴定引物如下：

ospraf1-rt3-u：5’-ccaacacattgatggaatacg-3’；

ospraf1-rt3-l：5’-tcagatccttgcctacaagta-3’；

鉴定结果过表达株系如图5所示，相比于野生型wt，过表达株系ospraf1-o1，ospraf1-o2，ospraf1-o3株系中ospraf1基因表达倍数增加。

2.2不同处理条件下表型分析

将野生型wt与过表达株系ospraf1-o1，ospraf1-o2，ospraf1-o3分别用常规水稻营养液，含有100μmcdcl2的水稻培养液培养7天，结果如图6和图7所示。

图6(a)和图7(a)所示，常规营养液中过表达株系相比于野生型主根(prroot)长度变短。

图6(b)和图7(b)所示，用100μmcdcl2处理后，过表达株系相比于野生型主根缩短不明显(cd处理后野生型主根长度明显缩短，而过表达株系没有明显变化，同时cd处理后过表达株系主根长度与野生型主根长度比值缩小)，说明过表达株系重金属cd具有一定抗性。

2.3gus染色分析ospraf1基因表达模式

将含有ospraf1基因过表达载体以及细胞膜marker1008的农杆菌瞬时共转化烟草后，将烟草培养2天后。撕取烟草表皮组织，在激光共聚焦显微镜下观察，结果如图8所示，ospraf1基因在细胞膜以及细胞核中表达。

sequencelisting

<110>浙江大学

<120>水稻ospraf1基因在改良植物根系及提高镉胁迫抗性中的应用

<130>

<160>9

<170>patentinversion3.3

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<212>dna

<213>水稻ospraf1基因

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<210>2

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<213>人工序列

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